CN108822194A

CN108822194A - 一个植物淀粉合成相关蛋白OsFLO10及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108822194A
Application number: CN201810612909.0A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 任玉龙; 巫明明; 江玲; 张文伟; 田云录; 刘喜; 刘世家; 陈亮明
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN108822194B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一个植物淀粉合成相关蛋白OsFLO10及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的植物淀粉合成相关蛋白影响植物胚乳中淀粉的合成。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的植物中，可以培育淀粉合成正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一个植物淀粉合成相关蛋白OsFLO10及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个植物淀粉合成相关蛋白OsFLO10及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)籽粒在成熟过程中积累大量的淀粉，为种子萌发和幼苗生长发育提供主要能量，同时也成为人类重要的食物来源。淀粉的积累不仅影响水稻的产量，其含量与特性还直接决定稻米的品质。因此，通过对淀粉突变体的研究，发掘淀粉合成关键基因，不仅在科学上阐明了水稻淀粉合成及调控机制，在育种上对改良稻米品质也具有重要的指导意义。

水稻淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉由颗粒结合型淀粉合酶(IGBSSI)合成，它由Waxy基因编码；而淀粉合酶(SSs)，淀粉分支酶(BEs)和淀粉去分支酶(DBEs)则参与支链淀粉的合成。在水稻中这些基因的突变，胚乳淀粉都会表现异常特征。由上述酶类和一些调控因子参与，最终淀粉在造粉体内被转化为淀粉颗粒并储存起来的途径已被广泛认知，但越来越多不属于上述酶类的粉质基因的克隆，预示淀粉的合成极其精密且复杂。这些新的粉质基因就包含PPR蛋白家族。

PPR(Pentatricopeptide repeat)蛋白是广泛分布于各类生物当中一大类蛋白家族，在高等植物中大多定位于叶绿体和线粒体，在水稻、拟南芥和玉米中各有四百多种PPR蛋白。PPR蛋白对单链RNA具有序列特异性识别模式，与RNA的转录、剪切、编辑和稳定性等过程都密切相关。现有的研究表明，PPR对开花植物的胚及胚乳发育具有重要作用。OsFLO10属于PPR蛋白家族的一个成员，其在生物体内的功能还未被研究。

发明内容

本发明的目的是提供一个淀粉合成相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的淀粉合成相关蛋白(OsFLO10)，来源于稻属水稻(Oryza sativavar.N22)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由1269个氨基酸残基组成，自氨基端188-1269为PPR家族结构域。

为了使(a)中的OsFLO10便于纯化和研究在水稻细胞的亚细胞位置，可在由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1和表2所示的标签。

表1 MBP标签的序列

表2 GFP标签的序列

上述(b)中的OsFLO10可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsFLO10的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述淀粉合成相关蛋白的基因(OsFLO10)也属于本发明的保护范围。

所述基因OsFLO10可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码调控淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

SEQ ID NO.2由3810个核苷酸组成，为OsFLO10的编码区CDS(coding sequence)。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCUBi1390载体的多克隆位点KpnI和SpeI之间重组插入所述基因(OsFLO10)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCUBi1390–OsFLO10；所述pCUBi1390-OsFLO10是由OsFLO10基因组编码序列通过重组技术插入到pCUBi1390多克隆位点HindIII和SpeI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsFLO10的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsFLO10。

含有以上任一所述基因(OsFLO10)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsFLO10)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉合成异常的植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物；所述淀粉合成异常植物为胚乳表现为粉质表型的植物；所述淀粉合成正常的转基因植物为胚乳表现透明非粉质的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入淀粉合成异常植物中；所述淀粉合成异常植物可为flo10。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明的淀粉合成相关蛋白影响水稻胚乳中谷淀粉合成的过程。将所述蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的粉质胚乳植物中，可以得到胚乳透明非粉质的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型N22和突变体flo10的籽粒表型。

图2为野生型N22和突变体flo10的籽粒扫描电镜观察。

图3为野生型N22和突变体flo10胚乳半薄切片观察。

图4为野生型N22和突变体flo10灌浆速率及千粒重对比。

图5为野生型N22和突变体flo10理化性质比较。

图6为突变基因在第3染色体上的精细定位。

图7为转pCUBi1390-OsFLO10的T₁籽粒表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻淀粉合成突变体flo10表型分析及其遗传分析

水稻品种N22经MNU诱变突变体库中筛选出种子粉质不透明突变体flo10。

图1左图为N22成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳完全透明的表型，右图为flo10成熟种子整体和横断面的扫描图，表现为胚乳全粉的表型。

图2为N22和flo10扫描电镜分析图。N22的成熟种子扫描电镜表现为淀粉颗粒排列紧密，大小均一，而flo10中淀粉颗粒排列松散，颗粒大多为圆形。因此在光线通过时会发生散射，导致flo10籽粒外观呈现不透明表型。

利用半薄切片后的I₂-KI染色来观察N22和flo10复合淀粉颗粒的形态(图3)。在野生型N22胚乳里层细胞中，每个造粉体内部产生多个独立存在的淀粉颗粒，这是水稻典型的复合淀粉颗粒结构，淀粉颗粒排列紧密(图3)。进一步观察突变体flo10，发现其胚乳里层细胞的胞质中，存在许多小的、零散分布的单粒淀粉颗粒，而且淀粉颗粒之间排列不紧密，表明突变体中淀粉发育不正常，而且较野生型相比滞后。(图3)。

在整个种子发育过程中，flo10突变体的灌浆速率明显低于野生型(图4)。从开花后6天开始，突变体的干物质积累开始显著低于野生型，并且这个差异一直维持到灌浆结束。与灌浆速率明显降低相对应的结果是，成熟的flo10突变体种子千粒重明显低于N22(图4)。

flo10突变体的种子具有较高含量的脂肪，同时淀粉含量较野生型显著降低(图6)。相应地，直链淀粉含量显著降低(图5)。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体flo10与日本晴杂交，在flo10/日本晴的F₂分离群体中随机选取10粒粉质的种子，发芽后，分别将各株的叶片提取DNA。首先，用覆盖水稻全基因组的SSR和InDel引物在N22和日本晴之间进行多态性分析，之后每间隔10cM挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同群体DNA共计12个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将淀粉合成关键基因OsFLO10定位在第3染色体SSR标记I3-7和N3-11之间。

上述SSR和Indel标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2g左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μL提取液(含100mMTris-Hcl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mL CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μL 1×TE(121gTris溶于1L水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl₂free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl₂(25mM)0.6μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 5.1μL，共10μL。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸5min；10℃保存。PCR反应在AB Veriti 96-Well Thermal Cycle热循环仪中进行。

(3)SSR和Indel标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR和Indel标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从flo10/日本晴杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的F₂种子，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在N22和日本晴之间的多态性，表现多态者用作精细定位OsFLO10基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表3。

表3用于精细定位的分子标记

根据F₂群体中胚乳粉质单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把OsFLO10基因精细定位在M3-5和W-5之间，物理距离约为57.9kb(图6)。候选区段基因组测序显示，在flo10中，基因LOC_Os03g07220中缺失一个碱基C，导致蛋白翻译提前终止。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1：5'-ATGTGGAAGACTTTGCAGTTATGCA-3'(SEQ ID NO.4)

primer2：5'-TCACGGGGAGTTCACTTGAGTTGAA-3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以N22的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因，扩增产物为3810bp的目的片段。

扩增反应在AB Veriti 96-Well Thermal Cycle PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃2min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码1269个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ IDNO.1)。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsFLO10(即为基因定位中所述的OsFLO10基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsFLO10。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以N22的cDNA为模板，进行PCR扩增获得OsFLO10基因的编码序列，PCR引物序列如下：

primer3：

5'TTACTTCTGCACTAGGTACCATGTGGAAGACTTTGCAGTTATGCA3'(SEQ ID NO.6)

primer4：

5'AGCGTTAACACTAGTCTCACGGGGAGTTCACTTGAGTTGAA 3'(SEQ ID NO.7)

上述引物分别位于序列2所示基因的ATG上游到TGA下游结束，扩增产物包含了该基因的全部编码区部分，将PCR产物回收纯化。采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390中，构建成pCUBi1390-OsFLO10；重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCUBi1390载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。

37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ IDNO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsFLO10的pCUBi1390命名为pCUBi1390–OsFLO10，OsFLO10基因插入在多克隆位点KpnI和SpeI之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCUBi1390–OsFLO10转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为pCUBi1390–OsFLO10。

三、转基因植物的获得

将pCUBi1390–OsFLO10转化突变体flo10具体方法为：

(1)28℃培养pCUBi1390–OsFLO10培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的flo10水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto TechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、潮霉素抗性鉴定

本研究中利用1‰浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。具体方法：将新鲜的转基因植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中，用新配的1‰的潮霉素溶液浸泡，放在28℃培养箱中暗培养48小时，与对照比较，叶片坏死的表明不抗，没有坏死的表明抗，将抗潮霉素的家系命名为pCUBi1390–OsFLO10。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCUBi1390–OsFLO10的阳性植株，N22和flo10种植在南京农业大学牌楼试验基地。对T₁代种子进行表型鉴定，发现在T₁代显示出分离表型，透明籽粒的表型与N22相同，不透明籽粒的表型与flo10相同(图7)，说明导致flo10突变体表型确实是OsFLO10基因控制的，即该OsFLO10基因为淀粉合成相关基因。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个植物淀粉合成相关蛋白OsFLO10及其编码基因与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> PRT

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. N22)

<400> 1

Met Trp Lys Thr Leu Gln Leu Cys Ser Ser Ile His Leu Arg Arg His

1 5 10 15

Leu Arg Gln Glu Pro Lys Ile Ile Cys His Gly Tyr Ala Asn Gly Ala

20 25 30

Ser Glu Leu Asn Ser Asn Ala Arg Ser Leu Leu Lys Gly Glu Ile Cys

35 40 45

Tyr Thr Gly Lys Lys Lys Glu Ser Ile Ser Val Ser Ser Ser Asn Ile

50 55 60

Ala Val Ser Ser Gln Gly Ile Gly Phe Ser Leu Glu Gln Arg Thr Gly

65 70 75 80

Glu Lys Cys Leu Ala Asn Ser His Leu Asp Val Lys Leu Cys Thr Gly

85 90 95

Ile Val Lys Leu Val Ile Asp Lys Cys Ser Tyr Ile Phe Lys Ser Lys

100 105 110

Gly Gly Ile Phe Asp Gly Asn Cys Arg Leu Gln Asp Val Leu Lys Leu

115 120 125

Gly Phe Trp Leu Ser Pro Glu Thr Leu Arg Pro Phe Trp Arg Ala Ser

130 135 140

Glu Leu Lys Pro Asp Asp Phe Leu Asn Ile Leu Ile Gly Phe Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ala Ala Glu Val Lys Lys Ala Ile Phe Leu Trp Asn Leu Tyr Arg

165 170 175

Trp Ala Ser Trp Gln Ser Lys Ala Phe Gln His Leu Pro Arg Ser Asn

180 185 190

Glu Ile Met Val Ser Ile Leu Ala Asn Ala His Met Leu Ser Gln Ala

195 200 205

Glu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Asp Gly Asn Arg Val Leu Ala Asp Ala

210 215 220

Gly Lys Leu Phe Ser Gln Val Ile Gln Ala Tyr Ala Glu Ala Gly Asn

225 230 235 240

Leu Gly Lys Ser Ile Ser Ile Tyr Asp Cys Ala Gln Asp Arg Cys Leu

245 250 255

Ile Pro Ser Gly Ser Cys Tyr Gln Val Leu Leu His Leu Leu Met Glu

260 265 270

Arg Arg Lys Asn Asp Leu Val Leu Arg Val Tyr Leu Asp Met Leu Gly

275 280 285

Ala Gly Leu Gly Ser Tyr Thr Glu Gly Asp Ile Leu Asp Ile Val Val

290 295 300

Lys Ala Leu Ile Lys Lys Asp Lys Phe Leu Gln Ala Ile Gly Ile Ile

305 310 315 320

Arg Gln Leu Lys Asp Leu Asn Ile Gln Met Ser Lys Gly Ser Leu Ser

325 330 335

Ala Val Thr Gln Glu Phe Cys Lys Lys Lys Asp Ile Gly Asp Met Met

340 345 350

Asn Phe Leu Glu Glu Trp Arg Tyr Leu Pro Asp Leu Leu Leu Ser Asn

355 360 365

Arg Ile Ile Ala Ser Leu Cys Ala Asn Ile Gly Thr Asp Glu Ala Trp

370 375 380

Leu Val Phe Gln Arg Leu Glu Val Leu Gly Phe Val Pro Asp Ala Thr

385 390 395 400

Thr Phe Gly Ile Phe Ile Arg Tyr Ser Cys Arg Glu Leu Lys Leu Lys

405 410 415

Ala Ala Phe Leu Tyr Leu Ser Glu Cys Phe Ser Arg His Ile Asn Pro

420 425 430

Lys Val Cys Ala Tyr Asn Ala Ile Ile Gly Gly Ile Phe Lys Glu Gly

435 440 445

Leu Tyr Arg His Ala Lys Tyr Val Phe Glu Asp Met Ala Glu Arg Lys

450 455 460

Ile Ile Pro Glu Leu Leu Thr Tyr Lys Ile Leu Leu Ala Gly Tyr Cys

465 470 475 480

Arg Tyr Arg Gln Phe Asp Glu Ile Glu Gln Thr Leu Arg Thr Met Glu

485 490 495

Thr Asn Gly Ile Asn Asp Ile Pro Ser Gly Asn Cys Val Leu Ser Lys

500 505 510

Ala Leu Ser Phe Leu Gly Leu Asp His Leu Gly Val Lys Val Lys Arg

515 520 525

Asp Asn Ala Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Phe Phe Asp Ser Val Gly

530 535 540

Asn Gly Leu Tyr Leu Asp Thr Asp Ser Thr Lys Phe Glu Ala Ser Leu

545 550 555 560

Val Gln Ile Ile Asp Tyr Ala Leu Tyr Pro Asp Ile Ser Leu Asn Leu

565 570 575

Val Arg Ala Cys Arg Gln Gly Asp Ile Ala Ser Ala Leu Val Leu Lys

580 585 590

Asp Glu Thr Phe Gln Trp Gly His Asp Ile Ser Thr Ala Ser Tyr Ser

595 600 605

Glu Leu Leu Lys Ala Leu Ser Ala Ser Pro Ala Arg Ala Met Asp Ala

610 615 620

Ile Asn Leu Ile Asp Glu Met Ala Asp Thr Pro Asp Lys Phe Asp Ala

625 630 635 640

Gln Asn Leu Asn Leu Ala Val Gln Thr Leu Ser Arg Asn Gly Arg Ser

645 650 655

Ala Cys Ala Arg Leu Ala Phe Asp Arg Leu Leu Arg Asp Gly Phe Pro

660 665 670

Ala Ser Gln Asp Thr Tyr Thr Tyr Leu Met Ile Gly Phe Cys Ile Glu

675 680 685

Arg Asp Ile Ala Gly Phe Trp Glu Cys Trp Ser Leu Ala Thr Lys His

690 695 700

Gly Trp Ser Pro Gly Ser Arg Asp Val Ile Pro Leu Ile Ser His Leu

705 710 715 720

Ser Lys Trp Gly Val Ile Glu Glu Ala Leu Glu Phe Ile Ser Val Leu

725 730 735

Leu Asp Cys Tyr Pro Ser Leu Phe Phe Ser Ala Tyr Cys Gln Leu Leu

740 745 750

Glu Glu Leu Cys Met Thr Gly Cys Thr Ser Val Gly Cys Ala Met Leu

755 760 765

Glu Ala Leu Ile Glu Lys Gly Val Ala Val Asp Pro Ser Leu Ile Cys

770 775 780

Asn Val Met Glu Gly Phe Leu Lys Glu His Lys Ile Ala Glu Thr Ile

785 790 795 800

Gly Met Tyr Asp Met Leu Leu Asn Arg Asn Lys Val Leu Asn Val Ser

805 810 815

Thr Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Ser Val Ala Arg Ile Asp Ala Glu Arg

820 825 830

Ala Met Asp Leu Val Gln Ser Val Met Asn Met Glu Ser Thr Asp Phe

835 840 845

Ser Thr Cys Ser Ser Ile Val Lys Asn Leu Leu Gln Ser Gly Lys Ile

850 855 860

Gly Gln Val Met Ser Val Phe Glu Glu Thr Val Leu Gly Lys Lys Phe

865 870 875 880

Asn Ala Thr Leu Leu Asn Ser Phe Leu Gln Ala Tyr Tyr Cys Val Lys

885 890 895

Asn Trp Arg Lys Ala Asp Ala Val Leu Cys Met Met Leu Lys Met Gln

900 905 910

Asn Ser Leu Ser Ile Ser Ser Tyr Arg Phe Leu Val Arg Arg Met Cys

915 920 925

Glu Gln Ser Arg Ile Ser Ser Ala Leu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Gln

930 935 940

Asp Arg Asp Lys Ser Thr Glu Leu Ile Leu Tyr Asn Ile Leu Ile Phe

945 950 955 960

Tyr Leu Phe Arg Arg Arg His Ile Leu Gln Val His Asn Leu Leu Lys

965 970 975

Asp Met Lys Ser Asn Gly Phe Ser Pro Asp Thr Thr Thr Tyr Asp Phe

980 985 990

Leu Val Asn Gly Phe His Lys Ser Gly Asp Val Asp His Ser Ile Asn

995 1000 1005

Met Leu Asp Ser Cys Ile Ala Gln Gly Leu Thr Pro Ser Asn Arg Ser

1010 1015 1020

Leu Arg Val Val Leu Ser His His Cys Lys Leu Gly Asn Leu Glu Lys

1025 1030 1035 1040

Ser Leu Glu Leu Phe His Leu Ile Glu Ser Asn Gly Trp Lys His Gly

1045 1050 1055

Leu Val Ile Glu Thr Thr Leu Ile Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Arg

1060 1065 1070

Phe Ser Glu Ala Thr Ser Cys Leu Asn Ser Met Asn Lys Arg Glu Leu

1075 1080 1085

Ile Gly Phe Asp Ile His Phe Asp Val Leu Ile Lys Glu Leu Cys Leu

1090 1095 1100

Leu Gly Asp Val Glu Met Ser Val Ser Leu Leu Asn Thr Met Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Lys Gly Lys Ile Pro Ser Glu Val Ser Tyr Asp Ser Val Val Tyr Arg

1125 1130 1135

Leu Cys Met Leu Lys Glu Phe Asp Gln Ala Leu Asp Phe Leu Ala Glu

1140 1145 1150

Met Gln Phe Ala Asn Leu Lys Pro Ser Asp Met Ser Cys Asp Val Leu

1155 1160 1165

Ile Gln Gly Leu Ser Ala Met Gly Arg Thr Cys Asp Ala Met Asn Ile

1170 1175 1180

Leu Glu Met Leu Thr Thr Ile Gly Ser Ser Pro Ser Tyr His Met Tyr

1185 1190 1195 1200

Arg Val Val Phe Asp Asn Cys Cys Arg Ser Asn Asn Leu Gln Lys Ala

1205 1210 1215

Ala Thr Leu Leu His Asp Met Gln Gln Ala Gly Phe Ser Pro Asn Phe

1220 1225 1230

Glu Met His Trp Ser Val Ile Ser Asn Leu Ser Ser Asn Ala Lys Arg

1235 1240 1245

Thr Thr Gly Tyr Glu Lys Pro Ile Leu Ser Asn Leu Ile Ser Ser Thr

1250 1255 1260

Gln Val Asn Ser Pro

1265

<210> 2

<211> 3810

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. N22)

<400> 2

atgtggaaga ctttgcagtt atgcagctca atccatctcc ggcggcatct aaggcaagaa 60

cctaagataa tatgccatgg ttatgctaat ggtgcttcag agctgaattc caacgcaagg 120

agcttgttga aaggtgaaat ctgctacact gggaagaaga aagagagcat ctctgtttcc 180

agttcaaaca tcgctgtctc ttcacagggc attggattta gtttggagca aagaactgga 240

gagaagtgct tagccaattc ccatttggat gtaaagctgt gcactggaat tgtaaagctg 300

gttatagata agtgctctta tatttttaag agtaaagggg gcatctttga tgggaactgc 360

agattgcaag atgttcttaa gcttggtttc tggctctcac cagagacact ccgcccattt 420

tggcgtgctt cagagctgaa gcctgatgat ttccttaaca tcttgattgg ctttgggcca 480

gatgctgcag aagtgaagaa ggcaatattt ttgtggaatt tgtaccggtg ggcttcgtgg 540

cagagcaagg cattccaaca tcttccaagg tcgaatgaaa ttatggtgtc aatacttgca 600

aatgctcata tgcttagcca agcggaatca ttgcttctct tgttggatgg caacagggtt 660

ctggctgatg caggtaaact gtttagtcag gttatccaag cgtatgcaga agctggcaac 720

cttggtaagt caatttcaat ttatgactgt gcacaggata ggtgtctgat tccttcaggc 780

tcatgctacc aggtacttct tcatctactg atggaaagga gaaaaaatga cttagtttta 840

agagtatatt tggacatgct tggagctgga ttaggttctt acacggaagg agatattctt 900

gatattgttg tcaaggcttt aatcaagaaa gacaaatttt tgcaagctat tggtataatt 960

cggcagttaa aggatttgaa cattcaaatg agtaagggat ccttatcagc tgtcacacaa 1020

gaattttgca agaagaagga tattggagat atgatgaatt tcttagaaga gtggaggtat 1080

ctacctgact tgcttctcag caatagaatt attgcctctt tatgtgcaaa tattggtact 1140

gatgaggcat ggttggtttt ccaaagattg gaagtcttag ggtttgtgcc agatgcaact 1200

acttttggaa tcttcatacg ttacagctgt agagaattga agctgaaggc tgcatttcta 1260

tatttatctg agtgcttttc tagacatatt aaccctaaag tttgtgctta taatgctatt 1320

ataggtggta tttttaagga gggattatac aggcatgcaa agtatgtctt tgaagacatg 1380

gctgaaagaa aaattattcc agaactgtta acatacaaga tacttttggc aggatattgc 1440

agatataggc agtttgatga aatagaacaa accttgagga ctatggaaac caatggcata 1500

aatgatatcc cgtctggaaa ttgtgtgctt tctaaggcct tatcattctt ggggctagac 1560

cacctagggg tgaaagtcaa gagagataat gctgcaggct atccaaaggc tgagtttttc 1620

gattcagtag gtaatggtct atatttggac actgattcca caaagtttga ggcttcattg 1680

gtacagatta tcgattatgc tctttaccca gatattagct tgaatctagt cagggcatgt 1740

cggcaaggtg atatcgcaag tgctcttgta ctcaaagatg aaacttttca atggggacat 1800

gacatttcta cagctagcta ctcagaacta ttaaaggcct taagcgcgag ccctgctcgt 1860

gcaatggatg ccattaacct tattgacgag atggcagata cacctgacaa atttgatgct 1920

caaaatctaa atctggctgt ccaaacattg agtaggaatg ggaggtcagc ttgtgcaagg 1980

ttggctttcg acagattgct tagagatggc ttccctgcta gtcaagatac ctatacttat 2040

ttgatgatag ggttctgcat agaaagggac atagcaggat tttgggaatg ttggagtctg 2100

gcaacaaagc atggatggtc acctggtagc agggatgtga tcccccttat cagtcacttg 2160

agcaaatggg gggtaatcga ggaagccttg gagtttatca gcgtgttgct ggactgttac 2220

cctagtttgt ttttcagtgc atactgccaa cttctcgaag agttatgcat gactggttgc 2280

acaagtgttg gatgtgcaat gcttgaggct ctcatagaaa agggtgtggc tgtggatcct 2340

tcgctaattt gtaatgtgat ggaagggttt ctaaaggagc ataagattgc tgaaacaatt 2400

ggaatgtatg acatgttgct taacagaaac aaagtattaa atgtgtccac ttaccaatct 2460

gcattgtctt cagtggcaag aattgatgca gaacgagcca tggacttggt acaatctgtg 2520

atgaacatgg aatctactga tttctcaacg tgcagttcta tcgtgaagaa cttattgcaa 2580

tcaggaaaaa taggccaggt aatgtcagtc tttgaggaaa cagttttggg gaagaagttc 2640

aatgctacct tgctaaattc ctttctacaa gcatattatt gtgtaaaaaa ttggagaaag 2700

gcagatgcag ttctttgcat gatgttaaag atgcagaata gcctttctat ttctagttac 2760

cgctttcttg tccgtagaat gtgcgagcaa agtcggattt ccagcgcatt aagacttaaa 2820

gagctgatcc aagataggga caagtcaaca gaactaattt tatacaatat tctgattttt 2880

tatcttttcc ggagaagaca cattttacag gttcataatt tgttgaagga tatgaaaagc 2940

aatggttttt ctccagacac caccacttat gacttccttg tcaatgggtt tcacaagtct 3000

ggagatgtcg atcattcaat taatatgctt gattcttgca ttgctcaggg attaacgcca 3060

agcaatcgta gtctcagagt agtattgagt caccattgca agttaggaaa ccttgagaaa 3120

tcactagaat tatttcatct gatagaaagc aacggatgga agcatggttt agtcattgag 3180

acaaccctca tttcaagtct tctctcatca gggaggtttt ctgaagcaac atcttgtctg 3240

aacagcatga acaaaagaga gctgattggg tttgacatac attttgatgt cctaatcaag 3300

gaactctgct tactgggaga tgtggaaatg tctgttagtc tgctaaatac aatgctaaag 3360

aaaggcaaaa ttccgagtga agttagctac gactctgttg tgtacaggct atgtatgttg 3420

aaggaattcg atcaggcact tgattttctt gctgagatgc aatttgcgaa cctaaaacca 3480

agtgacatgt cctgcgatgt gcttatacag ggcctttctg ccatgggaag aacctgtgat 3540

gctatgaata ttttggaaat gttgaccacc attggctctt caccatccta tcacatgtat 3600

agagttgttt ttgataactg ttgcaggagt aacaatctac agaaggctgc aacacttctg 3660

catgacatgc agcaagctgg gttctcaccc aactttgaga tgcactggtc tgttattagc 3720

aatttaagta gtaatgctaa gaggactaca ggatatgaga agcctatttt gtccaacctt 3780

atttcttcaa ctcaagtgaa ctccccgtga 3810

<210> 3

<211> 3915

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa var. N22)

<400> 3

atgtggaaga ctttgcagtt atgcagctca atccatctcc ggcggcatct aaggtgagag 60

tgcgctttct agttcaagaa ctgcatggtt gttcctattg gtacatgtac actaagtatt 120

tcttcttata tgcatgtcaa ttcccttctg atcgtcaggc aagaacctaa gataatatgc 180

catggttatg ctaatggtgc ttcagagctg aattccaacg caaggagctt gttgaaaggt 240

gaaatctgct acactgggaa gaagaaagag agcatctctg tttccagttc aaacatcgct 300

gtctcttcac agggcattgg atttagtttg gagcaaagaa ctggagagaa gtgcttagcc 360

aattcccatt tggatgtaaa gctgtgcact ggaattgtaa agctggttat agataagtgc 420

tcttatattt ttaagagtaa agggggcatc tttgatggga actgcagatt gcaagatgtt 480

cttaagcttg gtttctggct ctcaccagag acactccgcc cattttggcg tgcttcagag 540

ctgaagcctg atgatttcct taacatcttg attggctttg ggccagatgc tgcagaagtg 600

aagaaggcaa tatttttgtg gaatttgtac cggtgggctt cgtggcagag caaggcattc 660

caacatcttc caaggtcgaa tgaaattatg gtgtcaatac ttgcaaatgc tcatatgctt 720

agccaagcgg aatcattgct tctcttgttg gatggcaaca gggttctggc tgatgcaggt 780

aaactgttta gtcaggttat ccaagcgtat gcagaagctg gcaaccttgg taagtcaatt 840

tcaatttatg actgtgcaca ggataggtgt ctgattcctt caggctcatg ctaccaggta 900

cttcttcatc tactgatgga aaggagaaaa aatgacttag ttttaagagt atatttggac 960

atgcttggag ctggattagg ttcttacacg gaaggagata ttcttgatat tgttgtcaag 1020

gctttaatca agaaagacaa atttttgcaa gctattggta taattcggca gttaaaggat 1080

ttgaacattc aaatgagtaa gggatcctta tcagctgtca cacaagaatt ttgcaagaag 1140

aaggatattg gagatatgat gaatttctta gaagagtgga ggtatctacc tgacttgctt 1200

ctcagcaata gaattattgc ctctttatgt gcaaatattg gtactgatga ggcatggttg 1260

gttttccaaa gattggaagt cttagggttt gtgccagatg caactacttt tggaatcttc 1320

atacgttaca gctgtagaga attgaagctg aaggctgcat ttctatattt atctgagtgc 1380

ttttctagac atattaaccc taaagtttgt gcttataatg ctattatagg tggtattttt 1440

aaggagggat tatacaggca tgcaaagtat gtctttgaag acatggctga aagaaaaatt 1500

attccagaac tgttaacata caagatactt ttggcaggat attgcagata taggcagttt 1560

gatgaaatag aacaaacctt gaggactatg gaaaccaatg gcataaatga tatcccgtct 1620

ggaaattgtg tgctttctaa ggccttatca ttcttggggc tagaccacct aggggtgaaa 1680

gtcaagagag ataatgctgc aggctatcca aaggctgagt ttttcgattc agtaggtaat 1740

ggtctatatt tggacactga ttccacaaag tttgaggctt cattggtaca gattatcgat 1800

tatgctcttt acccagatat tagcttgaat ctagtcaggg catgtcggca aggtgatatc 1860

gcaagtgctc ttgtactcaa agatgaaact tttcaatggg gacatgacat ttctacagct 1920

agctactcag aactattaaa ggccttaagc gcgagccctg ctcgtgcaat ggatgccatt 1980

aaccttattg acgagatggc agatacacct gacaaatttg atgctcaaaa tctaaatctg 2040

gctgtccaaa cattgagtag gaatgggagg tcagcttgtg caaggttggc tttcgacaga 2100

ttgcttagag atggcttccc tgctagtcaa gatacctata cttatttgat gatagggttc 2160

tgcatagaaa gggacatagc aggattttgg gaatgttgga gtctggcaac aaagcatgga 2220

tggtcacctg gtagcaggga tgtgatcccc cttatcagtc acttgagcaa atggggggta 2280

atcgaggaag ccttggagtt tatcagcgtg ttgctggact gttaccctag tttgtttttc 2340

agtgcatact gccaacttct cgaagagtta tgcatgactg gttgcacaag tgttggatgt 2400

gcaatgcttg aggctctcat agaaaagggt gtggctgtgg atccttcgct aatttgtaat 2460

gtgatggaag ggtttctaaa ggagcataag attgctgaaa caattggaat gtatgacatg 2520

ttgcttaaca gaaacaaagt attaaatgtg tccacttacc aatctgcatt gtcttcagtg 2580

gcaagaattg atgcagaacg agccatggac ttggtacaat ctgtgatgaa catggaatct 2640

actgatttct caacgtgcag ttctatcgtg aagaacttat tgcaatcagg aaaaataggc 2700

caggtaatgt cagtctttga ggaaacagtt ttggggaaga agttcaatgc taccttgcta 2760

aattcctttc tacaagcata ttattgtgta aaaaattgga gaaaggcaga tgcagttctt 2820

tgcatgatgt taaagatgca gaatagcctt tctatttcta gttaccgctt tcttgtccgt 2880

agaatgtgcg agcaaagtcg gatttccagc gcattaagac ttaaagagct gatccaagat 2940

agggacaagt caacagaact aattttatac aatattctga ttttttatct tttccggaga 3000

agacacattt tacaggttca taatttgttg aaggatatga aaagcaatgg tttttctcca 3060

gacaccacca cttatgactt ccttgtcaat gggtttcaca agtctggaga tgtcgatcat 3120

tcaattaata tgcttgattc ttgcattgct cagggattaa cgccaagcaa tcgtagtctc 3180

agagtagtat tgagtcacca ttgcaagtta ggaaaccttg agaaatcact agaattattt 3240

catctgatag aaagcaacgg atggaagcat ggtttagtca ttgagacaac cctcatttca 3300

agtcttctct catcagggag gttttctgaa gcaacatctt gtctgaacag catgaacaaa 3360

agagagctga ttgggtttga catacatttt gatgtcctaa tcaaggaact ctgcttactg 3420

ggagatgtgg aaatgtctgt tagtctgcta aatacaatgc taaagaaagg caaaattccg 3480

agtgaagtta gctacgactc tgttgtgtac aggctatgta tgttgaagga attcgatcag 3540

gcacttgatt ttcttgctga gatgcaattt gcgaacctaa aaccaagtga catgtcctgc 3600

gatgtgctta tacagggcct ttctgccatg ggaagaacct gtgatgctat gaatattttg 3660

gaaatgttga ccaccattgg ctcttcacca tcctatcaca tgtatagagt tgtttttgat 3720

aactgttgca ggagtaacaa tctacagaag gctgcaacac ttctgcatga catgcagcaa 3780

gctgggttct cacccaactt tgagatgcac tggtctgtta ttagcaattt aagtagtaat 3840

gctaagagga ctacaggata tgagaagcct attttgtcca accttatttc ttcaactcaa 3900

gtgaactccc cgtga 3915

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtggaaga ctttgcagtt atgca 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcacggggag ttcacttgag ttgaa 25

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttacttctgc actaggtacc atgtggaaga ctttgcagtt atgca 45

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcgttaaca ctagtctcac ggggagttca cttgagttga a 41

Claims

1.一种调控淀粉合成相关蛋白OsFLO10，其特征在于选自如(a)或(b)所示的任一种：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)所示的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码SEQ ID NO.1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码淀粉合成相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUBi1390载体的多克隆位点KpnI和SpeI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.一种培育淀粉合成正常的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入淀粉合成异常植物中，得到淀粉合成正常的转基因植物；所述淀粉合成异常的植物为胚乳表现为粉质表型的植物；所述淀粉合成正常的转基因植物为胚乳表现透明非粉质的转基因植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入淀粉合成异常的植物中。