CN1191359C - 小麦高分子量麦谷蛋白14亚基基因的核酸序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦储藏蛋白HMW-GS 14基因的核酸序列和对应的蛋白序列，以及基于该序列通过生物技术方法改良小麦加工品质的应用。本发明涉及的HMW-GS 14基因是出现在中国优质面包小麦种子的一种储藏蛋白基因，该基因产可显著提高小麦的面筋弹性。根据该基因序列可以通过基于PCR分子标记方法进行定向育种，培育出新的优质小麦。根据该基因序列可以克隆该基因，构建该基因的各种表达载体，并通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等转化方法将该基因导入小麦，以培育出加工品质优良的小麦品种及种质。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种小麦高分子量麦谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因的核酸序列，及其基于该序列通过生物技术方法改良小麦加工品质的应用。
背景技术
小麦高分子量麦谷蛋白(High Molecular Weight Glutenin)是小麦的一类重要的储藏蛋白。编码这类蛋白的基因座位(Glu-1)位于第一同源染色体群(1A、1B、1D)的长臂上。每个基因座位包括2个基因，它们分别编码高分子量的x-型的亚基和一个分子量相对稍低的y-型亚基，x-和y-型的HMW-GS基因紧密连锁，且靠近着丝点。因此理论上每种普通六倍体小麦应该包含6个不同的亚基，而实际上，绝大多数的普通小麦中只有3-5个高分子量麦谷蛋白亚基。这主要是由于一些编码麦谷蛋白的基因发生了沉默。Glu-1的三个位点的亚基都存在着多态性，其中Glu-B1位点变异程度最大，而Glu-A1位点变异程度最小。Glu-A1通常编码1、2*等亚基；Glu-B1通常编码7+8、17+18、14+15、6+8、7+9等亚基组合；Glu-D1通常编码2+12、5+10、3+12、2+10等亚基组合。高分子量麦谷蛋白亚基组成对小麦面包加工品质有非常重要的影响，而且HMW-GS组成对加工品质的贡献已从遗传、蛋白结构等方面得到确证。研究认为1、2*、5、10等亚基为优质亚基，2、12等亚基为劣质亚基。通过SDS-PAGE、PCR示踪不同HMW-GS，通过转基因导入外源HMW-GS提高小麦的加工品质的研究在国外已有成功的报道。
小麦高分子量麦谷蛋白(HMW glutenin)14和15亚基存在于面包小麦小偃六号、陕225等品种中，是Glu-b1基因位点的一种变异类型，该亚基类型的出现与面包加工品质呈正相关，是中国独特的优质基因资源8，9，10，11。
小麦高分子量麦谷蛋白基因的克隆已有不少报道，最初直接通过cDNA文库和基因组文库获得，后来直接通过PCR进行同源克隆。目前1、2*、12、2、7、9、5、10等亚基的基因已被克隆12，13。根据一种麦谷蛋白的特征序列建立基于PCR的分子标记方法进行辅助育种也有报道，典型如5+10亚基的分子标记4，5。通过基因枪、脓杆菌介导的转化在小麦中导入HMW-GS基因以提高小麦的加工品质在国内为已有多例报道，但目标基因主要集中在国外研究认为对加工品质贡献大的1、2*、5、10、7亚基基因，结果显示通过这种方法改良小麦加工品质是可行的6，7
以下是申请人给出的参考文献：
1.Shenry，P.R.et al 1992，High molecular weight subunits of wheatglutenin J.Cereal Sci 15：105-120
2.Payne，P.I.and G.J.Lawrence.Catalogue of alleles for the complexgene loci Glu-A1，Glu-B1，and G11-D1 which cake for high molecularweight subunits of glutenin in hexaploid wheat.Cereal Res，Commun，1983，11：29-35
3.Megan P.Lindsay，John H.Skerritt.The glutenin macropolymer of wheatour doughs：structure & function Trends in Food Science & Technology1999，10：247-253
4.D′ovidio，et al，Development of a set of oligonuleoide primeirsspecfic genes at ehe Glu-1 complexloci of wheat.Theor.Appl.Genet1995，91，189-194
5.D′ovidio，R.and O.D.Anderson.PCR analysis to distinguish betweenalleles of a member of a multigene family correlated with bread makingquality.Theor.Appl.Genet.1994a，88，759-763
6.Altpeter F，Vasil V，Srivastava V，Vasil IK.Integration andexpression of the high-molecular-weight glutenin subunit 1Ax1 geneinto wheat.Nat Biotechnol.1996，Sep；14(9)：1155-9.
7.Barro F，Rooke L，Bekes F，Gras P，Tatham AS，Fido R，Lazzeri PA，ShewryPR，Barcelo P.Transformation of wheat with high molecular weightsubunit genes results in improved functional properties.NatBiotechnol.1997，Nov；15(12)：1295-9.
8.王瑞等.一些优质小麦及其杂种后代高分子量谷蛋白亚基组成与面包品质之关系.西北农业学报.1995，4：25-30
9.Deng ZY，Zhao HX，Fan SH，Ji WQ，Guo AG，Xue XZ.Purification andbiochemical characterization of high-molecular-weight-gluteninsubunits 14 and 15.Yi Chuan Xue Bao.；2001，28(1)：46-51.
10.赵和等.小麦高分子量麦谷蛋白亚基遗传变异及其与品质和其它农艺性状关系的研究.作物学报.1994，20：67-75
11.赵会贤等.麦谷蛋白亚基Glu-1和Glu-3位点基因等位变异对小麦品质特性的影响.作物学报1997，23：646-654
12.Anderson，O.D.and F，C.Greene，The characterization and comparativeanalysis of high molecular weight glutenin genes from genomes A andB of a hexaploid bread wheat.Theor.Appl.Genet.1989b，77：689-700
13.Anderson，O.D.F.C.Greene.Nudeotide sequences of the two high-molecular weight glutenin genes from the D-genome of hexaploidwheat，Triticum aestivum L.CV.cheyene.Nucleic Acids Res.1989a 17：461-462
发明内容
本发明通过5年时间，对小麦高分子量麦谷蛋白14+15亚基进行了详细的研究。分析了14+15亚基和小麦加工品质的关联性，从小偃六号中纯化了HMW-GS14和15亚基蛋白，并获得了其蛋白末端序列，并以此为基础首次从小偃六号中克隆了HMW-GS14基因。并开展了基于该基因的分子标记和转基因研究，以期培育出新的优质种质和品种。
本发明所采用的技术方案是：以我国优质麦包小麦小偃六号为材料，以蛋白末端测序结果为基础，通过PCR扩增到下列HMW-GS14基因完整的编码区，并将该基因克隆入一种克隆载体中。
本发明的小麦高分子量麦谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
小麦高分子量麦谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因序列可以建立特异简捷的HMW-GS14+15的标记体系，并通过该体系进行定向育种，获得加工品质优良的小麦新品种或新种质。
本发明经测序结果表明，HMW-GS14基因是不同于已经公布的所有HMW-GS基因的一种新的HMW-GS基因类型，该序列特征显示该序列的独特之处和导致优质的潜在因素。
基因序列表
小麦高分子量麦谷蛋白14亚基(HMW-GS14)基因序列：
1 TCCACCGAGA TGGCTAAGCG CCTGGTCCTC TTTGCGGCAG TAGTCGTCGC
51 CCTCATGGCT CTCACCGCCG CTGAAGGTGA GGCCTCTGGA CAACTACAAT
101 GTGAGCGCGA GCTCCGGAAG CGCGAGCTCG AGGCATACCA ACAGGTGGTG
151 GACCAGCAAC TCCGAGACGT TAGCCCCGGG TACCGCCCCA TCACCGTCAG
201 CCCGGGCACG AGACAATACG AGCAGCAACC TGTGGTGCCG TCCAAGGCCG
251 GATCCTTCTA CCCCAGCGAG ACTACGCCTT CGCAGCAACT CCAACAAATG
301 ATATTTTGGG GAATACCTGC ACTACTAAGA AGGTATTACC CAAGTGTAAC
351 TTCTTCGCAG CAGGGGTCAT ACTATCCAGG CCAAGCTTTT CCGCAACAAT
401 CAGGACAAGG ACAGCAGCCA GGACAAGGAC AGCAACCAGG ACAAAGGCAA
451 CAAGATCAGC AGCCAGGACA AGGACAACAA GGGTACTACC CAACTTCTCC
501 GCAACAGCCA GGACAAGGGC AACAACTGGG ACAAGGGCAA CCAGGGTACT
551 ACCCAACTTC ACAGCAGCCA GGACAAAAGC AGCAGGCAGG ACAAGGGCAC
601 CAATCAGGAC AAGGACAACA AAGGTACTAC CCAACTTCCC GCAACAGTAG
651 CAGCAGGCAG GACAAGGGCA ACAATCAGGA CAAGGACAAC AAGGGTACTA
701 CCCAACTTCC CCGCAACAGT CAGGACAAGG GCAACAACCG GGACAAGGGC
751 AACCAGGGTA CTACCCAACT TCTCCGCAGC AGTCAGGACA ATGGCAGCAA
801 CCAGGACAAG GGCAACAACC AGGACAAGGG CAGCAATCAG GACAAGGGCA
851 ACAAGGTCAG CAGCAGTCAG GACAATGGCA GCAACCAGGA CAAGGGCAAC
901 AACCAGGACA AGGGCAGCAA TCAGGACAAG GGCAACAAGG TCAGCAGCCA
951 GGACAAGGGC AACGACCAGG ACAAGGACAA CAAGGGTACT ACCCAATTTC
1001 TCCGCAACAG CCGGGACAAG GGCAACAATC AGGACAAGGG CAACCAGGGT
1051 ACTACCCAAC TTCTTTGCGG CAGCCAGGAC AATGGCAGCA ACCAGGACAA
1101 GGGCAGCAAC CAGGACAAGG GCAACAAGGT CAGCAGCCAG GACAAGGACA
1151 ACAATCAGGA CAAGGACAAC AAGGATACTA CCCAACTTCT CTGCAACAGC
1201 CAGGACAAGG GCAACAACTG GGACAAGGGC AACCAGGGTA CTACCCAACT
1251 TCGCAGCAGT CGGAACAAGG GCAGCAGCCA GGACAAGGAA AACAACCAGG
1301 ACAAGGACAA CAAGGGTACT ACCCAACTTC TCCGCAACAG TCAGGACAAG
1351 GGCAACAACT GGGACAAGGG CAACCAGGGT ACTACCCAAC TTCTCCACAG
1401 CAGTCAGGAC AAGGACAACA ATCAGGACAA GGACAACAAG GGTACTACCC
1451 AACTTCTCCG CAACAGTCAG GACAAGGGCA ACAACCGGGA CAAGGGCAAT
1501 CGGGGTACTT CCCAACTTCT CGGCAGCAGT CAGGACAAGG GCAGCAGCCA
1551 GGACAAGGAC AACAGTCGGG ACAAGGGCAA CAAGGTCAGC AACCAGGACA
1601 AGGACAACAA GCGTACTACC CAACTTCTTC GCAACAGTCA AGACAAAGGC
1651 AACAGGCAGG ACAATGGCAA CGACCGGGAC AAGGGCAACC AGGGTACTAC
1701 CCAACCTCTC CACAGCAGCC AGGACAAGAG CAACAATCAG GACAAGCGCA
1751 ACAATCAGGA CAATGGCAAC AAGTGTACTA CCCAACTTCT CCGCAACAGC
1811 CAGGCCAATT GCAACAACCA GCACAAGGGC AACAACCAGC ACAAGGGCAA
1851 CAATCAGCAC AAGAGCAACA GCCAGGGGCA ACAAGGGTAC TACCCAACTT
1901 CTCCGCAACA GTCAGGACAA GGGCAACAAG GGTACTACCC AACTTCTCCG
1951 CAACAGTCAG GACAAGGGCA GCAGCCAGGA CAAGGACAAC AGCCAAGACA
2001 AGGGCAACAA GGGTACTACC CAATTTCTCC GCAGCAGTCA GGACAAGGGC
2051 AACAAACAGG ACAAGGGCAA CAAGGATACT ACCCAACTTC TCCGCAGCAG
2101 TCAGGACAAG GGCAACAACC AAGACATGAG CAACAGCCAG GACAATGGCT
2151 GCAACCAGGA CAAGGGCAAC AAGGGTACTA TCCAACCTCT TCACAGCAGT
2201 CAGGACAAGG GCAGCAATCA GGACAAGGGC AACAAGGGTA CTACCCAACT
2251 TCTCTGTGGC AACCAGGACA AGGGCAACAA CCAGGACAAA GGCAACAAGG
2301 CTACGACAGC CCATACCATG TTAGCGCGGA GTACCAGGCG GCCCGCCTAA
2351 AGGTGGCAAA GGCGCAGCAG CTCGCGGCAC GGCTGCCGGC AATGTGCCGG
2401 CTGGAGGGCA GCGACGCATT GTCGGCCAGG CAGTGATAGA ACTCTCTGCA
2451 GCTTGCTTGG TGCTTGGGCA AT
根据该基因的核酸序列推导出的该基因对应的蛋白质的氨基酸序列：
1 MAKRLVLFAAVVVALMALTAAEGEASGQLQCERELRKRELEAYQQVVDQQ
51 LRDVSPGYRPITVSPGTRQYEQQPVVPSKAGSFYPSETTPSQQLQQMIFW
101 GIPALLRRYYPSVTSSQQGSYYPGQAFPQQSGQGQQPGQGQQPGQRQQDQ
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201 QGQQRYYPTSRNSSSRQDKGNNQDKDNKGTTQLPRNSQDKGNNRDKGNQG
251 TTQLLRSSQDNGSNQDKGNNQDKGSNQDKGNKVSSSQDNGSNQDKGNNQD
301 KGSNQDKGNKVSSQDKGNDQDKDNKGTTQFLRNSRDKGNNQDKGNQGTTQ
351 LLCGSQDNGSNQDKGSNQDKGNKVSSQDKDNNQDKDNKDTTQLLCNSQDK
401 GNNWDKGNQGTTQLRSSRNKGSSQDKENNQDKDNKGTTQLLRNSQDKGNN
451 WDKGNQGTTQLLHSSQDKDNNQDKDNKGTTQLLRNSQDKGNNRDKGNRGT
501 SQLLGSSQDKGSSQDKDNSRDKGNKVSNQDKDNKRTTQLLRNSQDKGNRQ
551 DNGNDRDKGNQGTTQPLHSSQDKSNNQDKRNNQDNGNKCTTQLLRNSQAN
601 CNNQHKGNNQHKGNNQHKSNSQGQQGYYPTSPQQSGQGQQGYYPTSPQQS
651 GQGQQPGQGQQPRQGQQGYYPISPQQSGQGQQTGQGQQGYYPTSPQQSGQ
701 GQQPRHEQQPGQWLQPGQGQQGYYPTSSQQSGQGQQSGQGQQGYYPTSLW
751 QPGQGQQPGQRQQGYDSPYHVSAEYQAARLKVAKAQQLAARLPAMCRLEG
801 SDALSARQ
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
蛋白纯化和末端序列分析：
取20mg小麦，放入1.5ml离心管中，加入150ul无水乙醇，5％的巯基乙醇，50度温浴1小时。10％SDS-PAGE分离HMW-GS14亚基蛋白，并以双向电泳鉴定为单点纯。回收目的蛋白，电转印到PVDF膜。通过Procise491型蛋白测序仪进行蛋白末端序列分析。
根据蛋白序列设计引物：
根据蛋白序列通过GCG软件设计简并引物，序列如下
P1 5’-ATG-GCT-AAG-CGC-CTG-GTC-CT-3’
P1 5’-GGC-TAG-CCG-ACA-ATG-CGT-CG-3’
基因的扩增：
CTAB法提取小麦总DNA，利用下述条件扩增目的基因：
基因克隆：
将基因产物通过pGEM-T easy载体进行直接克隆，并通过PCR验证克隆产物是否正确。
序列分析
序列分析通过ABI370测序仪完成。序列结果如下：
1 TCCACCGAGA TGGCTAAGCG CCTGGTCCTC TTTGCGGCAG TAGTCGTCGC
51 CCTCATGGCT CTCACCGCCG CTGAAGGTGA GGCCTCTGGA CAACTACAAT
101 GTGAGCGCGA GCTCCGGAAG CGCGAGCTCG AGGCATACCA ACAGGTGGTG
151 GACCAGCAAC TCCGAGACGT TAGCCCCGGG TACCGCCCCA TCACCGTCAG
201 CCCGGGCACG AGACAATACG AGCAGCAACC TGTGGTGCCG TCCAAGGCCG
251 GATCCTTCTA CCCCAGCGAG ACTACGCCTT CGCAGCAACT CCAACAAATG
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1001 TCCGCAACAG CCGGGACAAG GGCAACAATC AGGACAAGGG CAACCAGGGT
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1101 GGGCAGCAAC CAGGACAAGG GCAACAAGGT CAGCAGCCAG GACAAGGACA
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2451 GCTTGCTTGG TGCTTGGGCA AT
根据该基因的核酸序列推导出的该基因对应的蛋白质的氨基酸序列：
1 MAKRLVLFAAVVVALMALTAAEGEASGQLQCERELRKRELEAYQQVVDQQ
51 LRDVSPGYRPITVSPGTRQYEQQPVVPSKAGSFYPSETTPSQQLQQMIFW
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801 SDALSARQ
克隆出的HMW-GS14基因序列可通过以下方法应用：
1 HMW-GS14基因序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
2 根据HMW-GS14基因序列，可以建立特异简捷的HMW-GS14+15的标记体系，并通过该体系进行定向育种，获得加工品质优良的小麦新品种或新种质。
3 根据HMW-GS14基因序列，还可以构建HMW-GS14酵母表达载体，通过本领域工作人员共知的研究方法将HMW-GS14导入酵母，然后通过在面粉中添加该转基因酵母提高面筋弹性。
为了更清楚的理解和实施本发明发明人给出了以下具体的实施例。
实施例1：HMW-GS14基因克隆。
按本发明的技术方案，选取含有14+15亚基基因的小麦品种，提取该小麦材料的总DNA，根据该序列设计特异的PCR引物，参考上述的PCR条件扩增HMW-GS14基因。
实施例2：基于HMW-GS14基因序列的分子标记辅助育种。
按本发明的技术方案，并根据HMW-GS14基因序列设计特异的示踪HMW-GS14+15的PCR引物，参考上述的PCR条件，建立HMW-GS14+15亚基的分子标记体系。然后利用该标记体系进行定向育种获得含有该亚基的优质小麦新种质和新品种。
实施例3：基于HMW-GS14基因的作物转基因品质改良。
按本发明的技术方案，并根据HMW-GS14基因序列克隆HMW-GS14基因。构建胚乳特异表达的HMW-GS14植物表达载体，然后通过基因枪、农杆菌介导的转化、花粉管通道法等，将HMW-GS14导入小麦或其它粮食作物，最终获得改良后的粮食作物新品种和新种质。
Claims (2)
1.一种小麦高分子量麦谷蛋白14亚基即HMW-GS 14基因的核酸序列，其特征在于，该基因的核酸序列为：
1 TCCACCGAGA TGGCTAAGCG CCTGGTCCTC TTTGCGGCAG TAGTCGTCGC
51 CCTCATGGCT CTCACCGCCG CTGAAGGTGA GGCCTCTGGA CAACTACAAT
101 GTGAGCGCGA GCTCCGGAAG CGCGAGCTCG AGGCATACCA ACAGGTGGTG
151 GACCAGCAAC TCCGAGACGT TAGCCCCGGG TACCGCCCCA TCACCGTCAG
201 CCCGGGCACG AGACAATACG AGCAGCAACC TGTGGTGCCG TCCAAGGCCG
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301 ATATTTTGGG GAATACCTGC ACTACTAAGA AGGTATTACC CAAGTGTAAC
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401 CAGGACAAGG ACAGCAGCCA GGACAAGGAC AGCAACCAGG ACAAAGGCAA
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501 GCAACAGCCA GGACAAGGGC AACAACTGGG ACAAGGGCAA CCAGGGTACT
551 ACCCAACTTC ACAGCAGCCA GGACAAAAGC AGCAGGCAGG ACAAGGGCAC
601 CAATCAGGAC AAGGACAACA AAGGTACTAC CCAACTTCCC GCAACAGTAG
651 CAGCAGGCAG GACAAGGGCA ACAATCAGGA CAAGGACAAC AAGGGTACTA
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801 CCAGGACAAG GGCAACAACC AGGACAAGGG CAGCAATCAG GACAAGGGCA
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901 AACCAGGACA AGGGCAGCAA TCAGGACAAG GGCAACAAGG TCAGCAGCCA
951 GGACAAGGGC AACGACCAGG ACAAGGACAA CAAGGGTACT ACCCAATTTC
1001 TCCGCAACAG CCGGGACAAG GGCAACAATC AGGACAAGGG CAACCAGGGT
1051 ACTACCCAAC TTCTTTGCGG CAGCCAGGAC AATGGCAGCA ACCAGGACAA
1101 GGGCAGCAAC CAGGACAAGG GCAACAAGGT CAGCAGCCAG GACAAGGACA
1151 ACAATCAGGA CAAGGACAAC AAGGATACTA CCCAACTTCT CTGCAACAGC
1201 CAGGACAAGG GCAACAACTG GGACAAGGGC AACCAGGGTA CTACCCAACT
1251 TCGCAGCAGT CGGAACAAGG GCAGCAGCCA GGACAAGGAA AACAACCAGG
1301 ACAAGGACAA CAAGGGTACT ACCCAACTTC TCCGCAACAG TCAGGACAAG
1351 GGCAACAACT GGGACAAGGG CAACCAGGGT ACTACCCAAC TTCTCCACAG
1401 CAGTCAGGAC AAGGACAACA ATCAGGACAA GGACAACAAG GGTACTACCC
1451 AACTTCTCCG CAACAGTCAG GACAAGGGCA ACAACCGGGA CAAGGGCAAT
1501 CGGGGTACTT CCCAACTTCT CGGCAGCAGT CAGGACAAGG GCAGCAGCCA
1551 GGACAAGGAC AACAGTCGGG ACAAGGGCAA CAAGGTCAGC AACCAGGACA
1601 AGGACAACAA GCGTACTACC CAACTTCTTC GCAACAGTCA AGACAAAGGC
1651 AACAGGCAGG ACAATGGCAA CGACCGGGAC AAGGGCAACC AGGGTACTAC
1701 CCAACCTCTC CACAGCAGCC AGGACAAGAG CAACAATCAG GACAAGCGCA
1751 ACAATCAGGA CAATGGCAAC AAGTGTACTA CCCAACTTCT CCGCAACAGC
1801 CAGGCCAATT GCAACAACCA GCACAAGGGC AACAACCAGC ACAAGGGCAA
1851 CAATCAGCAC AAGAGCAACA GCCAGGGGCA ACAAGGGTAC TACCCAACTT
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1951 CAACAGTCAG GACAAGGGCA GCAGCCAGGA CAAGGACAAC AGCCAAGACA
2001 AGGGCAACAA GGGTACTACC CAATTTCTCC GCAGCAGTCA GGACAAGGGC
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2101 TCAGGACAAG GGCAACAACC AAGACATGAG CAACAGCCAG GACAATGGCT
2151 GCAACCAGGA CAAGGGCAAC AAGGGTACTA TCCAACCTCT TCACAGCAGT
2201 CAGGACAAGG GCAGCAATCA GGACAAGGGC AACAAGGGTA CTACCCAACT
2251 TCTCTGTGGC AACCAGGACA AGGGCAACAA CCAGGACAAA GGCAACAAGG
2301 CTACGACAGC CCATACCATG TTAGCGCGGA GTACCAGGCG GCCCGCCTAA
2351 AGGTGGCAAA GGCGCAGCAG CTCGCGGCAC GGCTGCCGGC AATGTGCCGG
2401 CTGGAGGGCA GCGACGCATT GTCGGCCAGG CAGTGATAGA ACTCTCTGCA
2451 GCTTGCTTGG TGCTTGGGCA AT
2.权利要求1所述的小麦高分子量麦谷蛋白14亚基即HMW-GS 14基因的核酸序列通过基因枪或农杆菌介导的转化或花粉管通道法导入小麦，培育出加工品质改善的小麦品种或小麦种质的用途。
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