CN102146379B - 用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物，所述引物P1和P2的碱基序列分别以SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明所述引物对的扩增能专一性的识别小麦转化体中来源于二倍体长穗偃麦草的优质低分子量麦谷蛋白亚基基因Ee34，用于Ee34转化体的筛选，利于面粉优质基因的转化、筛选和累积，加快育种进程。

Description

用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和农业育种领域。具体涉及一对用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物序列及其在小麦转化体中的应用。

背景技术

小麦胚乳贮藏蛋白与面粉加工品质密切相关，其中谷蛋白和醇溶蛋白是主要组成部分，对面粉品质的形成起决定作用(Shewry et al.2003)。早期的研究发现1Dx5和1Dy10亚基对面包品质的贡献最大，这主要是根据亚基出现频率通过统计分析获得的结果。从20世纪90年代中期开始，小麦转基因技术逐步发展起来，分别将编码HMW-GS的1Dx5和1Dy10的基因导入小麦(Blechl and Anderson，1996)、1Dx5和1Ax1导入硬粒小麦(He et al.1999)、1Ax1导入小麦(Vasil et al.2001)，均表明使面包品质的指标有所改善。然而，目前小麦转基因技术的困难成为瓶颈。从20世纪80年代末期开始，澳大利亚等国开始研究高分子量谷蛋白亚基体外微量配粉功能检测方法，对一些亚基进行了配粉实验，分析了部分高分子量谷蛋白亚基的功能特性及其对品质的贡献(Finney，1989；Békés and Gras，1999；Peiet al.2005；裴等，2008)。通过对不同HMW-GS与烘烤品质关系的研究表明，Glu-A1编码的1和2*亚基，Glu-B1编码的7+8、17+18、13+16、14+15亚基，Glu-D1编码的5+10亚基均与面包的加工品质存在正相关关系，而以亚基5+10对烘烤品质的贡献最大(Payne andLawrence，1983；Brites and Carrillo，2001)。裴等(2008)利用微面团实验得到了基本相同的结果，说明微面团实验可以有效地用于谷蛋白基因的功能鉴定。

除了高分子量麦谷蛋白亚基外，低分子量麦谷蛋白和醇溶蛋白与品质形成的关系逐渐受到重视(Shewry et al.2003)，并且证明的确有很大关系(Shewry et al.2003；Paolaet al.2006)。由于低分子量麦谷蛋白和醇溶蛋白基因以家族的形式存在(Shewry et al.2003)，且转化技术在谷蛋白领域的不成熟等特点造成进行功能验证的困难。而利用微面团实验技术研究低分子谷蛋白亚基的结构与小麦面粉品质的关系取得较大进展(Xu et al.2006；Chen et al.2009)。醇溶蛋白单基因功能的研究报道较少，且有不同看法。现在比较一致的看法是醇溶蛋白可能与高、低分子量谷蛋白亚基一样，只有那些具备额外的(奇数)半胱氨酸残基的亚基才可能参与大面团的形成，从而影响到面粉品质(Anderson et al.2001)。在微面团实验中，单凭亚基存在与否还不能完全说明品质的变化，还应研究亚基含量和比例上的差异及其互作对烘烤品质的影响，这是今后该工作的努力方向。

利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁就是自身一部分的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的(即分子标记辅助育种技术，MAS)，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。可作为鉴别亲本亲缘关系，回交育种中数量性状和隐性性状的转移、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的辅助手段(Frederic Hospital，2009)。目前在研究贮藏蛋白基因的多态性变异以及辅助育种上，由于该类基因在序列结构方面高度相似的特点(Shewry et al.2003)，因而主要应用基因特异PCR(gene specific PCR，GS-PCR)或等位基因特异PCR(allele specificPCR，AS-PCR)方法。该方法克服了SDS(A)-PAGE电泳技术的缺陷，可在小麦的整个生育期不同部位都可以取材检测，不必破坏种子，可以快速大量的检测有关基因；能够有效的区分不同亚基基因；更重要的是，这种特异性分子标记的引物根据谷蛋白基因本身设计，与常见的其他连锁标记不同，不存在分子标记与目标基因连锁互换的问题。由上面可以看出，建立小麦储藏蛋白基因的AS-PCR技术可以进行早代品质选择、优质亚基的聚合育种以及转基因小麦的筛选(近缘禾草优质基因的转化)工作，从而加速小麦品质育种工作进程，同时也为品种鉴定和品种知识产权保护提供依据。

由于小麦本身编码低分子量谷蛋白亚基的基因位点有限，且蛋白结构特点与优质相关的基因数目有限等原因，科学家将挖掘优质低分子量谷蛋白基因的目光转向了小麦的近缘禾草。申请人近期克隆了与普通小麦不同亲缘关系的不同禾草和小麦与长穗偃麦草的体细胞杂种渐渗系的大量的低分子谷蛋白亚基基因，并初步分析了序列特点，发现了许多潜在的与面粉优质相关的基因序列；这其中包括了从二倍体长穗偃麦草中克隆的低分子量谷蛋白亚基基因Ee34，经检索关于该基因的分子标记的相关研究目前还未见报道。

发明内容

针对现有技术的需要，本发明要解决的问题是提供一对用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物序列及其在小麦转化体中的应用。

本发明所述用于筛选二倍体长穗偃麦草优质低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物碱基序列是：

P1：5’-ATACCCTTTCCACCACAACAG-3’(SEQ ID NO：1)

P2：5’-TTGCTGTTGAGATTCGACGGAG-3’(SEQ ID NO：2)

此对引物可以扩增出609bp大小的DNA片段。

上述的低分子量麦谷蛋白亚基基因Ee34的引物P1和P2进一步包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的碱基序列中碱基缺失，取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列；并且能成功扩增该引物所覆盖的该基因的目标片段。

本发明所述用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物在小麦转化体中的应用。

上述应用包括了使用该引物对结合基因组PCR策略对转移了该基因的小麦进行筛选。

发明详述

申请人克隆了二倍体长穗偃麦草中克隆的低分子量谷蛋白亚基基因Ee34并初步分析了其序列特点，发现它可能是潜在与面粉优质相关的基因序列。

进一步的，申请人采用配粉和揉面实验来检测原核表达的二倍体长穗偃麦草低分子量麦谷蛋白Ee34的功能特性。选择Ee34的原因是：一是含有7个半胱氨酸残基，其中1个可能参与分子间二硫键的形成；二是重复区较长，分子质量较大。这两个特点被认为可能对面粉品质会有正向贡献(Masci et al.1998)。三次重复实验的四项参数(揉面时间，MT；8分钟宽度，TxW；峰值时带宽，PW和峰值衰落斜率，RPS)的平均值在表1中给出。从表1中我们可以看出当LMW-GS蛋白添加到基础面粉中后面团的三项指标MT，TxW和PW显著提高而RPS则明显降低(P＜0.01)。当基础面粉中分别添加50mg非优质高分子量麦谷蛋白1Dx2与优质高分子量麦谷蛋白1Bx14作为对照时，面团的MT和PW值也有所提高且1Bx14的参数值要高于1Dx2，这与预期结果是一致的。Ee34在提高生面团特性上要优于两个高分子量蛋白对照。值得一提的是当添加Ee34为100mg时，MT、TxW和PW值有了更加显著的提高(见表1)(Chen etal.2009，Amino Acids)。

表1三次重复微面团和面实验中得到的MT、TxW、PW和RPS的平均值

注：不同大写字母表示当P＜0.01时有显著差异

基于Ee34在提高生面团特性上的优越表现，申请人进行了该基因的分子标记的设计工作以便于辅助小麦面粉优质的育种工作。

1、Ee34同源序列的检索和比对

首先用Ee34基因的编码序列在NCBI中GenBank上的BLASTn数据库中进行了序列同源性检索(图1)，根据同源性由高到低筛选了43个相似度较高的小麦低分子量谷蛋白亚基基因序列。利用DNAMAN序列比对软件进行包括Ee34在内的44个低分子量谷蛋白基因序列的同源性比对，根据它们的序列差异，将有碱基变化或者碱基的缺失和重复的位置作为基因特异引物的设计位点。

2、Ee34基因特异引物设计与特异性的检索

申请人在实验中发现，低分子量谷蛋白亚基的一个重要特点是存在高度的重复序列，而且不同物种间的保守性很高，尤其是在基因的5’和3’末端，这就给我们设计基因特异的引物增加了难度，也是低分子量谷蛋白亚基分子标记设计中的难点。利用引物设计软件PrimerPrimer，对基因Ee34中选出适合设计引物的部分首先进行总体设计(使用软件参数缺省值)，之后手工调整引物的碱基数目以达到引物对在Tm值方面的匹配(图2，3)，最后确定用于筛选二倍体长穗偃麦草优质低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的特异引物为P1(SEQ IDNO：1)和P2(SEQ ID NO：2)。将设计好的引物P1和P2分别在NCBI中GenBank上的BLASTn数据库中进行了与来自小麦的低分子量谷蛋白基因序列作进一步的同源性检索，没有发现与P1和P2同源的小麦序列。

3、引物P1和P2在不同植物材料中的基因组PCR扩增

申请人选取了50种不同的主栽小麦、小麦体细胞渐渗系和两种长穗偃麦草进行了实验，首先将其种子用75％的酒精消毒后，进行常温发芽，待3叶早期时，使用CTAB的方法提取它们的基因组DNA用于后面的PCR实验；之后将上述设计的引物P1和P2在上海生工生物公司进行引物的合成，合成的引物用于PCR扩增。本发明使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR反应，不需特殊的PCR仪和特殊的PCR试剂。PCR产物的常规琼脂糖电泳结果显示除在二倍体长穗偃麦草中有609bp特异扩增外，在十倍体长穗偃麦草中也有扩增，原因是二倍体长穗偃麦草的基因组是十倍体长穗偃麦草一个基因组的供体，另外在609bp条带的上面有一条非特异的条带，这不影响该引物在鉴定该基因和转移体(包括转化和常规杂交的转移)中该基因的检测(图4)。

4、所述引物P1和P2用于转Ee34小麦的筛选

实验采用植物真核载体pCAMBIA-3301，选择ScaI和BamHI做为酶切位点，将含有同样酶切位点的目的片段与载体进行酶切之后，进行常规的连接转化，筛选出阳性转化子(图5)。构建好的植物真核表达载体利用本实验室专利技术(ZL200410075773.2)转化小麦。以CTAB法提取转基因Ee34小麦DNA为模板，进行PCR来检测阳性植株。从PCR结果(图6)可以看出，阳性与阴性植株的结果差别十分明显，在阴性植株中没有特异和非特异条带产生。

本发明通过GenBank上的Blastn软件将相关基因序列与其它已发表的低分子量谷蛋白亚基基因进行序列比对，发现了可以设计特异引物的基因特异片段，并且通过引物设计软件和手工调整相关参数确定了用于筛选二倍体长穗偃麦草优质低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的特异引物段。通过基因组PCR技术扩增引物对之间609bp的DNA片段，测序确定扩增的正确性并通过对不同亲缘关系的小麦和禾草的扩增发现其仅针对该基因有正确的扩增。进一步用该引物对实施对通过该基因转化的小麦进行PCR筛选，获得了转基因小麦，条带测序正确。

本发明所述引物对的实施能实现专一性的识别来源于二倍体长穗偃麦草的优质低分子量麦谷蛋白亚基基因Ee34，用于Ee34转化体的筛选，利于面粉优质基因的转化、筛选和累积，加快育种进程。

附图说明

图1：Ee34同NCBI中GenBank上发布的低分子量谷蛋白基因结果。

图2：Ee34基因特异引物P1的设计。

图3：Ee34基因特异引物P2的设计。

图4：特异引物对在不同植物材料中PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

其中：1，二倍体长穗偃麦草；2，十倍体长穗偃麦草；3，济麦21；4，济南177；5，小麦渐渗系II-12；6，4072；7，中国春；8，烟361；9，山融3号；10，高肥012。

图5：Ee34基因真核表达载体的酶切验证。

其中：M，分子量标准；1，未酶切的质粒；2，ScaI+HindIII酶切验证；3，ScaI+BamHI酶切验证。

图6：本发明特异引物在转基因小麦中PCR反应琼脂糖凝胶电泳结果

其中：+，阳性对照；-，阴性对照；W，未转基因济南17对照；5、6和7，分别是转基因阳性株系1的旗叶、幼穗和种子；10，转基因株系2；12，转基因株系3；1、2、3、4、8、9、11、13和14为转基因阴性植株。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围不受所述实施例的限制。

实施例1Ee34同源序列的检索和比对

首先用Ee34基因的编码序列在NCBI中GenBank上的BLASTn数据库中进行了序列同源性检索(图1)，根据同源性由高到低筛选了43个相似度较高的小麦低分子量谷蛋白亚基基因序列。

利用DNAMAN序列比对软件进行了包括Ee34在内的44个低分子量谷蛋白基因序列的同源性比对，根据它们的序列差异，将有碱基变化或者碱基的缺失和重复的位置作为基因特异引物的设计位点。

实施例2Ee34基因特异引物设计与特异性的检索

利用引物设计软件PrimerPrimer，对基因Ee34中选出适合设计引物的部分首先进行总体设计(使用软件参数缺省值)，之后手工调整引物的碱基数目以达到引物对在Tm值方面的匹配(图2，3)，最后确定用于筛选二倍体长穗偃麦草优质低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的特异引物为P1：5’-ATACCCTTTCCACCACAACAG-3’(SEQ ID NO：1)和P2：5’-TTTGCTGTTGAGATTCGACGGAG-3’(SEQ ID NO：2)。

将设计好的引物P1和P2分别在NCBI中GenBank上的BLASTn数据库中进行了与来自小麦的低分子量谷蛋白基因序列作进一步的同源性检索，没有发现与P1和P2同源的小麦序列。

实施例3引物P1和P2在不同植物材料中的基因组PCR扩增

选取了50种不同的材料(如主栽小麦、小麦体细胞渐渗系和禾草)进行实验，先将它们的种子用75％的酒精消毒后，进行常温发芽，待3叶早期时，使用通用的CTAB的方法提取它们的基因组DNA用于后面的PCR实验。

将引物P1：5’-ATACCCTTTCCACCACAACAG-3’和P2：5’-TTGCTGTTGAGATTCGACGGAG-3’在上海生工生物公司进行引物的合成，合成的引物用于PCR扩增。聚合酶链式扩增体系为常规PCR反应，不需特殊的PCR仪和特殊的PCR试剂。

PCR反应体系条件如下：

模板DNA             100ng

dNTPs(10mM each)    0.2μl

10X PCR buffer      10μl

引物P1(100μM)      1μl

引物P2(100μM)      1μl

LA GC Taq           0.1μl

ddH₂O               加至终体积20μl

加2滴石蜡油封顶，然后进行下列反应。

PCR反应程序：95℃预变性  5min

最后在72℃延伸7min

PCR产物的常规琼脂糖电泳结果显示除在二倍体长穗偃麦草中有特异扩增外，在十倍体长穗偃麦草中也有扩增，原因是二倍体长穗偃麦草的基因组是十倍体长穗偃麦草一个基因组的供体，另外在609bp条带的上面有一条非特异的条带，这不影响该引物在鉴定该基因和转移体(包括转化和常规杂交的转移)中该基因的检测，在其他小麦品种中均无扩增(图4)。

实施例4本发明所述引物对(P1和P2)用于转Ee34小麦的筛选

(I)Ee34真核表达载体的构建

实验采用植物真核载体pCAMBIA-3301，选择ScaI和BamHI做为酶切位点，将含有同样酶切位点的目的片段与载体进行酶切之后进行了常规的连接转化后，阳性转化子的筛选选择两对不同切点的酶切位点进行验证，分别是ScaI和BamHI、ScaI和HindIII(基因内酶切位点)(图5)。

(II)Ee34真核表达载体转化小麦

将验证为阳性的质粒用标准的分子生物学方法转化入农杆菌，准备用于小麦的转化。小麦种子消毒的步骤为：

(1)将小麦种子用75％乙醇浸泡30s，除去75％乙醇；

(2)用无菌水洗2-3次，每次洗3min；

(3)用0.1％的升汞浸泡10min，除去升汞；

(4)用无菌水洗5-6次，每次3min。

小麦种子的萌发与春化步骤为：

(1)把灭好菌的种子在无菌水中浸泡(水不要太多)过夜，待种子露白；

(2)把露白的种子摆放于事先灭过菌、铺有滤纸的培养皿中；

(3)将盛有摆好种子的培养皿放入4℃冰箱，30天以上春化，中间适度浇水；

(4)待芽长至3cm左右即可切割。

转化小麦所需农杆菌的调配方法：

(1)视春化种子芽的生长情况，提前将含有转化质粒的农杆菌活化2次，当第二次活化至OD600达1.2时调菌；

(2)取1ml活化至OD600达1.2的农杆菌菌液，10000rpm离心30sec，用微量移液器吸出上清，加入乙酰丁香酮(AS)使其终浓度为200μM，加入无菌水10ml，放置于冰上备用。切苗和农杆菌转化：

(1)将胚芽鞘长至1-3cm左右的小麦幼苗从根部开始下刀，缓慢向下切割，将胚芽鞘内的生长点切出暴露出来；

(2)带有针头的微量移液器吸4μl已经调好的菌液，滴于暴露出来的生长点处；

(3)将滴上菌液的小麦幼苗置于灭过菌的培养皿中，室温或28℃培养至小麦健壮后，栽于土壤(纸杯)中培养。

(III)转Ee34小麦的检测

待转基因小苗长到三叶期，比较健壮的时候，用CTAB法提取叶片DNA，进行转基因阳性植株的PCR初步筛选。

药品配方：

(1)CTAB提取液：

NaCl         1.4M

CTAB(w/v)    2％

Tris·HCl    100mM

EDTA         20mM

巯基乙醇     0.2％

注：除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇。

(2)氯仿/异戊醇：氯仿24∶异戊醇1

(3)酚/氯仿/异戊醇：酚25∶氯仿24∶异戊醇1

(4)TE缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.4)；1mM EDTA

(5)RNase：将RNase溶在1.5mM NaCl、10mM Tris-HCl的溶液中，终浓度为5mg/ml，沸水中水浴15min，冷却至室温后分装在1.5ml离心管中-20℃保存。

DNA提取步骤：

(1)将CTAB提取液60-65℃水浴中加热；

(2)取200mg左右幼嫩的叶片，加入液氮后研磨成粉末备用；

(3)用在液氮中预冷过的药匙将叶片粉末转入同样预冷的2ml离心管中加入650μlCTAB提取液后迅速上下颠倒混匀；

(4)置于60℃-65℃水浴中30-45min，每五分钟上下颠倒数次；

(5)加入650μl的酚/氯仿/异戊醇，随后颠倒混合，使蛋白质等杂质变性；

(6)25℃下12000rpm离心15min；

(7)将上清液转移到新离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，注意不要吸到中间的蛋白质层；

(8)12000rpm离心10min之后将上清液转移到新的离心管中；

(9)加入与上清液等体积异丙醇，并上下翻转混匀，此时会看到DNA絮状沉淀；

(10)用玻璃棒将DNA沉淀挑出，转移到1.5ml离心管中，加入500μl70％酒精，洗去DNA中的色素以及其他杂质；

(11)12000rpm离心3min，倒出离心管中的酒精，重复上一步操作一次后真空抽干仪干燥，向管中加入约100μlTE缓冲液将DNA溶解；

(12)DNA溶解后，向其中加入RNase至终浓度50-70μg/ml，混匀，37℃水浴30min。溶解后的DNA取部分稀释至100ng/μl备用。

提取的DNA用实施例3中所述的PCR体系和条件进行PCR扩增，扩增后使用1％琼脂糖电泳检测，电泳检测的条件为常规的分子生物学参数。

结果显示此对引物在转基因小麦部分植株中可以扩增得到目的条带(图6)，经测序显示是本发明所述的转基因本身序列。

Claims (1)

1.一种用于筛选二倍体长穗偃麦草低分子量谷蛋白亚基基因Ee34的引物，其特征在于：所述引物碱基序列是：

P1：5’-ATACCCTTTCCACCACAACAG-3’

P2：5’-TTGCTGTTGAGATTCGACGGAG-3’。

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