CN102617717A - 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白0sGPA3及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的植物谷蛋白分选相关蛋白影响植物胚乳中谷蛋白前体的分选。将所述蛋白的编码基因导入谷蛋白分选异常的植物中，可以培育谷蛋白分选正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用。 

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。杂交稻的成功应用在很大程度上解决了世界人口剧增带来的吃饭问题，但随着人们生活水平的不断提高，培育高品质、高营养以及各类功能性水稻正在成为迫在眉睫的问题。水稻种子贮藏蛋白作为稻米中的第二大营养物质，在很大程度上决定了稻米的营养价值。因此对其合成转运途径的深入研究，将有助于我们通过基因工程的手段对稻米进行改良。 

水稻谷蛋白首先以57kDa前体的形式，在内质网中合成，在分子伴侣的协助下正确折叠，之后输出内质网，进入高尔基体后，经过翻译后修饰，出芽形成囊泡，这些电子致密的囊泡会与水稻胚乳中的蛋白贮藏液泡融合，形成。水稻谷蛋白进入蛋白贮藏液泡之后，经过液泡加工酶的切割形成成熟的酸碱亚基，最终以这种成熟形式贮存其中。蛋白体II中的谷蛋白可以被人体消化吸收，为稻米中主要的蛋白质来源。 

上述谷蛋白分选加工的过程是一个极其复杂的生物学过程。水稻谷蛋白57H突变体无疑是研究水稻贮藏蛋白分选的优良材料，目前已报道了几个57H突变体，但其中大多数尚未被克隆，因此，贮藏蛋白分选的确切机理尚不明确。 

Kelch类蛋白在生物体中发挥重要功能，目前尚无报道关于kelch蛋白参与贮藏蛋白分选的研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。 

本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白(OsGPA3)，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.白丰B)，是如下(a)或(b)的蛋白质： 

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与 谷蛋白分选相关的由序列2衍生的蛋白质。 

序列表中的序列1由501个氨基酸残基组成，自氨基末端第27至177位为kelch结构域。 

为了使(a)中的OsGPA3便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 

表1标签的序列 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsGPA3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsGPA3的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因(OsGPA3)也属于本发明的保护范围。 

所述基因OsGPA3可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子： 

1)序列表中序列2所示的DNA分子； 

2)序列表中序列3所示的DNA分子； 

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。 

序列表中的序列2由1503个核苷酸组成。 

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。 

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或 基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)的多克隆位点SmaI之间重组插入所述基因(OsGPA3)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-OsGPA3；所述pCAMBIA1305.1-OsGPA3是将由OsGPA3基因组编码序列连同上游2724bp的启动子区和下游3138bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点SmaI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。 

将含有OsGPA3的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsGPA3。 

含有以上任一所述基因(OsGPA3)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。 

扩增所述基因(OsGPA3)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

本发明的另一个目的是提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法。 

本发明提供的培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能 被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为Q25。 

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。 

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。 

本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。 

附图说明

图1为突变基因在第3染色体上的精细定位。 

图2为野生型白丰B和突变体Q25的籽粒扫描电镜观察。 

图3为野生型白丰B和突变体Q25胚乳贮藏蛋白SDS-PAGE分析。 

图4为野生型白丰B和突变体Q25胚乳细胞形态比较。 

图5为野生型白丰B和突变体Q25透射电镜分析。 

图6为野生型白丰B和突变体Q25贮藏蛋白免疫荧光分析。 

图7为转基因植株分子检测结果。 

图8为转pCAMBIA1305.1-OsGPA3的T₀代植株的T₁籽粒表型。 

图9为转pCAMBIA1305.1-OsGPA3的T₀代植株的T₁籽粒SDS-PAGE表型。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 

实施例1、植物谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现 

一、水稻谷蛋白分选突变体Q25表型分析及其遗传分析 

在白丰B的⁶⁰Co辐射突变体库中筛选出籽粒粉质的株系Q25。 

与白丰B比较，Q25的主要特征是籽粒粉质，不透明(见图2)。扫描电镜分析证实，Q25中淀粉颗粒松散(见图2)，可能是导致胚乳不透明的主要原因。此外，Q25在SDS-PAGE图谱中表现为57kDa的谷蛋白前体剧增，相应的成熟的酸性亚基和碱性亚基含量降低，与此同时伴随球蛋白含量下降，醇溶蛋白未表现出明显差异(见图3)。 

水稻胚乳中存在两类蛋白体，分别为蛋白体I和蛋白体II。前者由醇融蛋白组成，后者由谷蛋白和球蛋白构成。半薄切片经考马斯亮蓝染色，光学显微镜观察显示(见图4)：野生型白丰B和Q25糊粉层(A1标示)无明显差异，均由厚壁细胞构成。然而，Q25亚糊粉层细胞(S1标示)和胚乳细胞(En标示)的内部结构异常。在细胞壁附近积聚了很多未知的异形结构。根据染色结果来看，此类结构内部填充有大量蛋白质。图4的结果表明突变体Q25中蛋白体II变小，在细胞壁附近形成了大量填充有蛋白质的异形结构。 

透射电镜的观察结果显示(图5)：在发育6天的胚乳中(A，B，C和D)，一些电子致密的囊泡类结构(箭头标示)出现在Q25的细胞膜(箭标示)和细胞壁(CW标示)之间(B，C和D)，而野生型白丰B中细胞膜(箭标示)和细胞壁(CW表示)结合紧密，中间无类似结构出现(D)。当胚乳发育到9天时(E，F，G，H，I，J和K)时，在突变体Q25的细胞壁(CW标示)和细胞膜(箭标示)之间形成了大的异形结构(F，G，H，I，J和K，PMB表示)，从电子密度来判断，此结构主要由蛋白质和细胞壁的成分构成。蛋白质可能来源于细胞质中的由膜包裹的致密囊泡(J，箭头标示)。然而，野生型白丰B(E)，并未发现异常结构的出现，蛋白体II(PBII)和蛋白体I(PBI)均表现正常。 

进一步的免疫荧光实验证实(图6，A和B中的红色代表醇溶蛋白；C和D中的红色信号代表球蛋白；A，B，C和D中的绿色信号代表谷蛋白)：突变体Q25中蛋白体I与野生型白丰B中的蛋白体I无明显差异(A和B，箭头标示)，而突变体Q25中蛋白体II(B，箭标示)与野生型白丰B(A，箭标示)相比明显变小。此外，图4和图5中发现的异形结构(星号和心形标示的绿色信号)中含有大量的谷蛋白。野生型白丰B中，球蛋白分布在谷蛋白的外周(C)。然而在Q25中，除谷蛋白外，球蛋白的分布也发生了类似的变化(D，红色信号)，除在小的蛋白体II中有分布外，大的异形结构和小囊泡中也有球蛋白的分布。 

综上所述，在突变体Q25中由于谷蛋白和球蛋白发生错误分选，导致大量谷蛋白和球蛋白 以囊泡的形式分泌到细胞质膜和细胞壁之间，进而形成了大量的异形结构。最终导致谷蛋白以前体形式在蛋白体II以外存在，成熟的谷蛋白含量下降。 

突变体Q25与其野生型白丰B杂交，得到杂交组合Q25/白丰B，对F₂群体中128粒种子调查结果显示，籽粒不透明性状与成熟谷蛋含量降低性状紧密连锁，均由一隐性核基因控制。 

二、突变基因定位 

1、突变基因初步定位 

用突变体Q25与广亲和品种02428(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)杂交，在Q25/02428的F₂分离群体中随机选取籽粒粉质且表现为成熟谷蛋白含量降低的种子，发芽后，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个混合基因组池。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在Q25和02428之间进行多态性分析，之后每间隔10cM挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同混池DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将谷蛋白分选关键基因GPA3(Glutelin  Precursor Accumulation)定位在第3染色体SSR标记RM571和RM570之间。 

上述SSR标记分析的方法如下所述： 

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下： 

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。 

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4M NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。 

③加入40μl20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。 

④加入100μl5M NaCl，温和混匀。 

⑤加入100μl10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。 

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。 

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。 

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。 

⑨加入100μl1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。 

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman Instrument Inc.U.S.A)。 

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增； 

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂05.1ul，共10ul。 

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。 

(3)SSR标记的PCR产物检测 

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。 

2、突变基因精细定位 

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从Q25/02428杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的F₂种子，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、CAPS、dCAPS分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下： 

(1)SSR标记开发 

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5)：808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在Q25和02428之间的多态性，表现多态者用作精细定位pss1基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。 

表2用于精细定位的分子标记 

(2)CAPS、dCAPS标记开发 

CAPS(dCAPS)引物设计：对02428在OsGPA3基因所在位置附近的部分区段进行测序，并与白丰B相对应的序列进行比对，发现两者之间存在的SNPs，以这些SNPs为基础用SNP2CAPS软件设计CAPS标记，如没有合适的酶切位点则通过“dCAPS Finder 2.0”软件设计错配的PCR引物创造酶切位点，同时运用Primer Premier 5.0软件设计对应的另一条引物，从而获得Q49、Q57、Q58(表2)。 

CAPS/dCAPS标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，正向引物(10pmol/ul)2ul，反向引物(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。 

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。 

PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用1-4％的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8％的非变性PAGE胶分离，银染。 

根据F₂群体中胚乳粉质，成熟谷蛋白含量降低单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把gpa3基因精细定位在PAC克隆OSJNBa0096I06上，标记Q49和Q38之间，物理距离约为45kb(图1)。候选区段基因组测序显示，在Q25中，基因Os03g0835800中存在一个碱基的突变，由C突变为T，形成一个新的终止密码子TAA，导致该基因编码蛋白时提前终止。 

(3)突变基因的获得 

根据定位的位点设计引物，序列如下所述： 

primer1： 

5’-CTACCGTGGAGGCGTGGATTG-3’(SEQ ID NO.4) 

primer2： 

5’-CATGCCATGTATGCAGCTATG-3’(SEQ ID NO.5) 

以primer1和primer2为引物，以白丰B的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于序列2上游39bp和下游79bp，扩增产物为目的基因的5’UTR区，CDS区(ATG到TGA，ATG红色字体标出，TGA蓝色字体标出)和3’UTR区。 

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃2min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。 

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码501个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQ IDNO.1所示的蛋白命名为OsGPA3(即为基因定位中所述的GPA3基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsGPA3。 

实施例2、转基因植物的获得和鉴定 

一、重组表达载体构建 

以白丰B(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsGPA3基因，PCR引物序列如下： 

primer3(下划线所示的序列为SmaI酶切位点)： 

5’AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGTGGGAAGAACTAGGAAGGTTGTCG  3’(SEQ ID NO.6) 

primer4(下划线所示的序列为SmaI酶切位点)： 

5’CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTGGAAGGAAATAGGGTCACAAGGG  3’(SEQ ID NO.7) 

上述引物位于序列2所示基因的上游2.7kb和下游3.1kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305.1(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)中，构建成pCAMBIA1305.1-OsGPA3。 

重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCAMBIA1305.1载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京 Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsGPA3的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsGPA3，OsGPA3基因插入在多克隆位点SmaI之间。 

二、重组农杆菌的获得 

用电击法将pCAMBIA1305.1-OsGPA3转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305.1-OsGPA3。 

三、转基因植物的获得 

分别将EH-pCAMBIA1305.1-OsGPA3转化突变体Q25，具体方法为： 

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1305.1-OsGPA3培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液； 

(2)将培养至一个月的Q25水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天； 

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto Technology Laboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)； 

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次； 

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次； 

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化； 

得到分化成苗的T₀代阳性植株。 

四、转基因植株的鉴定 

1、PCR分子鉴定 

将步骤三获得的T₀代植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物对进行扩增(Primer5：AAGGATCAGCGTATCGTGCT(SEQ ID NO.8)和Primer6：GACGCTTGGATGGTTCTTGT(SEQ ID NO.9))。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul) 2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。 

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测，图8中泳道1为OsGPA3突变体基因组DNA，作为阴性对照；泳道2为pCAMBIA1305.1-OsGPA3质粒，作为阳性对照；泳道3-8为转基因株系。结果显示3，4号均为转基因阳性株系。 

2、表型鉴定 

分别将T₀代转pCAMBIA1305.1-OsGPA3植株，Q25和白丰B种植在中国农业科学院试验网室内。结果显示仅有3号转基因株系T1种子中出现了透明的籽粒(透明∶不透明＝3∶1)(图9)，SDS-PAGE检测透明种子(T1-T)与白丰B表现一样。而粉质不透明的种子(T1-O)与Q25均表现为谷蛋白前体增加。由此验证了转基因前的不透明粉质和谷蛋白前体增加性状是由OsGPA3基因控制的，即该OsGPA3基因为谷蛋白分选相关基因。并且，将pCAMBIA1305.1-OsGPA3转化水稻Q25突变体，可以使其成熟谷蛋白含量上升至正常水平。 

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于选自如(a)或(b)所示的任一种：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)所示的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码SEQ ID NO.1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点SmaI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育谷蛋白分选正常的转基因植物中的应用。

9.一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入谷蛋白分选异常植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常的植物为谷蛋白前体异常积累的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白分选正常的转基因植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常的植物中。

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