CN101016553A - 一种用于植物直接基因转化的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于植物直接基因转化的组合物、转化方法及其应用，组合物包括(1)目的基因及其表达调控元件的游离核酸组分，(2)转化缓冲液，和(3)转化辅助组分。转化方法是通过共培养，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，喷施，蘸花方法转化；也可以通过基因枪轰击、超声波、电击方法转化。组合物可应用于针对受体植物细胞，包括受精卵、悬浮细胞、原生质体、单层细胞、叶肉细胞的直接转化，针对受体植物组织，包括未成熟胚、胚性愈伤组织、分生组织的直接转化，用于针对种子的直接转化和可应用于针对受体植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位转化。本发明对于植物遗传育种、品种改良或基因功能分析具有重要的意义。

Description

一种用于植物直接基因转化的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于植物直接基因转化的组合物及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

植物基因工程是在分子生物学深入发展和重组DNA技术日趋完善的基础上发展起来的。在植物抗病、抗虫、抗莠和改变植物的某些成分方面得到不少转基因植物，有的已形成品系，为提高作物产量、抗逆能力、改进品质，进行快速、优质、稳产的良种选育提供了全新途径。在高等植物基因工程研究中，外源基因的转移是极为重要的一环。由于植物及其细胞自身的特殊性，因而对基因转移方法也有一些特殊的要求。纵观诸多外源基因转移方法，按照载体的形式可以分为两大类：即用含外源基因Ti质粒的根癌农杆菌侵染植物和用含外源基因的DNA直接转化植物。含外源基因DNA的直接转化是用物理，化学和生物手段将裸露的外源DNA导入植物细胞组织或器官，并使外源DNA所包含的基因在植物细胞内进行表达。这一方法从根本上克服了Ti质粒只能侵染双子叶植物的缺陷，使受体植物范围大大扩展。

在植物基因工程的发展中，研究最清楚和应用最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化。1974年，人们发现根癌农杆菌在感染植物时，可将其中环状的Ti质粒上的一段DNA插入植物基因组中，引起植物遗传特性的变化。从此，人们开始尝试利用这种天然的载体系统，将外源基因导入植物细胞，并利用植物细胞的全能性，借助于细胞培养或组织培养技术，使转化细胞再生成完整的转基因植株，从而实现外源基因对植物的遗传转化。1983年获得了第一例转基因植物。1985年，Horsh等人首创叶盘转化法，使得转化过程大为简化。此后，因该方法因具有转基因低拷贝，遗传稳定以及能够转化大片段DNA等优点而得到广泛使用。目前，在众多的转基因植物中80％是由农杆菌介导转化的。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，它含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA(又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，这段DNA可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到50kb的外源基因。因此，Ti质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。Ti质粒上T-DNA的转移必须借助于Ti质粒上vir基因编码产生的毒蛋白virD2/E2virD2和virE2的作用才能实现转化。但农杆菌转化一般需要经过组织培养，受到受体植物类型，以及再生系统建立的限制。

基因枪法是目前直接转化法中最为广泛使用的一种方法，该法又称粒子轰击(particlebombardment)，高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功。并在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将TMV(烟草花叶病毒)RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制，并以同样技术将CAT(氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。该方法具有应用面广，方法简单，转化时间短，由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高。

花粉管通道法，最早是由周光宇1983年建立。在植物授粉后一定时间，将外源DNA注入棉花子房的中胚胎部位，使DNA沿着已形成的花粉管通道进入胚囊，从而转化尚不具备正常细胞壁的受精卵或胚细胞。由于该方法有的是采用总DNA进行导入，后代的变异是随机的，加之很多的试验缺少分子验证，而且对于外源DNA整合的机制难以解释清楚，所以对于花粉管通道方法的广泛使用还存在着争议。此外，由于设计原理和操作规程本身的限制，外源的转化元件是裸露的DNA，在其通过花粉管进入胚囊，通过受精卵的细胞膜、核膜完成整合的过程中，非常易于被降解，而且外源DNA进入胚囊主要依赖于重力和渗透作用，外源DNA缺乏整合进受体基因组的根本动力，转化效率低，所产生的转基因植株其后代不能稳定的遗传等问题。

化学法一般利用植物原生质体，在没有载体的情况下，借助一些化学试剂的诱导能吸收外源DNA，质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。常用的化学试剂有PEG(聚乙二醇)，PLD(多聚鸟氨酸)，PVA(聚乙稀醇)等，其中最为常用的是PEG。应用这一方法，在植物细胞中首次进行直接基因装移的是戴维(Davey)和Krens等。化学法打破了根癌农杆菌侵染范围的限制，使之可以广泛应用于多种单子叶的禾谷类植物，目前已实现了对栽培一粒小麦，多年生黑麦，水稻，高粮和小麦等原生质体以及双子叶植物油菜，烟草和矮牵牛的转化。但单独应用化学法进行转化较难成功，转化效率低。化学法研究的时间比较长，方法较成熟，且成本低、重复性好、易于推广。但由于原生质体再生频率较低，培养难度大，周期长，因而使这一方法的普及受到限制。

同时，目前广泛应用的基因枪和农杆菌介导的植物转化方法，始终存在选择标记基因和载体骨架序列等非目的基因外源DNA片段引起的潜在安全性问题。而以消除选择标记基因和载体骨架序列为目标，国内外许多实验室近年来采用了多种策略进行大量的研究和不断的改进并且取得了一些进展。

因此探讨建立一种新的可以完全消除非目的基因外源DNA片段的安全、实用、简便、高效、稳定，且不需经过组织培养，受体范围广的直接转化系统具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于植物直接基因转化的组合物和该组合物的安全、简便、高效的直接基因转化方法以及该组合物的的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种用于植物直接基因转化的组合物，该组合物含有：(1)目的基因及其表达调控元件的游离核酸组分，包括质粒DNA或不含载体骨架的线性DNA片段；(2)转化缓冲液，包括1/2MS液体培养基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC缓冲液；(3)转化辅助组分包括0.005％-0.02％的表面活性剂DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca²⁺，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。转化辅助组分还包括0.1％硼酸、根癌农杆菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。根癌农杆菌是指含有Vir区、Con区和Ori区，但不含有T-DNA转移区的Ti质粒。VirD2蛋白和VirE2蛋白通过乙酰丁香酮诱导分泌获得。质粒DNA是指具备完整的复制起点、目的基因、表达调控元件和边界序列的环状DNA或具备完整的复制起点、目的基因、表达调控元件，但不含有边界序列的环状DNA。线性DNA组分是指包含边界序列、目的基因及其表达调控序列的线性DNA片段或包含目的基因及其表达调控序列，但不包含边界序列的线性DNA片段。质粒DNA和线性DNA在组合物中游离存在，不需要转导入根癌农杆菌中。线性DNA组分包括双链DNA线形片段或单链DNA线形片段。双链DNA线性片段可通过PCR方法从目的质粒上扩增所获得或从目的质粒上通过酶切获得。单链DNA片段由双链DNA通过99℃变性后0℃迅速降温所获得。

一种用于植物直接基因转化的组合物的转化方法，可以通过共培养，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，喷施，蘸花方法转化；也可以通过基因枪轰击、超声波、电击方法转化。

该组合物可应用于针对受体植物细胞，包括受精卵、悬浮细胞、原生质体、单层细胞、叶肉细胞的直接转化，可应用于针对受体植物组织，包括未成熟胚、胚性愈伤组织、分生组织的直接转化，也可应用于针对种子的直接转化和可应用于针对受体植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位转化。

本发明提供的植物基因转化组合物及其在直接转化中的应用，其核心技术在于提供的包含游离核酸组分、转化缓冲液和转化辅助组分的转化组合物，能够解决直接转化中所面临的目的基因转化动力、转运、保护和整合的一系列问题。

本发明所提供的转化辅助组分，主要包括表面活性剂Dow Corning Q2-5211，Ca²⁺，生长调节剂2，4-D或6-BA，硼酸，以及经乙酰丁香酮诱导的根癌农杆菌所分泌到胞外的VirD2蛋白和VirE2蛋白。转化辅助组分的结合使用，可以在转化中起到提供转化动力，核定位，以及保护和促进整合的作用。

Dow Corning Q2-5211超级润湿剂是一种低分子量的非离子聚醚改性有机硅表面活性剂，当浓度为0.01％时，Dow Corning Q2-5211超级润湿剂可以使表面张力降低至23dynes/cm，这使得转化缓冲液可以迅速湿润，并在难以湿润的外植体比如蜡状叶子表面上迅速扩散并被外植体所吸收，可以显著提高转化缓冲液的润湿性、延展性和渗透性，从而有助于提高转化的效率，并安全无毒，是理想的转化动力来源。在本发明中，DOW CORNING Q2-5211的浓度范围为0.005％-0.02％。

DNA可以通过钙盐的形式沉积在细胞的表面，并通过引发胞吞作用，实现DNA的转移。用10mmol/L-50mmol/L的CaCl₂(或磷酸钙)处理受体细胞，可以引起细胞膨胀，增大细胞的通透性，使受体细胞易于接受外源DNA，提高转化效率。在本发明中Ca²⁺的浓度范围是10mmol/L-50mmol/L。

2，4-D和6-BA在低浓度下均为植物生长调节物质，有助于细胞处理旺盛的生长和分裂状态，处于旺盛分裂期的细胞更有助于接受外源的DNA，提高转化效率。本发明中2，4-D的浓度范围是1-10ppm；6-BA的浓度是0.5ppm。

硼是一种向化性物质，可以引导花粉管由柱头到胚株的转移，在针对花器官的转化中，在本发明中加入0.1％硼酸可以有助于转化元件经柱头或子房表面到到胚株，完成外源基因的定向传输和整合。

本发明所提供的转化辅助组分中，特别利用农杆菌诱导表达的毒蛋白virD2和virE2实现游离核酸向受体的转移，核定位、保护及整合。毒蛋白virD2可以协助带有T-DNA左右边界序列的目的基因及其调控序列完成转移、核定位及在植物基因组中的整合；virE2可以在细胞膜，及核膜上建立单链特异性的通道，并与单链核酸的结合起到稳定和保护的作用，virE2具有核定位信号，协助virD2-单链核酸复合物向植物细胞核的定位和整合，解决目前游离核酸直接转化过程中易被降解、转化多拷贝、转化效率低、重复性差等多种问题。

本发明使用只含有Vir区、Con区和Ori区，但不含有T-DNA转移区的农杆菌Ti质粒。virD2和virE2蛋白的诱导表达主要通过以下技术方案来实现：含有Ti质粒的农杆菌LBA4404或GV3101，接种于含有50mg/L的利福平和25mg/L的链霉素的YEB培养基中，于28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD550为1.8-2.0)；将培养好的菌液在5000rpm条件下离心I0min，菌体重新悬浮于1/2MS液体培养基制成菌液，稀释后的菌液浓度约为2×10⁸cfu/ml，然后向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为20mg/L，继续在28℃和250rpm条件下摇动培养3-4个小时，3000rpm条件下离心10min离心去除菌体，上清液为含有virD2和virE2的转化缓冲液。

农杆菌virD2/virE2蛋白辅助的直接转化包括两种方式。一种是针对受体植物的细胞、组织的转化。该转化体系的主要技术路线是：(1)样品前处理：受体细胞或组织在预转化前于70％的乙醇消毒1分钟，MS培养基冲洗一次，升汞消毒10分钟，MS冲洗数次，然后可选择置于高渗缓冲液中处理10-20分钟，高渗缓冲液的组成为MS液体培养基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇。(2)转化：将处理后的受体细胞或组织与含有游离转化元件、转化缓冲液和经乙酰丁香酮诱导的Ti质粒菌液，或含有virD2和virE2的转化辅助溶液的转化组合物中培养30min-1h。(3)瞬时表达分析：将外植体取置于含有0.5ppm 6-BA的MS分化培养基中在20-24℃条件下黑暗共培养1-3天，根据编码基因的特性，选择适当的方法检测该基因的瞬时表达。如上述的转化组合物中添加终浓度为0.005％-0.02％的的DOW CORNINGQ2-5211，10mmol/L-100mmol/L的CaCl₂，1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA等转化辅助组分，可以进一步提高转化效率。第二种是针对花器官的直接原位转化。可借助花粉管通道法、子房注射，或子房滴注法，实现植物原位转化。该转化方法的主要技术路线是：将含有游离转化元件、转化缓冲液和经乙酰丁香酮诱导的Ti质粒菌液，或含有virD2和virE2的转化辅助溶液的转化组合物直接滴加到切割过的柱头或子房表面，或注射入柱头或子房的内部，实现游离核酸对合子的转化，收获的种子中即可能包含有转化基因，收获种子直接成株后，经筛选分析，可以获得稳定持续的转基因后代。该方法不需要经过组织培养过程，简便、高效，成本低廉。同样，在转化组合物中添加终浓度为0.005％-0.02％的Dow Corning Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L的CaCl₂；0.1％硼酸；1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA，可以进一步提高转化效率。

本发明中提供的含有目的基因及其表达调控元件的游离核酸组分主要包括质粒DNA组分和线性DNA组分。质粒DNA是指具备完整的复制起点、表达调控元件、包含(或不包含)边界序列的环状DNA，在本发明中质粒不需要转导入菌体中，在转化组合物中以溶液形式游离存在。线性DNA组分是指包含(或不包含)边界序列、目的基因及其调控序列的线性DNA片段，在转化组合物中也以溶液形式游离存在。

边界序列主要指Ti质粒中T-DNA左右边界的保守序列，在目的基因及其调控序列两端加入T-DNA左右边界的保守序列，有利于VirD2的识别，及在植物受体中的定位和整合。在本发明中，加入目的基因启动子之前序列为T-DNA右边界，其保守序列为：5-gtttacccgccaatatatcctgtca；加入到目的基因终止子之后的序列为T-DNA左边界，其保守序列为：5-tgtttacaccacaatatatcctgcca。本发明提供的线性DNA可以是单链的DNA也可以双链的DNA。双链的线性片段可通过PCR方法从目的质粒上扩增所获得，或从目的质粒上通过酶切获得。单链DNA片段主要通过双链DNA 99℃变性后0℃迅速降温所获得。

本发明的有益效果是，本发明提供的植物基因转化组合物及其在直接转化中的应用，能够解决直接转化过程中，目的基因所面临的转化动力、定位、保护和整合的一系列问题。利用仅由表达调控序列和目的基因组成的线性片段，可以实现无选择标记基因、无载体骨架序列的转化过程，具有生物安全性；针对花器官的直接原位转化，可以实现无组织培养的转化过程，从而避免了植株再生系统建立的瓶颈，扩大了转化受体的范围。因此，本发明提供的植物基因转化组合物对于植物遗传育种、品种改良或基因功能分析具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例1：GUS基因在洋葱表皮细胞中的快速高效的瞬间表达

取洋葱下表皮用刀片划为适当大小的组织块，于70％的乙醇消毒1分钟，MS培养基冲洗一次，升汞消毒5分钟，MS冲洗数次，然后置于高渗缓冲液MS液体培养基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇中预处理10-20分钟。

含有Ti质粒的农杆菌，接种于含有抗生素的YEB培养基中，于28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD₅₅₀为1.8-2.0)；③将培养好的菌液在5000rpm条件下离心10min，然后菌体重新悬浮于1/2MS液体培养基(附加乙酰丁香酮20mg/L)+转化元件+0.01％的Dow corning Q2-5211+10mmol/L的CaCl₂+0.1mmol/L亚精氨，稀释后的菌液浓度约2×10⁸cfu/ml；转化元件为带有RB+35S+GUS+NOS+LB的线性片段；④将经过预处理的洋葱下表皮置于菌液中，25-26℃条件下缓慢摇动1.5h；⑤取出洋葱下表皮转入MS培养基(乙酰丁香酮200p mol/L)上，25-26℃共培养36-48小时；⑥将共培养后的洋葱下表皮，用无菌水洗3次，再用附加500mg/L头孢霉素的无菌水洗1次，用无菌滤纸吸干水分；⑦将洋葱表皮置于96孔板中，每孔放置一片洋葱表皮，铺平后，表面滴加X-gluc20微升，然后置于37℃培养箱中1-12个小时，于体视显微镜下观察记录GUS基因的表达情况。结果表明，洋葱表皮在农杆菌分泌的毒蛋白virD2/E2的介导下，能够有助于目的基因及其调控序列进入到细胞核内部，目的基因在其调控序列的作用下能够实现目的基因的瞬间表达，且表达的GUS蛋白在细胞中呈均匀分布。瞬间表达蛋白的细胞有60-80％。

实施例2：含有GUS基因的线性片段通过花粉管通道法的高效稳定转化

带有农杆菌毒蛋白virD2/E2的缓冲液的制备：含有Ti质粒的农杆菌LBA4404，接种于含有50mg/L的利福平和25mg/L的链霉素的YEB培养基中，于28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD₅₅₀为1.8-2.0)；将培养好的菌液在5000rpm条件下离心10min，菌体重新悬浮于1/2MS液体培养基制成菌液，稀释后的菌液浓度约为2×10⁸cfu/ml，然后向菌液中加入乙酰丁香酮至终浓度为20mg/L，继续在28℃和250rpm条件下摇动培养3-4个小时，3000rpm条件下离心10min离心去除菌体，上清液为带有virD2和virE2的缓冲液。然后将缓冲液中加入终浓度分别为0.01％的Dow Corning Q2-5211、10mmol/L的CaCl2、0.1％硼酸和0.5ppm的6-BA制作成转化缓冲液。

转化元件的获得：以pBI121-GUS质粒为模板，使用含有T-DNA边界序列的引物PT1/PT2进行PCR扩增，构建基因转化元件。PT1：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3’，PT2：5’-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，使用高保真LaTaq酶进行PCR扩增。反应条件如下：95℃，5min后，94℃30s，55℃1.5min，72℃，1.5min共30个循环，72℃7min；PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，加入二倍体积无水乙醇，及1/10体积的3M的NaAc进行沉淀，定量，溶于带有毒蛋白virD2/E2的转化缓冲液中，终浓度为100ngμl-1，用于进一步的转化。

在大豆自花授粉后6-32小时(花冠略高于花萼1mm左右)完整切除柱头，将5ul转化缓冲液滴于切口处。若气温较高，补滴一次。标记处理的花朵，并剪除未进行操作的花朵。成熟后收获种子。以只含1/2MS转化缓冲液的处理作对照。利用PCR、Southern杂交等分子手段对收获的种子及其后代进行检测，结果表明在毒蛋白virD2/E2介导的转化缓冲液的作用下，线性片段以单拷贝的形式稳定整合到大豆的基因组中。

Claims (16)

1、一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，该组合物含有：(1)目的基因及其表达调控元件的游离核酸组分，包括质粒DNA或不含载体骨架的线性DNA片段；(2)转化缓冲液，包括1/2MS液体培养基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC缓冲液；(3)转化辅助组分包括0.005％-0.02％的表面活性剂DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca²⁺，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。

2、根据权利1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的转化辅助组分还包括0.1％硼酸。

3、根据权利1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的转化辅助组分还包括根癌农杆菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。

4、根据权利3所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的根癌农杆菌是指含有Vir区、Con区和Ori区，但不含有T-DNA转移区的Ti质粒。

5、根据权利3所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的VirD2蛋白和VirE2蛋白通过乙酰丁香酮诱导分泌获得。

6、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的质粒DNA是指具备完整的复制起点、目的基因、表达调控元件和边界序列的环状DNA或具备完整的复制起点、目的基因、表达调控元件，但不含有边界序列的环状DNA。

7、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的线性DNA组分是指包含边界序列、目的基因及其表达调控序列的线性DNA片段或包含目的基因及其表达调控序列，但不包含边界序列的线性DNA片段。

8、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的质粒DNA和线性DNA在组合物中游离存在，不需要转导入根癌农杆菌中。

9、根据权利要求7所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的线性DNA组分包括双链DNA线形片段或单链DNA线形片段。

10、根据权利要求9所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的双链DNA线性片段可通过PCR方法从目的质粒上扩增所获得或从目的质粒上通过酶切获得。

11、根据权利要求9所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，所述的单链DNA片段由双链DNA通过99℃变性后0℃迅速降温所获得。

12、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物的转化方法，其特征在于，可以通过共培养，浸泡，表面涂抹，注射，滴注，喷施，蘸花方法转化；也可以通过基因枪轰击、超声波、电击方法转化。

13、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，该组合物可应用于针对受体植物细胞，包括受精卵、悬浮细胞、原生质体、单层细胞、叶肉细胞的直接转化。

14、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，该组合物可应用于针对受体植物组织，包括未成熟胚、胚性愈伤组织、分生组织的直接转化。

15、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物，其特征在于，该组合物可应用于针对种子的直接转化。

16、根据权利要求1所述的一种用于植物直接基因转化的组合物的应用方法，其特征在于，该组合物可应用于针对受体植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位转化。