CN109777884B - 沙融山羊草1Ssh染色体特异分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记及其应用，其可分别由SEQ ID NO.1‑8所示的4对引物扩增得到。利用该引物进行PCR反应能够快速准确地检测沙融山羊草1S^sh染色体，从而判断小麦‑沙融山羊草远缘杂交后代中是否存在外源染色体1S^sh。本方法能够准确检测出小麦与沙融山羊草远缘杂交中沙融山羊草1S^sh染色体转移与存在，方便跟踪该外源染色体1S^sh，大大提高育种工作效率，加快小麦品质育种的进程，在小麦的杂交育种领域具有良好的应用前景，能够快速鉴定出小麦‑沙融山羊草后代中1S^sh附加系、易位系，特别是1AL/1S^shL、1AS/1S^shL的选育。

Description

沙融山羊草1Ssh染色体特异分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域和作物遗传育种学领域，特别是涉及沙融山羊草1S^sh染色体的特异分子标记，以及在小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中追踪外源1S^sh染色体的分子标记及其应用，本发明还涉及利用该分子标记进行小麦-沙融山羊草远缘杂交后代杂种的鉴定及品种(系)的选育。

背景技术

小麦近缘物种中具有许多栽培小麦种所欠缺的优良基因资源，因此经常被用来进行小麦的遗传改良。山羊草属(Aegilops)为六倍体小麦的形成贡献了两组染色体(B组和D组染色体)，是与小麦属亲缘关系较近的近缘属。山羊草属中的沙融山羊草(Aegilopssharonensis, 2n＝14,S^shS^sh)是小麦的近缘物种之一(小麦二级基因库的成员)，具有非常丰富的抗盐、抗旱、抗条锈病、抗叶锈病及品质基因，常被用来作为亲本通过远缘杂交的方式对普通小麦进行遗传改良。例如位于沙融山羊草1S^sh和5S^sh染色体上的Sr-1644-1Sh和Sr-1644-5Sh基因对于小麦茎锈病具有很好的抗性，位于4S^sh染色体上的Gc2基因也被证实具有杀死配子的作用，以及还有早年发现位于6S^sh上能够抗叶锈和条锈病的Lr56和Yr38基因。

值得注意的是，沙融山羊草1S^sh染色体上不仅仅具有抗茎锈病基因Sr-1644-1Sh，而且1S^sh长臂上还被发现具有分子量巨大的高分子量谷蛋白x-型(1S^shx2.9)和y-型(1S^shy2.3)亚基。1S^shx2.9具有较长的重复区，根据小麦品质研究的结果，该基因具有优质亚基的结构特征，是小麦品质改良的优质基因源。因此，将沙融山羊草中的高分子量谷蛋白亚基转移到普通小麦中，将对普通小麦的品质改良产生重要的正效应。

在小麦遗传改良中，又特别是培育新的小麦品种中，通常采用杂交的手段将控制基因导入到目标株系中，进而改变小麦的遗传组成，从而起到有效的改良。小麦杂交技术中的远缘杂交手段，从上个世纪三十年代起被人们广泛实践，并取得了巨大成果。虽然远缘杂交能够将沙融山羊草中的有利外源谷蛋白基因导入到普通小麦中，但是在导入有利基因过程中也会将其它不利性状导入普通小麦中，因而限制了杂交后代的利用。虽然很难将远缘杂交产生异附加系和异代换系直接利用于生产，但是易位系能够避免或者减少不利基因的导入影响。因此，易位系在小麦育种工程中占有及其重要的地位。

现今，对于染色体易位的鉴定已经从细胞水平和生化检测发展到分子水平检测。传统上主要利用细胞来检测易位系，包括有C-带和 N-带技术。上个世纪七十年代后发展的GISH和FISH技术也被广泛用于鉴定染色体易位。C-带和N-带检测虽然快速、经济，但是它们都具有非常致命的局限性，即它识别的区域片段必须具有明显的带型特征，如果带纹不明显或者没有带型，则它很可能不明显或者不能显示。GISH和FISH虽然能够较为清楚的显示易位情况，然而它的实验操作及备制极容易影响到实验结果的精确度，特别是探针的备制需要有很长且特异的寡序列，现今能够识别沙融山羊草染色体的探针现在还没有开发出来。因此，在连续实施杂交选育新品种(系)材料的过程中有必要建立一种简单、高效、快速的检测小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中含有沙融山羊草谷蛋白亚基基因染色体易位的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供沙融山羊草1S^sh染色体特异的分子标记及其应用。

基于上述目的，本发明根据已公布的小麦中国春(CS)序列数据和山羊草属序列数据为基础，从中国春数据库ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-31/fasta/triticum_aestivu m/中提取第一同源染色体上全部基因序列，从山羊草属序列数据库 https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/TGAC_WGS_assemblies_o f_other_wheat_species/中提取全部山羊草属全部序列。建立1A、1B 和1D序列数据库和山羊草序列数据库，通过锚定普通小麦1A、1B 和1D染色体上高分子量谷蛋白基因所在位置，以高分子量谷蛋白基因位置为起点，以大概10cM间距取上下游的基因序列，同时比对山羊草数据库序列调取对应的山羊草序列。运用DNAMAN 6.0软件对提取的1A、1B、1D及山羊草基因序列进行序列比对分析，提取特异于山羊草序列位点17个。

同时，根据Primer Premier 5.0软件分析结果，在位于这17个特异序列处设计了17对包含特异位点的检测沙融山羊草的特异性引物。经过后续验证，这17对特异引物中有4对能够特异的识别沙融山羊草染色体1S^sh，2对特异引物识别1S^sh上臂，2对特异引物识别1S^sh短臂。因此本发明提供了小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中染色体 1S^sh的分子标记4对，其由下列引物对经PCR扩增获得。

本发明提供的沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记，其由以下任一对特异性引物对经PCR扩增得到：

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’。

本发明的特异分子标记可用于筛选含有沙融山羊草1S^sh染色体长、短臂的小麦-沙融山羊草远缘杂交杂种。

本发明提供了用于检测沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记的引物对，其为如下任一对特异性引物对：

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’。

本发明还提供了含有上述任一或多对特异性引物对的试剂盒。

本发明提供了上述沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记、上述的引物对或含有该引物对的试剂盒在检测小麦-沙融山羊草远缘杂交后代中沙融山羊草1S^sh染色体中的应用。

本发明提供了上述沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记、上述的引物对或含有该引物对的试剂盒在小麦杂交鉴定中的应用。

本发明提供了上述沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记、上述的引物对或含有该引物对的试剂盒在小麦杂种选育或小麦种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记、上述的引物对或含有该引物对的试剂盒在鉴定出小麦-沙融山羊草后代中 1S^sh附加系、易位系中的应用。

进一步，本发明提供一种检测小麦远缘杂交后代中沙融山羊草 1S^sh染色体的方法，用前述的4对引物的任一对进行PCR方法扩增待检杂交小麦基因组DNA，

如果用1S^sh的长臂引物1S^shL2F₁2R₁或1S^shL16F₁16R₁能够扩增出1200bp或者673bp的扩增片段，则说明该待检小麦存在沙融山羊草染色体1Ssh的长臂；

如果用1S^sh的短臂引物1S^shS5F₂5R₂或1S^shS30F₁30R₁能够扩增出600bp或者1421bp的扩增片段，则说明该待检小麦存在沙融山羊草染色体1S^sh的短臂。

进一步地，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～95℃，5～8 min；94～95℃变性30～50s，60～68℃退火30～50s，71～73℃延伸40～75s，共30～35个循环；终延伸71～74℃8～10min。

优选地，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性45s，退火35s，72℃延伸，共35个循环；终延伸72℃10min；其中：

引物1S^shL2F₁2R₁退火温度64℃，72℃延伸时间65s；

1S^shL16F₁16R₁退火温度65℃，72℃延伸时间45s；

1S^shS5F₂5R₂退火温度67℃，72℃延伸时间45s；

1S^shS30F₁30R₁退火温度63℃，72℃延伸时间70s。

本发明所开发的沙融山羊草1S^sh染色体长、短臂的特异性引物，直接对杂交后代材料进行目的片段的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代是否具有沙融山羊草1S^sh染色体做出判断，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测1S^sh染色体转移与存在，并且鉴定方法简单，结果可靠，弥补了细胞学鉴定的繁琐等不足，这对通过远缘杂交育种来改良普通小麦来说将是一种很好的辅助育种手段。利用本发明的鉴定方法，将使后续研究更具目的性与针对性，以便后续选育小麦-沙融山羊草附加系、易位系，特别是1AL/1S^shL、 1AS/1S^shL的选育。

附图说明

图1为山羊草染色体片段序列图谱。

图2为普通小麦1A染色体图谱。

图3为普通小麦1B染色体图谱。

图4为普通小麦1D染色体图谱。

图5为利用4对特异引物对材料(Aesh、Z636、Z636、L3、CN16) 扩增图。Maker3为DNAMaker3(由下往上条带大小依次为：200、 500、800、1200、2000、3000、4500bp)，Aesh为沙融山羊草(杂交父本)，Z636、Z606为四倍体硬粒小麦(杂交母本)，L3和CN16为普通小麦(回交父本)。a为特异引物1S^shL2F₁2R₁的扩增图；b为特异引物1S^shL16F₁16R₁的扩增图；c为特异引物1S^shS5F₂5R₂的扩增图； d为特异引物1S^shS30F₁30R₁的扩增图。

图6为利用4对特异引物对66-9-17和108-23-21材料扩增图(其中Aesh为该杂交材料的父本、Z636为该杂交材料母本、L3为该杂交材料回交父本)。Maker2为DNA Maker2(由下往上条带大小依次为：100、300、500、700、9000、1200bp)。a为特异引物1S^shL2F₁2R₁的扩增图；b为特异引物1S^shL16F₁16R₁的扩增图；c为特异引物 1S^shS5F₂5R₂的扩增图；d为特异引物1S^shS30F₁30R₁的扩增图。

图7为验证66-9-17和108-23-21的ND-FISH图。1S^sh所示为沙融山羊草染色体1S^sh。a为66-9-17ND-FISH；b为108-23-21ND-FISH。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所使用的二倍体沙融山羊草(Aesh)，四倍体硬粒小麦Z636、Z606，六倍体小麦良麦3号(L3)、川农16(CN16) 和中国春(CS)，小麦-沙融山羊草杂交衍生后代，均可从四川农业大学小麦研究所得到。本发明所用生化试剂均为市售。

实施例1沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记及其检测引物的确定

根据已公布的六倍体普通小麦中国春(CS)序列数据和山羊草属序列数据为基础，从中国春现有的基因序列数据库 ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-31/fasta/triticum_aestivu m/中提取第一同源染色体上全部基因序列，从山羊草属序列数据库 https://urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/TGAC_WGS_assemblies_of_other_wheat_species/中提取全部山羊草属全部序列。首先将获得的 1A、1B和1D所有基因序列建立顺序数据库，锚定普通小麦1A、1B 和1D染色体上高分子量谷蛋白基因在本数据库的位置，以高分子量谷蛋白基因位置为起点，以大概10cM间距取上下游的基因序列。与此同时将获得的山羊草序列建立山羊草数据库。以1A上的基因序列作为基点拾得10cM等距基因序列，分别从1B、1D和山羊草序列库中调取与该序列同源性序列(见图1-图4)。山羊草和普通1A、1B、 1D所提取的基因位置具有位置上的共线性，图中1S^shL2F₁2R₁和 1S^shL16F₁16R₁，1S^shS5F₂5R₂和1S^shS30F₁30R₁表示该标记所在位置， 1S^shL2F₁2R₁和1S^shL16F₁16R₁位于染色体长臂，1S^shS5F₂5R₂和 1S^shS30F₁30R₁位于染色体短臂。运用DNAMAN 6.0软件对提取的1A、 1B、1D及山羊草基因序列进行序列比对分析，找出特异于山羊草序列位点。同时，根据PrimerPremier 5.0软件分析结果，在位于特异序列处设计的检测沙融山羊草染色体1S^sh的特异性引物4对，其中1S^shL2F₁2R₁和1S^shL16F₁16R₁能够特异识别1S^sh染色体长臂， 1S^shS5F₂5R₂和1S^shS30F₁30R₁能够特异识别1S^sh染色体短臂，引物序列如下。

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’(SEQ ID NO.2)

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’(SEQ ID NO.4)

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’(SEQ ID NO.6)

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’(SEQ ID NO.7)

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’(SEQ ID NO.8)。

1S^shL2F₁2R₁和1S^shL16F₁16R₁，1S^shS5F₂5R₂和1S^shS30F₁30R₁预期扩增产物大小分别为1200bp、673bp、600bp和1421bp的片段。本发明的分子标记可用于鉴定沙融山羊草1S^sh染色体，本发明设计的特异性4对引物可用于PCR扩增该上述用于鉴定沙融山羊草1S^sh染色体的分子标记。

实施例2沙融山羊草1S^sh染色体分子标记检测方法的建立

本发明所用小麦材料均由四川农业大学小麦研究所提供，包括二倍体沙融山羊草(Aesh)，四倍体硬粒小麦Z636、Z606，六倍体小麦良麦3号(L3)、川农16(CN16)和中国春(CS)，小麦-沙融山羊草杂交衍生后代。其中麦-沙融山羊草杂交衍生后代为已经杂交成功并加代后的现有材料，包括一份SDS-PAGE鉴定出具有外源1S^sh上高分子量谷蛋白1S^shx2.9和1S^shy2.3的材料66-9-17和一份不含有高分子量谷蛋白1S^shx2.9和1S^shy2.3的杂交后代108-23-21。

1、基因组DNA提取

将材料种植于田间，待生长茂盛时取叶片进行基因组DNA提取。提取方法采用CTAB法，提取步骤如下：

a)将检测的杂交种子种植，植株长大后取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl； 0.1M Tris-HCl，pH＝8.0；0.1M EDTA，pH＝8.0；使用前加2％β-巯基乙醇)15ml，混匀。

b)65℃水浴40min，其间轻摇混匀。

c)冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000r/min离心10min。

d)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴中沉淀DNA。

e)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次，吹干DNA，溶于适量pH＝8.0的1×TE溶液中。

f)琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

2、PCR特异性扩增

采用实施例1的4个引物对分别对上述各种子的基因组进行PCR 扩增。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

其中引物1S^shL2F₁2R₁64℃退火，65s延伸；1S^shL16F₁16R₁65℃退火，45s延伸；1S^shS5F₂5R₂67℃退火，45s延伸；1S^shS30F₁30R₁63℃退火，70s延伸。1S^shL2F₁2R₁和1S^shL16F₁16R₁，1S^shS5F₂5R₂和 1S^shS30F₁30R₁扩增产物大小分别为1200bp、673bp、600bp和1421bp 的片段(见图5)。表明利用4对引物在普通小麦良麦3号、川农16、中国春，四倍体小麦Z636、Z606及沙融山羊草Aesh是能够特异于沙融山羊草Aesh的。说明本发明建立的检测沙融山羊草1S^sh染色体的方法是准确、可靠。

实施例3检测小麦-沙融山羊草远缘杂交后代中沙融山羊草染色体 1S^sh引物的特异性验证

为确保本发明所开发的引物能够真正检测到沙融山羊草1S^sh染色体转移与存在，有必要对引物的正确性及特异性进行验证。

(1)小麦-沙融山羊草远缘杂交后代特异引物验证

按照实施例2中的植物基因组DNA提取方法及PCR扩增方法，提取四倍体小麦Z636，普通小麦良麦3号，沙融山羊草Aesh，小麦- 沙融山羊草远缘杂交后代66-9-17和108-23-21的基因组DNA，并利用实施例1所设计的4对引物分别进行PCR扩增检测，扩增检测方法同实施例2。

扩增结果见图6，由图可以看出，本发明的4对引物只能在沙融山羊草(Aesh)及具有外源1S^sh上高分子量谷蛋白1S^shx2.9和1S^shy2.3 的材料66-9-17中扩增出目的条带，而在其他材料四倍体小麦和普通小麦品种及不含外源1S^sh上高分子量谷蛋白1S^shx2.9和1S^shy2.3的材料108-23-21中没有扩增出任何条带(这表明6-9-17中具有外源1S^sh染色体，108-23-21不具有外源1S^sh染色体)，因此进一步表明，本发明实施例1所开发的检测沙融山羊草染色体1S^sh的4对特异性引物对的特异性良好，达到100％特异，能够在小麦育种中进行应用。由此说明，利用本发明提供的引物能够准确跟踪并检测出含有沙融山羊草染色体1S^sh转的小麦杂种，从而有利于提高小麦育种效率。

(2)小麦-沙融山羊草远缘杂交后代具体染色体1S^shFISH验证

为进一步确定上述实验(1)中4对特异分子标记所得到的结果：小麦-沙融山羊草杂交后代66-9-17中具有外源染色体1S^sh，108-23-21 不具有外源染色体1S^sh。因此有必要对66-9-17进行FISH验证是否具有外源染色体1S^sh。

ND-FISH方法步骤：

a)将检测后的66-9-17和108-23-21种子放置于湿润的培养皿中，于22℃的培养箱中培养发根至3-5cm并取根尖，将取下的根尖装入 0.5ml离心管并置于笑气(N₂O)中处理2h，取出根尖加入适量的90％醋酸，放于冰水混合物上固定10-15min后用蒸馏水洗净。

b)将上步中预处理的根尖进行切取根尖乳白色部位并放入酶液 (2％纤维素酶和1％的果胶酶混合液)中37℃水浴55min，酶解后的根尖用70％的酒精洗三到四次，剩下约50μl70％的酒精，用电动组织研磨器将根尖磨碎；3000r/min离心2min，将酒精倒掉；加入20～55μl冰醋酸；取8μl细胞悬液滴在载玻片上，晾干；在相差显微镜下观察。

c)使用简单重复序列探针(AAG)、寡核苷酸探针 Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1配制的杂交液(向适量的探针中加入2×SSC和1×TE Buffer(pH＝7.0))对所用实验材料进行 ND-FISH分析，最后用抗褪色剂DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 进行染色体复染(蓝色)，用OLYMPUSBX51荧光显微镜观察照相。

ND-FISH验证结果见图7。由图7的a图可看出，在实验(1) 中能够特异扩增出4对染色体1S^sh条带即具有沙融山羊草染色体1S^sh的66-9-17，在ND-FISH也显示具有染色体1S^sh；由图7的b图可看出，在实验(1)中不能够特异扩增出4对染色体1S^sh条带即不具有沙融山羊草染色体1S^sh的108-23-21，在ND-FISH显示也不具有染色体1S^sh。由此可见，本发明提供的4对特异引物1S^shL2F₁2R₁和 1S^shL16F₁16R₁，1S^shS5F₂5R₂和1S^shS30F₁30R₁的所检测的结果符合ND-FISH结果，这进一步证明了4对特异引物的准确可靠信。

综上，4对特异于沙融山羊草外源1S^sh染色体引物鉴定出的 66-9-17中具有外源染色体1S^sh，而108-23-21不具外源染色体1S^sh这样的结果不仅能够和前期材料SDS-PAGE结果想呼应，也能够和实施例3中的ND-FISH结果想呼应。这都说明了本发明设计的4对特异于外源染色体1S^sh引物能够准确有效的快速识别外源染色体1S^sh是否存在，更能将这4对特异引物进行筛选大量的小麦-沙融山羊草后代中1S^sh附加系、易位系，特别是1AL/1S^shL、1AS/1S^shL的选育。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 沙融山羊草1Ssh染色体特异分子标记及其应用

<130> KHP191110757.2

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattggagat tcatgcaaag ccg 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcaactctg aacttatgtt at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaaagtggg cgatgtcaag 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cataactgaa ccctggcaac tgc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtaacagc agtctcattg gt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactgaccag gcattcccag 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggaagccaa agatttatga t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgcctgacc ctcccgtaga c 21

Claims (9)

1.沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记，其特征在于，其由以下任一对特异性引物对经PCR扩增得到：

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’。

2.用于检测沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记的引物对，其特征在于，其为如下任一对特异性引物对：

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’。

3.含有以下任一或多对特异性引物对的试剂盒，所述特异性引物对为：

1S^sh长臂1S^shL2F₁2R₁：

上游引物，5’-AATTGGAGATTCATGCAAAGCCG-3’

下游引物，5’-CGCAACTCTGAACTTATGTTAT-3’

1S^sh长臂1S^shL16F₁16R₁：

上游引物，5’-GGAAAGTGGGCGATGTCAAG-3’

下游引物，5’-CATAACTGAACCCTGGCAACTGC-3’

1S^sh短臂1S^shS5F₂5R₂：

上游引物，5’-GTGTAACAGCAGTCTCATTGGT-3’

下游引物，5’-TACTGACCAGGCATTCCCAG-3’

1S^sh短臂1S^shS30F₁30R₁：

上游引物，5’-GGGAAGCCAAAGATTTATGAT-3’

下游引物，5’-ATGCCTGACCCTCCCGTAGAC-3’。

4.权利要求1所述的沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在检测小麦-沙融山羊草远缘杂交后代中沙融山羊草1S^sh染色体中的应用。

5.权利要求1所述的沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在小麦-沙融山羊草杂交鉴定或小麦-沙融山羊草杂种选育或小麦-沙融山羊草杂交种的种质资源改良中的应用。

6.权利要求1所述的沙融山羊草1S^sh染色体特异分子标记或权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在鉴定出小麦-沙融山羊草后代中1S^sh附加系、易位系中的应用。

7.一种检测小麦远缘杂交后代中沙融山羊草1S^sh染色体的方法，其特征在于，用权利要求2所述的引物对进行PCR方法扩增待检杂交小麦基因组DNA，

如果用1S^sh的长臂引物1S^shL2F₁2R₁或1S^shL16F₁16R₁能够扩增出1200bp或者673bp的扩增片段，则说明该待检小麦存在沙融山羊草染色体1S^sh的长臂；

如果用1S^sh的短臂引物1S^shS5F₂5R₂或1S^shS30F₁30R₁能够扩增出600bp或者1421bp的扩增片段，则说明该待检小麦存在沙融山羊草染色体1S^sh的短臂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～95℃，5～8min；94～95℃变性30～50s，60～68℃退火30～50s，71～73℃延伸40～75s，共30～35个循环；终延伸71～74℃8～10min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性45s，退火35s，72℃延伸，共35个循环；终延伸72℃10min；其中：

引物1S^shL2F₁2R₁退火温度64℃，72℃延伸时间65s；

1S^shL16F₁16R₁退火温度65℃，72℃延伸时间45s；

1S^shS5F₂5R₂退火温度67℃，72℃延伸时间45s；

1S^shS30F₁30R₁退火温度63℃，72℃延伸时间70s。

Images