CN103070067A

CN103070067A - 棉花的基因枪活体快速转化方法

Info

Publication number: CN103070067A
Application number: CN2013100462025A
Authority: CN
Inventors: 叶武威; 王德龙; 阴祖军; 王俊娟; 王帅; 樊宝香; 王桂峰; 孔静静; 宋贵方; 张德超; 陆许可
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明涉及一种棉花的基因枪活体快速转化方法。该方法包括如下步骤：（1）利用基因枪轰击的方法，将含有外源基因的载体轰入父本棉花的花粉中；（2）将基因枪轰击后的父本花粉授粉到活体母本棉花中；（3）授粉后的母本棉花所结的种子便是转基因棉花种子，实现了棉花的基因转化。本发明方法无需组织培养步骤，直接在活体棉花上便实现基因转化。而且本发明方法通过第三代便携式基因枪和优化转化的参数使活体转化时对花蕾和花粉形成微创伤，大大缩短了获得转基因植株的周期。本发明方法实用、易操作、不依赖组织培养、稳定性好。

Description

棉花的基因枪活体快速转化方法

技术领域

本发明涉及一种棉花的基因枪活体快速转化方法。

背景技术

在迄今发展起来的棉花转基因技术中,农杆菌介导的遗传转化应用最为广泛。自1987年Umbeck等通过农杆菌介导法成功获得珂字棉转基因植株后,农杆菌介导法逐渐成为国际上最普遍的转化手段,并且取得很大进展。中国农科院棉花研究所成功建立了20多个棉花品种的高效、稳定的规模化转化体系，实现了流水线操作,建立了高效、工厂化的棉花转基因技术体系。尽管农杆菌介导法是理论和实践都较为完善的一种转化技术,且已被广泛用于双子叶植物的转化,但该方法受宿主基因型范围的限制,很多优良品种（系）很难以此法进行转化，并且转化程序烦琐复杂。花粉管通道转化法虽然没有基因型、种属控制,但其转化技术不太完善,对转化机制缺乏系统的研究,常局限于开花期才能应用。因此，需要发展出有效的基因转化方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种对棉花进行基因转化的方法。

本发明所提供的对棉花进行基因转化的方法，包括如下步骤：

（1）利用基因枪轰击的方法，将子弹轰入父本棉花的花粉中；所述子弹中含有外源基因；

（2）将基因枪轰击后的父本花粉授粉到活体母本棉花中；

（3）授粉后的母本棉花所结的种子便是转基因棉花种子，实现了棉花的基因转化。

上述方法中，所述步骤（1）中，所述父本棉花的花粉是先从父本棉花中收集下来再进行基因枪轰击的。

上述方法中，所述基因枪轰击的方法为：将0.2-0.5克花粉均匀铺至花粉槽底部，然后进行基因枪轰击，基因枪的轰击参数为30Psi（轰击压力）+6cm（轰击距离）。

上述方法中，所述子弹按照如下方法制备：

将30mg金粉与500μl水混合，得到金粉悬浮液；

将100μl金粉悬浮液与10μl浓度为1mg/ml的插入外源基因的载体溶液混合，得到金粉与基因的混合液；

向金粉与基因的混合液中逐滴加入40μl0.1mol／L亚精胺，并混匀，逐滴加入100μl2.5mol/L CaCl₂，混匀；离心，去上清，收集沉淀；

向所述沉淀中加入200μl无水乙醇重悬，离心，去上清，收集沉淀；

向所述沉淀中加入100μl无水乙醇，得到基因枪轰击子弹。

上述方法中，所述基因枪轰击中，每枪使用10μl子弹。

上述方法中，所述基因枪为美国wealtec的型号为GDS-80的基因枪。

本发明方法无需组织培养步骤，直接在活体棉花上便实现基因转化。而且本发明方法通过第三代便携式基因枪和优化转化的参数使活体转化时对花蕾和花粉形成微创伤，大大缩短了获得转基因植株的周期。本发明方法实用、易操作、不依赖组织培养、稳定性好。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例、

1、含有外源基因的重组载体的制备

外源基因是GhTrx基因。

含有外源基因的重组载体的构建：用XmaⅠ和BamHⅠ酶切载体pBI121，收集载体大片段；将载体大片段和基因片段用T4连接酶进行连接，得到重组载体。

2、基因枪子弹制备：

金粉处理

（1）取30mg金粉置于离心管中，加入lml70%乙醇，充分振荡3－5min，静置15min，

（2）以12000rpm离心30s，去上清，

（3）加入lml无菌水重悬以12000rpm离心5s，去上清，

（4）重复上述步骤5-7次，将金粉悬浮于500μl无菌蒸馏水中，置4℃或室温下储存。

DNA的处理

（1）取100μl金粉悬浮液，加入10μl的质粒DNA(1mg/ml)溶液。

（2）0.1mol／L亚精胺(所用的溶液经无菌消毒)、2.5mol/L CaCl₂和无水乙醇冰浴。逐滴加入40μl0.1mol／L亚精胺，并混匀。逐滴加入100μl2.5mol/L CaCl₂，振荡1min。

（3）以12000rpm离心30s，去上清，加入200μl无水乙醇重悬金粉，振荡30s，以12000rpm离心30s，去上清。

（4）加入100μl无水乙醇重悬金粉，可供10枪(每枪10μl)使用。

3、基因枪轰击

基因枪为美国wealtec的基因枪GDS-80。

安装气罐并对气罐和压力调节表之间漏气检测、压力调节表和GDS-80连接管之间漏气检测多次漏气检测后，确保连接紧密，从而进行实验。

（1）父本棉花为中H177。收集父本棉花的花粉。

（2）每次轰击花粉量0.2-0.5克，将花粉薄薄的均匀至于花粉槽底部。便携式基因枪轰击花粉参数为30Psi+6cm（轰击出来的气体面积覆盖花粉槽，保证95%花粉被轰击）。

（3）母本棉花为中H177。将轰击后的花粉授粉到活体母本棉花，并统计结铃数。

（4）收获T₀代种子。

（5）收获T₀代种子后种植于温室，3叶期后用卡纳筛选，选择具有抗卡那的植株，再取样进行分子鉴定，分子鉴定选择pBI121特异启动子筛选引物（35S-F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC，35S-R1:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC）。

结果，卡那筛选阳性且分子鉴定也为阳性的种子数为168粒。本发明方法的转化效率为6%。转化效率=阳性种子数/所有用于检测的种子数。

用棉花YU2067和棉花H19进行试验，也得到了类似的转化效率。使用其它外源基因进行试验，也得到了类似的转化效率。

Claims

1.一种对棉花进行基因转化的方法，包括如下步骤：

（1）利用基因枪轰击的方法，将子弹轰入父本棉花的花粉中；所述子弹含有外源基因；

（2）将基因枪轰击后的父本花粉授粉到活体母本棉花中；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述父本棉花的花粉是先从父本棉花中收集下来再进行基因枪轰击的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因枪轰击的方法为：将0.2-0.5克花粉均匀铺至花粉槽底部，然后进行基因枪轰击，基因枪的轰击参数为30Psi+6cm。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述子弹按照如下方法制备：

将30mg金粉与500μl水混合，得到金粉悬浮液；

将100μl金粉悬浮液与10μl浓度为1mg/ml的含有外源基因的载体溶液混合，得到金粉与基因的混合液；

向金粉与基因的混合液中逐滴加入40μl0.1mol／L亚精胺溶液，并混匀，逐滴加入100μl2.5mol/L CaCl2溶液，混匀；离心，去上清，收集沉淀；

向所述沉淀中加入100μl无水乙醇，得到基因枪轰击子弹。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述基因枪轰击中，每枪使用10μl子弹。