KR100454047B1

KR100454047B1 - 꽃밥과 화분에서 발현하는 프로모터 서열

Info

Publication number: KR100454047B1
Application number: KR10-2000-7013267A
Authority: KR
Inventors: 히고켄이치; 이와모토마사오
Original assignee: 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2004-10-26
Also published as: CA2329510A1; US6576815B1; EP1081223A1; KR20010106119A; JP3665813B2; EP1081223B1; AU747939B2; EP1081223A4; DE69931255T2; WO2000058454A1; CN1309704A; DE69931255D1; CA2329510C; AU2958399A

Abstract

꽃밥 및/또는 화분에 있어서 이종유전자를 특이적으로 발현시키기 위한 식물발현용 카셋트가 제공된다. 이 발현용 카셋트는, 서열번호1로 나타내어지는 서열, 또는 그 일부를 갖는 서열로서 서열번호1의 서열과 동등한 프로모터활성을 갖는, 벼 CatA 유전자 프로모터를 포함하고, 그 위에 이종유전자가 이 프로모터와 발현가능하게 접속되도록, 이종유전자를 삽입하기 위한 부위를 포함한다.

이종유전자를 포함하는 재조합 플래즈미드, 및 재조합 플래즈미드를 이용하여 이종유전자를 식물에 도입하는 방법도 또한 제공된다.

Description

꽃밥과 화분에서 발현하는 프로모터 서열{PROMOTER SEQUENCES EXPRESSED IN ANTHERS AND POLLENS}

품종사이의 교배로 생기는 F1하이브리드(hybrid)(잡종 제1대)가 부모보다도 뛰어난 특성을 나타내는 것이 있는 것으로 알려져 있고, 작물의 품종개량 방법으로서 종래부터 주목되어 있었다. 벼 등의 자가수분(自家受粉)을 행하는 작물에 있어서는, 이 성질을 이용하기 위해 필요한 기술의 하나로서, 화분이 임성(稔性)을 가지지 않는 웅성(雄性)불임계통의 작출(作出)방법이 연구되고 있다. 종래는, 식물유전자원(資源)중에서 웅성불임계통을 찾거나, 돌연 변이를 유발하여 웅성불임계통을 선발하기도 하였지만, 실용품종에 그 유전자를 도입하는 것은 용이하지 않고, 이용은 한정되어 있었다.

최근에 와서, 바이오테크놀로지(Biotechnology)를 이용한 방법으로서, 꽃밥 및/또는 화분에서 발현하는 프로모터에 이들의 기관(器官) 형성을 저해하는 기능을 가지는 유전자{예컨대, 누클레아제(nuclease), 프로테아제(protease), 글루카나제(

glucanase)등을 코드(code)하는 유전자}를 연결하여 식물에 도입하고, 임성이 있는 화분형성을 저지하는 방법이 제안되어 있다{예컨대, Mariani들, Nature 347:737-741(1990)}. 혹은, 꽃밥 및/또는 화분에서 발현하는 프로모터를 이용하여, 이들의 기관 형성시에 발현하는 유전자의 앤티센스(anti-sense)RNA를 전사(轉寫)시키거나, 이들의 mRNA를 분해하는 리보자임(ribozyme)을 도입하는 방법이 유망시되고 있다.

꽃밥 및/또는 화분에서 발현하는 유전자의 프로모터는, 토마토, 애기장대(Arabidopsis thaliana), 옥수수 등으로 수(數) 종류가 알려져 있다{예컨대, Twell들, Plant Physiol. 91: 1270-1274(1989); Paul들, Plant Molecular Biology 19:611-622(1992); Guerrero들, Mol.Gen.Genet. 224:161-168(1990)}. 그러나, 그 활성은, 실용적으로 이용되기에는 낮다고 하는 문제점이 있다. 그 위에, 꽃밥 및/또는 화분의 형성을 인위적으로 제어하기 위해서는, 이들 기관의 각 발생단계의 어느 것인가에서 기능하는 프로모터를 단리(單離)하고, 각각의 특징을 명확히 한 뒤에, 높은 활성을 가진 프로모터 함유 카셋트(cassette)를 작성할 수 있으면, 대단히 유용하다.

따라서, 벼의 유전자로부터, 활성이 높고, 실용적으로도 사용될 수 있는 꽃밥 및/또는 화분용의 프로모터를 취득할 수 있으면, 벼 등의 작물을 포함하는 유용식물의 품종개량에 크게 공헌할 수 있다.

본원 발명은, 식물유전자의 프로모터(promoter)를 이용하는, 유용식물의 육종(育種)에 관한 것이다. 더 상세하게는, 벼의 카타라제(catalase)유전자A(이하, CatA라고 한다)의 프로모터유전자를 이용하는 유용식물의 육종에 관한 것이다.

도 1은, 플래즈미드 CatA-GUS-△O의 작제(作製)를 나타내는 모식도이다.

도 2는, 각 프로모터의 활성을 비교한 도면이다.

도 3은, 꽃밥의 GUS조직염색(染色)의 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는, 화분의 GUS조직염색의 결과를 나타내는 사진이다.

본원 발명은, 유전자 공학적 수법에 의한 식물의 육종에 관하며, 그 목적은, 꽃밥 및/또는 화분에서 높은 활성을 갖는 식물유전자 프로모터를 함유하는, 식물발현용 카셋트 및 재조합 플래즈미드(plasmid), 및 그 이용방법을 제공하는 데 있다.

본원 발명자들은, 벼의 카타라제A(CatA)유전자가 꽃밥 및 화분에서 높은 프로모터활성을 나타내는 것을 찾아내고, 이 지견(知見)에 의거하여 본원 발명을 완성한 것이다.

본원 발명은, 꽃밥 및/또는 화분에서 이종(異種)유전자를 특이적으로 발현시키기 위한 식물발현용 카셋트를 제공한다. 이 발현용 카셋트는, 서열번호1에서 나타내어지는 서열, 또는 그 일부를 갖는 서열로서 서열번호1의 서열과 동등한 프로모터활성을 가지는 벼 CatA유전자 프로모터를 포함하고, 다시 이종유전자가 이 프로모터와 발현 가능하게 접속되도록, 이종유전자를 삽입하기 위한 부위를 포함한다. 여기서, 서열번호1에서 나타내어지는 서열은, 벼 CatA구조 유전자의 5'상류역(上流域) 및 제1 인트론(intron)을 포함하는 서열이다.

본원 발명은 또, 꽃밥 및/또는 화분에서 이종유전자를 특이적으로 발현시키기 위한 재조합 플래즈미드를 제공한다. 이 재조합 플래즈미드는, 서열번호1에서 나타내어지는 서열, 또는 그 일부를 갖는 서열로서 서열번호1의 서열과 동등한 프로모터활성을 가지는 벼 CatA유전자 프로모터를 포함하고, 다시 이 프로모터와 발현 가능하게 접속된 이종유전자를 포함한다.

본원 발명은 그 위에, 꽃밥 및/또는 화분에서의 특이적인 발현이 소망되는 이종유전자를 식물에 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기의 재조합 플래즈미드로 식물세포를 형질 전환하는 공정 및 형질 전환된 식물세포를 재분화(再分化)시켜 식물체를 얻는 공정을 포함한다.

상기의 이종유전자는, 꽃밥 및/또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 가지는 유전자일수 있다. 이러한 유전자를 상기 방법에서 사용하는 것에 의해, 웅생불임식물을 작제(作製)할 수 있다. 또한, 상기 방법에서, 식물세포는 단자엽(單子葉) 식물세포 또는 쌍자엽(雙子葉) 식물세포 중 어느 것인가일 수 있다.

본원 발명에 관해서, 이하에, 보다 상세히 설명한다.

(벼 CatA유전자 프로모터의 단리)

벼의 카타라제A(CatA)유전자의 단리 방법, 및 본원 발명의 프로모터 영역을 포함하는 게노믹(genomic) CatA유전자의 염기(鹽基)서열은, 본원 발명자들에 의해 일본 농예 화학회 1992년 대회 강연 요지집: 일본 농예 화학회지66(3),488(1992), 및 Higo들, Plant Molecular Biology 30:505-521(1996)에서 발표되어 있다. 다만, 꽃밥 및 화분에서의 CatA유전자 발현의 유무, 및 형질 전환 벼의 해석에 관해서는, 발표되어 있지 않다.

벼 CatA 유전자 프로모터는, 벼의 게노믹 라이브러리(library)로부터 스크리닝(screening)될 수 있다. 미국 클론텍사(CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto,CA)가 시판하고 있는 벼의 게노믹 DNA 라이브러리(Rice Genomic Library)가 이용될 수 있다.

스크리닝용의 프로브(probe)로서는, 본원 발명자들이 단리한 벼 CatA cDNA가 이용될 수 있다. 벼 CatA cDNA의 단리방법 및 염기서열은, 본원 발명자들에 의해 이미 발표되어 있다{Mori들, Plant Molecular Biology 18:973-976(1992)}.

우선, 파지(phage)λ를 이용하여 작성된 벼 게노믹 유전자 라이브러리를 대장균에 감염시켜 플래크(plaque)를 형성시킨다. 이 플래크를 상법(常法)에 따라서, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 등의 멤브레인(membrane)으로 이동하고, 표식한 스크리닝용 프로브로 혼성화(hybridize)시킨다. 혼성화 종료 후, 세정하고, 오토라디오그래피(autoradiography)에 걸쳐, 혼성화된 것이 확인된 파지(phage)로부터 DNA를 조제한다.

조제한 파지 DNA를, 적당한 제한효소를 조합하여 소화하고, 그 소화물을 아가로스(agarose) 겔(gel) 전기 영동(泳動)으로 분리한다. 분리한 DNA 단편(斷片) 을 나일론(nylon) 멤브레인으로 이동하여, 상기의 스크리닝용 프로브와 혼성화시켜, 시그널(signal)의 강함과 밴드패턴(band pattern)의 상위(相違)에 의거하여, 스크리닝한다.

가장 시그널이 강한 클론(clone)은 CatA유전자를 포함하고, 약한 시그널의 클론은 CatA에 유사해 있지만 CatA가 아닌 유전자를 포함하고 있다고 생각된다. 또한, 밴드패턴의 비교에 의해, 유전자의 일부가 결손된 클론을 식별할 수 있다. 그 위에, 밴드패턴에 의거하는 각 클론의 물리지도를 작제하는 것에 의해, 프로모터를구성한다고 추정되는 구조유전자의 5'상류역의 길이가 약 1.5 Kbp정도의 클론을 특정할 수 있다.

이상과 같이 하여, 완전한 CatA 게노믹 유전자가, 단리될 수 있다.

CatA 게노믹 유전자의 염기서열을 CatA cDNA의 염기서열과 비교함으로써, 프로모터영역이 특정될 수 있다. 프로모터 서열로서는, 게노믹 유전자가 인트론을 갖는 경우는, 구조 유전자의 5'상류역 뿐만이 아니라, 제1인트론 등의 영역도 포함할 수 있다.

(GUS 활성의 측정에 의한 프로모터 활성부분의 특정)

CatA유전자의 프로모터영역이 특정되면, 그 서열을 잘라내어, 식물발현용 벡터(vecter)에 이어 넣을 수 있다. 이어 넣어진 프로모터의 활성을 평가하기 위해서, 그 프로모터의 하류에 리포터(reporter)유전자, 예컨대, 적당한 효소를 코드하는 유전자를 연결한 플래즈미드를 작성할 수 있다. 이 플래즈미드를 식물세포 중에 도입하고, 유전자의 발현을, 예컨대 효소활성을 측정하여 관찰한다. 식물을 숙주(宿主)로 하는 경우에는, 예컨대, pBI221 등과 같은 플래즈미드를 이용하여, β-글루크로니다제(glucuronidase)(GUS)의 발현을 지표로서 측정하는 것이 일반적이고, 본원 명세서에 있어서도, GUS의 발현으로 측정하는 방법이 적용될 수 있다.

GUS활성은, Jefferson들의 방법(EMBO J 6:3901-3907(1987))에 기본적으로 따라서 측정될 수 있다. 즉, 단백질량으로 하여 50㎍상당의 프로토플래스트(proto

plast)추출액과 25㎕의 20 mM 4-methyl umbelliferryl glucuronide(4MUG), 그것에 추출 버퍼(buffer), 그 위에 식물조직 내재성의 GUS양(樣)활성을 억제하기 위해서 100㎕ 메탄올(Methanol){Kosugi들, Plant Science 70:133-140(1990)}을 가하고 나서 전량을 500㎕로 하고, 37℃에서 인큐베이트(incubate)한다. 2시간 후에 반응액으로부터 200㎕을 채취하고, 0.2 M Na₂CO₃을 0.8 mL 가하여 반응을 정지시킨다. 형광 분광 광도계에 의해, 365nm의 여기광(勵起光)으로 455nm의 형광을 측정한다. 효소활성을 4-MU pmol/min/mg protein으로 표시한다.

CatA 유전자의 프로모터영역의 여러가지 결실체(缺失體), 예컨대, 5'상류측에서 여러가지 길이로 결손시킨 CatA유전자의 프로모터영역을 GUS유전자와 융합시킨 플래즈미드를 이용하여 프로모터활성을 측정하고, 그 활성에 필수적인 부분 등을 특정할 수 있다. 이러한 활성부분을 특정하기 위한 수법은, 당업자에는 공지된 바이다. 따라서, 예컨대, CatA유전자의 프로모터영역에 불필요한 서열을 제거하여 얻어지는 CatA유전자의 프로모터와 동등한 활성을 갖는 서열도 본원 발명의 범위 내에 있다.

일단 CatA유전자의 프로모터영역 및 그 활성부분이 특정되면, 그 위에 그 서열을 개변(改變)하여, 프로모터활성을 높이거나, 발현하는 조직에 관해서 특이성을 변경시키는 것도 가능하다. 예컨대, CatA유전자의 프로모터영역 또는 그 활성부분을 일부 개변하여 얻어지는, 개변전(前)과 동등한 활성을 갖는 서열도 본원 발명의 범위 내에 있다.

서열번호1의 서열을 갖는 프로모터영역은, 꽃밥 및/또는 화분에서 특이적으로 그 활성을 발현한다. 따라서, 본원 명세서에서, 프로모터활성에 대해서「동등」이라고 하는 것은, 활성의 강도가, 적어도, 기준이 되는 프로모터영역의 활성의 강도와 같은 정도임과 동시에, 활성의 특이성도, 적어도 기준이 되는 프로모터영역의 활성의 특이성과 같은 정도인 것을 말한다. 용어「동등」은, 활성의 강도 및 활성의 특이성이, 기준이 되는 프로모터영역과 비교하여, 분명히 높은 경우를 제외하는 의도가 아닌 것에 유의해야 한다.「서열번호1의 서열과 동등의 프로모터활성을 갖는다」라는 것은, 예컨대, 본원 명세서의 하기 실시예와 마찬가지 조건으로 프로토플래스트에서 GUS유전자를 발현시키었을 때, 그 GUS활성이, 서열번호1의 서열에 관해서의 GUS활성의 약 50%이상, 바람직하게는 약70%이상, 보다 바람직하게는 약90% 이상이고, 또한, 꽃밥 및/또는 화분에서 특이적으로 그 활성을 발현하는 것을 말한다.

본원 명세서에서, 꽃밥 및/또는 화분에서「특이적으로」발현한다고 하는 것은, 목적으로 하는 유전자 산물을 꽃밥 및 화분의 적어도 한 쪽에서, 같은 식물체의 다른 조직 또는 기관의 적어도 1종에서 보다도 많이 발현하는 것을 말한다. 예컨대, 유전자 산물을, 꽃밥 및 화분에서, 같은 식물체의 임의의 부위의 엽신(葉身)에서 보다도 많이 발현하는 것을 말한다.

이러한 발현의 특이성은, 본원 명세서의 하기 실시예와 마찬가지의 조건으로 형질 전환 식물을 작제하는 것에 의해 평가할 수 있다.

(발현 카셋트 및 재조합 플래즈미드의 구축 및 그 이용)

활성이 확인된 CatA유전자의 프로모터영역 또는 그 활성부분을 갖는 서열은, 적당한 식물발현 벡터로 편성할 수 있다. 이 식물발현용 벡터로 편성되어진 서열의3'말단(末端)측에, 적당한 링커(linker)서열, 예컨대 멀티플 클로닝 사이트(multip

le cloning site)를 갖는 링커를 도입하여, 식물숙주에게 알맞은 발현 카셋트가 작성될 수 있다. 따라서, 본원 명세서에서「이종유전자를 삽입하기 위한 부위」란, 링커 또는 링커와 마찬가지로 작용하는 서열에 포함되는 부위를 말한다. 이 발현 카셋트에는, 소망에 의해 다른 조절 엘리먼트(element)가 포함될 수 있다. 예컨대, 발현효율을 향상시키기 위해서 등의 목적으로, 터미네이터(terminator) 서열이 포함될 수 있다. 이 터미네이터 서열은, 상기 멀티플 클로닝 사이트를 갖는 링커서열을 거쳐서, 프로모터서열과 결합될 수 있다.

상기 식물발현용 카셋트의 프로모터의 3'하류, 예컨대 멀티플 클로닝 사이트에, 발현이 의도되는 이종유전자가 발현 가능하게 접속되어, 재조합 플래즈미드를 발생시킨다. 본원 명세서에서「이종유전자」란, CatA유전자 이외의 벼 또는 다른 식물에서 내인성(內因性)의 유전자, 또는 식물에 대하여 외래의 유전자로서, 그 유전자산물의 발현이 꽃밥 및/또는 화분에서 소망되는 임의의 유전자를 말한다.

이렇게 하여 생긴 재조합 플래즈미드를 이용하여, 식물세포가 형질 전환될 수 있다. 식물세포의 형질 전환은, 아그로박테리움(agrobacterium)을 이용하는 방법, 프로토플래스트에의 일렉트로포레이션(electroporation)에 의한 방법 등, 당업자에 공지의 임의의 방법에 의해서 행할 수 있다. 예컨대, 식물세포의 프로토플래스트의 작성은, Kyozuka들, Mol.Gen.Genet. 206:408-413(1987)에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.

형질 전환된 식물세포를 상법에 의해 재분화시켜, 형질 전환된 식물조직으로하고, 그 위에 식물체로 할 수 있다. 형질 전환을 위한 재조합 플래즈미드의 작성에 당면하여, CatA유전자 프로모터는 예컨대, 세균과 식물의 양(兩)숙주에서 발현 가능한 바이너리 벡터(binary vecter)로 편성하는 것이 가능하다. 이러한 바이너리 벡터는 당업자에 주지된 바이다. 예컨대, 아그로박테리움의 발현계(系)를 포함하는 pBI계 등의 벡터를 이용하면, 미생물에 의한 식물에의 감염의 시스템을 이용할 수 있다. 적절한 재조합 플래즈미드를 이용하는 것에 의해, 벼 등의 단자엽 식물 및 담배 등의 쌍자엽 식물을 포함하는 임의의 형질 전환 가능한 식물에 목적의 이종유전자를 도입할 수 있다.

상술한 바와 같이, CatA유전자 프로모터는, 꽃밥 및/또는 화분에서 특이적으로 발현할 수 있다. 따라서, 이종유전자로서, 꽃밥 및/또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 가지는 유전자를 이용하는 것에 의해, 웅성 불임 식물을 작제할 수가 있다. 본원 명세서에서「꽃밥 및/또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 가지는 유전자」 란, 그 유전자산물이 임성이 있는 화분의 형성을 저지할 수 있는 것{예컨대, 누클레아제(nuclease), 프로테아제(protease), 글루카나제(glucanase)등을 코드하는 유전자}과, 그 유전자 자체가 꽃밥 및/또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 나타내는 것(예컨대, 꽃밥 및/또는 화분의 형성시에 발현하는 내인성 유전자의 앤티센스 RNA, 및 그와 같은 내인성 유전자를 분해할 수 있는 리보자임)을 포함하여 말한다. 웅성 불임 식물의 선발 및 그것을 이용하는 식물의 품종개량을 위한 수법은, 당업자에 주지된 바이다.

상기의 형질 전환식물의 작제는 또, 웅성 불임 이외의 형질을 식물에 부여하기 위해서도 이용할 수 있다. 예컨대, 독성 단백질을 코드하는 이종 유전자를 이용하는 것에 의해, 화분을 섭식(攝食)하는 해충 등의 제어를 꾀할 수 있다. 혹은, 영양소가 될 수 있는 단백질을 코드하는 이종 유전자를 이용하는 것에 의해, 작물의 영양가를 높일 수 있다. 꽃밥 및/또는 화분에서의 특이적인 유전자 발현을 이용하는, 임의의 유용식물의 작제가, 본원 발명의 범위 내에 있다.

본원 발명에 의해, 벼의 유전자로부터, 꽃밥 및/또는 화분에서 활성이 높은, 실용적인 프로모터의 사용이 제공된다. 따라서, 본원 발명은, 벼의 품종 개량뿐만 아니라, 다른 여러가지의 식물의 품종 개량에 이용될 수 있다.

(실시예)

이하에, 실시예에 의거하여 본원 발명을 설명하지만, 본원 발명의 범위는, 실시예만에 한정되는 것이 아니다.

1.벼 CatA 게노믹 유전자의 단리: 게노믹 라이브러리로부터의 스크리닝

CatA cDNA (Mori들, (1992 ; 전출)의 일부를, CatA게노믹 유전자의 클로닝에 이용하였다. CatA cDNA의 클로닝의 과정에서 얻어진 불완전장(不完全長) cDNA{전장

1.8kbp중, 5'비(非)번역 영역 및 약간의 코드 영역의 합계 약0.45 Kbp을 결손하는 3'말단측의 1.35Kbp}를 포함하는 람다 파지(Lambda phage)(클론 No.51)의 인서트

(insert)부분을 PCR로 증폭하였다. 같은 파지보다 DNA를 조제하여 이것을 템플레이트(template)로 하고, 프라이머(primer)로서 λgtll-Forward Primer 및 λgtll-Reverse Primer(동양방)(東洋紡)를 이용하였다. 생성물을 센트리콘(centricon)-100(Amicon)으로 정제하고, 농도를 25ng/10 ㎕으로 하여, 멀티 프라임 라벨(multi prime label)법(Amersham)의 프로브로 하였다.

미국 클론텍사(CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA)로부터 구입한 벼의 게노믹 DNA 라이브러리(Rice Genomic Library)를 이용하여 CatA유전자를 스크리닝하였다. 게노믹 라이브러리를 구성하는 파지 λEMBL-3을 상법에 따라서, E.coli NM538주(株)에 감염시켜, 파지 플래크를 형성시키었다. 이 파지 플래크를 나일론 멤브레인에 이동하고, 하기의 표준적 조건에서 상기 프로브와 혼성화시키었다. 또, 프로브는³²P에서 표식하였다.

혼성화 용액:6x SSC-0.1% SDS, 5x Denhardt's, 10O microgram/ml salmon sperm DNA; 혼성화 온도: 65℃ ;혼성화 시간: 한 밤

다음에, 멤브레인을, 이하의 조건으로 세정하였다. 세정조건: 2x SSC-0.1% SDS 실온 5분 플러스(plus)30분; 1x SSC-0.1% SDS: 68℃, 1시간 세정 후, 상법에 따라서, 나일론 멤브레인을 오토라디오그래피에 걸쳐, 프로브와 혼성화한 클론을 검출하였다. 혼성화된 것이 확인된 파지로부터 각각 DNA를 조제하였다.

상기 파지의 DNA를 SalI와 ScaI 등의 2, 3종류의 제한효소를 조합하여 소화하고, 그 소화물을 아가로스 겔(agarose gel) 전기 영동으로 분리하였다. 분리한 DNA 단편을 나일론 멤브레인으로 이동하여, 상술의 CatA cDNA 단편을 프로브로 하여 혼성화시키었다. 혼성화의 조건은 상기와 같고, 멤브레인 세정은 이하의 조건으로 행하였다. 세정조건: 2x SSC 실온 5∼10분 2회; 2x SSC-0.1% SDS 65℃, 30분 세정 후, 상법에 따라서, 나일론 멤브레인을 오토라디오그래피에 걸쳐, 프로브와 혼성화한 DNA 단편을 검출하였다.

시그널의 강함과 밴드의 패턴이 거의 동일한, 따라서 같은 구조를 가진다고 추정되는 1군의 클론과, 밴드패턴이 일부밖에 일치하지 않은 클론이 있다.

시그널의 강함과 밴드의 패턴이 거의 일치하는 클론은, CatA 유전자에 대응한다고 생각된다. 밴드의 패턴의 일부가 결락(缺落)하고 있는 클론은, CatA 유전자의 일부가 결손하고 있는 클론이라고 생각된다. 또한, 시그널이 약한 클론은, CatA에 유사한 구조를 가지는 다른 카타라제(아이소자임)의 유전자라고 생각된다.

상세한 서던(southern)분석, 부분 염기서열의 해석, CatA cDNA 염기서열에 의거하는 PCR 해석 등으로부터, CatA cDNA에 대응하는 유전자와, 그 5'상류에 프로모터 영역으로 추정되는 약 1.5Kbp으로 이루어지는 서열을 포함하는 클론λEM74/81을 얻었다.

클론λEM74/81의 삽입부분을 HindIII 및 EcoRI 소화(消化)로 잘라내고, 서열(sequence)해석용의 벡터 pBluescript II KS+ 혹은 SK+(Stratagene, CA)에 삽입하였다. 5'측에서 및 3'측(側)측(側)에서 단계적 결손 플래즈미드를 다수(多數) 작성하고, 염기서열결정을 행하였다. 4,670bp의 서열이 결정되었다. 서열번호2에 그 전(全)서열을 나타낸다.

게노믹 CatA 유전자의 염기서열은, 본원 발명자들에 의해 발표되어 있다 {일본 농예 화학회지(1992 ; 전출) 및 Higo들(1996; 전출}. 국제 DNA염기서열 데이터 백터 베이스 DDBJ에는, 도 1에 나타낸 것과 같이, HindIII 절단부위로부터 EcoRI 절단부위까지의 4,670염기의 서열을 등록했다(엑세션번호 D29966). Higo들(1996;전출)에는, HindIII 인식서열과 EcoRI 인식서열을 전후에 가하여, 4,676염기의 서열을 발표하였다.

2. CatA 유전자 프로모터를 갖는 재조합 플래즈미드의 작성

상기 1.에서 얻어진 CatA 유전자는, 4,670 bp이었다. 그리고, 서열번호2의 1,560번째로부터 1,605번째에 제1엑손(exon), 1,894번째로부터 2,694번째에 제2엑손, 2,781번째로부터 3,380번째에 제3엑손, 3,730번째로부터 4,117번째에 제4엑손이 존재하는 것, 및 각각의 엑손의 사이에, 제1로부터 제3인트론이 존재하는 것을 알았다.

이 서열정보에 의거하여, 프로모터로 추정되는 영역을 잘라낼 수 있다.

벼 CatA 유전자 프로모터를 갖는 플래즈미드, CatA-GUS-△O의 작제를 도 1에 나타낸다.

클론 λEM74/81을 Eco52I로 소화하고, 평활말단화(平滑末端化)처리하며, 이어서 HindIII로 소화하고, 아가로스 전기영동에 의해 약 1.9Kbp의 단편을 회수하였다. 클론 λEM74/81 삽입서열의 1번째로부터 1,901번째까지의 서열을 갖는 단편이 얻어졌다. 이 단편에는, 제1엑손의 상류측의 서열, 제1인트론, 제2엑손의 일부가 포함되어 있었다. 단편의 5'말단측은, HindIII부위(部位)이고, 3'말단은 평활말단이다.

식물 세포용 발현 벡터 pBI221(CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA)은, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)(CaMV)35S 프로모터, β-글루크로니다제(GUS)코딩 영역 및 노파린 신타제(nopaline synthase)의 터미네이터(terminator)(NOS-T)를 갖고 있다. 이 pBI221을 HindIII 및 SmaI로 소화하고, 대단편(大斷片)을 회수하였다. 이 대단편은, pBI221로부터 CaMV의 35S 프로모터영역이 삭제된 단편이다. 이 단편과, 상기 클론 λEM74/81삽입서열의 첫번째로부터 1901번째까지의 서열을 갖는 단편을 연결시켜, CatA-GUS-△O를 작제하였다. 이 방법은, CatA 유전자의 염기서열과 함께, 이미 본원 발명자에 의해서 공표되어 있다{Higo들(1996; 전출)}.

3. 벼 배양세포 프로토플래스트의 형질 전환과 GUS 유전자의 발현

상기 2.에서 얻어진 플래즈미드를, Higo들(1996; 전출)에 기재되어 있는 바와 같이, 벼 배양세포(Oc세포)의 프로토플래스트에 도입하였다. 컨트롤로서, pBI22l을 이용하였다.

벼 배양세포(Oc 세포)로부터의 프로토플래스트 조제방법, 일렉트로포레이션에 의한 프로토플래스트의 형질 전환, 및 프로토플래스트 추출액을 이용한 GUS 유전자 발현의 측정은, Higo들(1996; 전출)에 기재되어 있는 방법으로 실시하였다.

결과를 도 2에 나타낸다. 이 결과는, CatA 유전자의 프로모터가, 컨트롤인 CaMV의 35S 프로모터의 약 1.5배가 높은 활성을 나타내었다.

4. 형질 전환 벼(TO세대)의 작성

상기 3.에서, 벼 배양세포(Oc 세포) 프로토플래스트에서 높은 활성을 가지는 것이 확인된 CatA-GUS-△O 플래즈미드를 이용하여, 아래와 같이 벼를 형질 전환하였다.

아카기(赤木)들의 방법{Mol. Gen. Genet. 215:501-5O6(1989)}에 준하여, 벼(품종: 키누히카리)로부터 현탁세포(懸濁細胞)를 확립하고, 다음에 이 현탁세포를 이용하여 프로토플래스트를 조제하고, 일렉트로포레이션법{Tada들, Theor.Appl. Genet. 80:475-480 (1990)에 준한다}으로 플래즈미드를 도입하고, 재분화{Fujimura들., Plant Tissue Culture Lett. 2:74-75(1985)에 준한다}시켜, GUS 염색에 의해 선발하여 형질 전환 벼를 얻었다. 상세한 것을, 하기에 나타낸다.

1)벼 배반(胚盤)으로부터의 캘러스(callus)유도

1. 1) 배지(培地)를 아래와 같이 조제하였다:

①MS 기본배지에 2ppm 2,4-D, 0.1% 카세인(Casein)가수(加水)분해물, 3% 자당(蔗糖)(sucrose)을 첨가하고, pH5.5로 조정한다. ②배지에 1%한천(寒天)을 가하고, 오토클레이브(autoclave)한다. ③클린 벤치(clean bench)내에서 심형(深型)의 Ø9cm 페트리 디쉬(petri dish)에 분주(分注)한다(약40ml/dish).

1. 2) 종자의 살균을 아래와 같이 행하였다:

①키누히카리의 종자를 박피(剝皮)하고, 현미를 집어낸다. ②현미를 50mL 비이커(beaker)에 넣고, 70% 에탄올에 30초간 담근다. ③수돗물로 3회 헹군다. ④5% 차(次)아(亞)염소산 소다{Tween 20을 수적(數滴)첨가}로 20분간 살균한다. ⑤멸균수로 3회 헹군다. ⑥핀셋(pincette)를 이용하여, 한천배지에 치상(置床)한다{9립(粒)/ Ø9cm dish}. ⑦약 300lux, 26℃로 약 1개월간 배양한다.

2) 서스펜션(suspension)의 확립

2. 1)배지를 아래와 같이 조제하였다:

①R2무기염과 B5 비타민의 기본배지에, 1ppm 2,4-D, 3% 자당, 0.3% 카세인 가수 분해물을 첨가하고, pH를 5.5로 조정한다. ②10Om1배양 플라스크(flask)에 20 ml의 배지를 분주, 오토클레이브(autoclave)로 멸균한다.

2. 2) 서스펜션의 확립을 아래와 같이 행하였다:

①완숙(完熟)종자의 배반 유래(由來)의 무른(friable) 캘러스를 액체배지로 이식한다. ②이식한 플라스크를, 26℃, 약광하(弱光下), 80rpm에서 선회배양한다. ③이식 후 3일째에, 신선한 배지로 교환한다. ④그 위에 4일간배양을 계속한다. ⑤캘러스 배양 피펫(pipette)을 이용하여, 캘러스를 분산시켜, 캘러스 부분만을 이식한다. ⑥1주간마다 신선한 배지로 이식한다.

3) 프로토플래스트에의 유전자도입

3. 1) 효소액을 아래와 같이 조제하였다:

①Cellulase onozuka RS 4g, Macerozyme R-10 1g, CaCl₂·2H₂0 0.5g, Mannitol 7.28g을 10OmL 비이커에 넣어 혼화(混和)한다. 물을 가하여, 스티어러(s

tirrer)로 교반(攪件), 용해한다. ②pH5.5로 조정하고, 100mL에 채운다(fill up). ③37℃에서 20분간 방치 한 후, 12000rpm에서 15분간 원심(遠心)한다. ④상청(上淸)을 1OmL씩 원심관에 분주. 파라(para)필름(film)으로 실(seal)하고, 냉동 보존한다. ⑤탕욕(湯浴)으로 용해하고, 여과 멸균한다.

3. 2) 프로토플래스트의 단리를 아래와 같이 행하였다:

①배양4일째의 서스펜션 세포를 이용한다. ②캘러스배양 피펫으로 서스펜션 세포만을 10mL의 효소액이 들어 간 100mL 플레스크에 옮긴다. (약10g) ③27℃의 인큐베이터에서 5시간 정치(靜置)한다.

3. 3) 프로토플래스트의 정제를 아래와 같이 행하였다:

①플라스크를 가볍게 돌리고, 밑바닥에 가라앉은 세포를 부유(浮游)시킨다. ②부유시킨 세포를 민첩하게 155㎛의 메쉬(mesh)에 디켄트(decant)한다. ③메쉬를 가볍게 상하(上下)시켜, 효소액이 완전히 떨어지는 것을 기다린다. ④여과한 효소액을 77㎛의 메쉬에 비이커로부터 직접 디켄트. ⑤메쉬를 가볍게 끌어 올리고, 효소액을 떨어뜨린다. ⑥여과한 효소액을, 다시 31㎛의 메쉬에 디켄트. ⑦메쉬를 가볍게 끌어 올리고, 효소액을 떨어뜨린다. ⑧효소액을 비이커로부터 원심관에 디켄트로 옮긴다. ⑨600rpm에서 1분간 원심. ⑩디스포져블 피펫(disposable pipet)으로 상청을 새로운 원심관으로 옮긴다. ⑪900rpm으로 3분간 원심. 상청을 버린다. ⑫0.4 M 글루코스(glucose)를 원심관의 벽면을 따라 넣고, 프로토플래스트를 현탁. ⑬900rpm으로 3분간 원심. 상청을 버린다. ⑭AA버퍼를 원심관의 벽면을 따라 넣고, 프로토플래스트를 현탁. ⑮900rpm으로 3분간 원심. 상청을 버린다.소량의 AA버퍼를 벽면을 타게하여 넣는다.혈구 계산반(盤)을 이용하여, 프로토플래스트를 카운트한다.프로토플래스트 현탁액의 액량을 잰다.AA 버퍼를 이용하여 프로토플래스트 밀도를 1×10⁷개/mL로 조정. 여기서, AA버퍼는: 35mM K-Asparatic acid, 5mM Ca-Gluconate, 5mM Mg-Asparatic acid, 5mM MES, 0.4M mannitol, pH5.8(조정불필요)이다.

3. 4)유전자 도입을 아래와 같이 행하였다:

①일렉트로포레이션용 쳄버(chamber)를 70% 에탄올로 멸균한다. ②프로토플래스트 현탁액에 TE에 용해한 플래즈미드(1㎍/μL)를 첨가한다. 여기서, 첨가한 플래즈미드의 최종농도는, HPT2{하이그로(hygro)}가 50㎍/mL; CatA-GUS-△O가 100 ㎍/mL이다. 하이그로마이신(hygromycin) 선발용 플래즈미드 HPT의 구조는 보고되어 있다{Tada들, Theor. Appl. Genet. 80:475-480(1990)}. ③시험관을 빙상에 세워, 20분간 방치한다. ④쳄버로 옮긴다. ⑤컨덴서(condenser)에 충전한 전기를 방전한다. 여기서, 방전조건은: 880㎌, 475V/cm, 시정수(時定數)는 약30msec 이다. ⑥10초이상 방치 후, 원심관으로 회수한다. ⑦실온에서 20분간 방치한다.

3. 5) 프로토플래스트 배양을 아래와 같이 행하였다:

①900rpm에서 3분간 원심. 상청을 버린다. ②c-med를 원심관의 벽면을 따라 넣고, 프로토플래스트를 현탁한다. c-med에서 1×10⁶개/mL로 조정한다. c-med는 배양 후 3일째의 서스펜션으로부터 배지만을 회수하고, 12000rpm에서 부유물을 제거한다. 배지40mL에 대하여, 2,4-D(10Oppm)를 200μL, B5 비타민(vitamins)을 400 μL, 자당(sucrose)을 5.46g 첨가하고, pH4.3으로 조정한다. 냉동하여 보존. 사용직전에 융해, 여과 멸균한다. ③코팅 디쉬(coating dish)(Falcon #3002)에 750μL을 분주한다. ④콘래디(conradi)봉을 이용하여 디쉬 전체로 넓힌다. ⑤파라 필름으로 실(seal)한다. ⑥디쉬를 터퍼웨어(tupperware)에 넣는다. 여기서, 건조방지를 위해, 물을 넣은 비이커 등을 넣어 둔다. ⑦27℃, 어두운 장소에서 배양한다.

4)형질 전환식물의 재생

4.1)형질 전환세포의 선발·증식을 아래와 같이 행하였다:

①배양14일 후에 GI배지를 600μL 첨가한다. 여기서, GI배지는, R2배지에 2ppm 2,4-D, 0.4M 글루코스를 첨가하고, pH4.9로 조정한 것이다. ②하이그로마이신내성(耐性)캘러스를 선발하기 위해서, GI배지에 하이그로마이신50㎍/mL을 첨가한다. ③ GI배지 첨가 2주간 후, 증식하여 온 캘러스를 GII한천 배지 상에 이식한다. 여기서, GII한천배지는, R2배지에 2ppm 2,4-D, 3% 자당을 첨가하고, pH4.9로 조정한 후, 1% 한천을 첨가하여, 오토클래이브(autoclave)하며, Ø9cm×1Omm 디쉬에 1OmL씩 분주한 것이다.

4. 2)형질 전환식물의 재생을 아래와 같이 행하였다:

①N6무기염, B5비타민(vitamin), 3%자당, NAA lppm, 카이네틴(kainetin) 4ppm, 3%솔비톨(solbitol), 0.03% 카세인 가수(加水) 분해물을 포함하는 배지의 pH를 5.8로 조정하고, 1.5% 한천을 첨가하여 오토클래이브한다. ②클린 벤치내에서 Ø90mm× 20mm의 심형 플래스틱 페트리 디쉬(plastic petri dish)에 배지를 분주한다(40∼50 mL/dish). ③지름이 3mm정도로 증식한 캘러스를 한천배지 위에 이식한다. ④디쉬당(當) 20개정도의 캘러스를 치상(置床)한다. ⑤27℃, 3000lux의 연속광하(光下)에서 배양한다. 4주간정도로 식물체가 재생하여 온다. ⑥분화(分化) 배지상에서 분화한 식물체로, 슛(shoot)의 길이가 3cm정도로 성장한 것을 뿌리가 붙은 상태로, 마젠다 박스에 이식한다. 박스당 9개의 슛을 이식한다. 배지는, 1/2MS배지에 1%자당을 첨가하고, pH를 5.8로 조정한다. 0.15% 겔라이트(Gel rite)를 첨가, 가열용해 후, 마젠다박스에 50mL 씩 분주하여 오토클래이브한다. ⑦27℃, 10000lux 연속광하에서 배양한다. ⑧1주간정도로, 선단이 완전히 덮개에 도착하여 끝난다.경우에 따라, 배지 중의 2가(價)양이온(cation)이 빼앗겨, 배지가 액상화(液狀化)하는 일이 있다.

이상과 같이 하여 얻어진, 재분화한 개체(TO세대 벼)를 포트(pot)에 이식하였다. 성장한 개체 중에서, 잎을 GUS조직으로 염색하고, GUS가 발현하고 있는 개체를 선발하였다.

형질 전환식물의 선발을 위한 GUS염색은, 다음 순서로 행하였다:①1mM X-Gluc, 50mM sodium phosphate buffer(pH7.0), 10% Me-OH의 염색액을 조제한다. ②①의 염색액50OμL을 2mL의 마이크로튜브에 분주한다. ③재생한 식물 잎의 절편(切片)을 넣는다. ④37℃에서 24시간 인큐베이트. ⑤70%Et-OH에서 엽록체를 제거한다. ⑥ GUS염색된 벼를 선발한다.

이렇게 하여 GUS가 잎으로 발현하고 있는 T0세대 벼 15개체를 선택, 그 종자(T1세대종자)를 채취하였다.

5. T1세대 벼의 PCR에 의한 선발

상기 4.에서 얻어진 15계통 중, 10계통의 T1종자의 벼를 1% 앤티포민(antif

ormin)으로 1시간 처리 후, 2일간 수도물에 침지(浸漬)하고, 입자형상배토(培土){본소루(BONSORU 1호, 스미또모화학}에 파종하였다. 유묘(幼苗)의 엽신으로부터 ISOPLANT(일본 유전자)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 템플래이트(te

mplate)로서, 프라이머(primer) F1813(5'-CATGGCTGGTTGATTCAGC-3'; CatA 제1 인트론 내의 서열)과 프라이머 R2368(5'-CGTCGGTAATCACCATTCC-3':GUS유전자 코드 영역내의 서열)을 이용하여 PCR를 행하고, 도입한 DNA 서열을 포함하고 있는지 여부를조사하였다. DNA 폴리머라제(polymerase)인 AmpliTaq Gold (Perkin Elmer)을 이용하여 PCR를 행하였다. 반응조건은 94℃·12분의 처리 후, 94℃·1분, 55℃·2분, 72℃·3분의 처리를 35 사이클(cycle)행하였다. 반응액을 1% 아가로스중에서 전기(電氣) 영동하고, 에티디움 브로마이드(ethidium brommide)로 염색하여 자외선으로 조사하고, PCR 산물의 유무와 그 사이즈를 조사하여 유전자가 도입되어 있는 Tl세대의 식물체를 선택하였다.

도입한 GUS 유전자가 발현하였는지 확인하기 위해서, 하기의 GUS 조직염색법으로 T1식물의 엽신의 GUS 활성을 조사하였다.

GUS 활성의 관찰을 위한 벼의 엽신의 GUS 조직염색법으로서,「식물의 세포를 보는 실험 프로토콜(protocol): 유전자 발현으로부터 세포내 구조·기능까지」; 세포공학 별책 식물세포공학 시리즈62-3; 세포 레벨(level)에서 GUS 활성을 보는 방법(타카하시 미사, 모리카와 히로미찌) pp.71-79 (감수 후쿠다 히로, 니시무라 미키오, 나카무라 켄죠)에 기재한 방법을 바탕으로, 일부 개변한 방법으로 행하였다.

그 순서는 다음과 같이: ①X-Gluc 용액[100mM 인산 버퍼(buffer)(pH 7.0), 1mM X-Gluc, 0.3mM 페리시안화 칼륨, 0.3mM페로시안화 칼륨, 0.2% Triton-X1O0]를 조제한다. ②X-Gluc 용액50OμL을 24구멍 타이터 플레이트(titer plate)의 각 웰(well)에 분주한다. ③벼의 각 조직 또는 절편을 웰에 넣고, 28℃, 16시간 처리한다. ④X-Gluc 용액을 제거하고, 70% 에탄올을 가하여 탈색한다. ⑤70% 에탄올을 제거하고, 조직·절편을 50% 글리세롤 용액에 담근다. ⑥현미경 혹은 실체현미경으로 관찰한다.

T1세대 식물을, 잎에서의 GUS 유전자의 발현의 높이에 의해 그룹(group)분리하고, 고도(高度)로 잎에서 발현하고 있는 식물로부터 종자(T2세대 종자)를 채취하였다.

6. T2종자의 파종, 형질 전환체의 PCR에 의한 선발과 GUS 조직염색

T2형질 전환체의 벼를 상술한 바와 같이 처리하고, 파종하였다. 유묘(幼苗)의 엽신으로부터 상술한 바와 같이 DNA를 추출하여 PCR를 행하고, 도입한 DNA 서열을 포함하고 있는지 여부를 조사하였다. 조사한 T2식물 중 약 반수가 도입한 GUS 유전자를 가지는 형질 전환체인 것을 알았다.

또한, 도입한 GUS 유전자가 발현하고 있는지를 확인하기 위해서, 상기의 방법으로 T2식물의 유묘의 엽신의 GUS 활성을 조사하였다. PCR에서 GUS 유전자의 존재가 확인된 모든 T2형질 전환체에서, 엽신에서의 GUS 활성이 관찰되었다. 엽신에서 GUS 유전자의 발현이 확인된 식물체는 계속해서 생육시켜, 개화기에 꽃밥을 채집하여, 꽃밥 및 화분에서의 GUS 활성을 조사하였다.

결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다. 개화기에 꽃밥을 채집하여 GUS 활성을 조사한 결과, 엽신보다도 높은 GUS 활성을 볼 수 있었다. 꽃밥 및 화분을 현미경으로 관찰한 바, 꽃밥 벽(도 3)및 화분 외각(外殼)의 내부(도 4)가 GUS 활성에 의해서 푸르게 염색되어 있었다.

본원 발명에 있어서의 CatA 유전자 프로모터는, 꽃밥 및 화분에서 대단히 높은 활성을 갖고 있다. 따라서, 본원 발명은, 꽃밥 및/또는 화분의 유전자 조작에의한, 벼 등의 식물의 품종 개량을 위해 유용하다.

<110> JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES, MINISTRY OF AGRICULTURE, FORESTRY AND FISHERIES <120> PROMOTER SEQUENCES EXPRESSED IN ANTHERS AND POLLENS <130> PSYM200454 <160> 2 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 1901 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 tgtgcccacc acagcacacc tatcgttatc atcagcgtgg actaagaaca gaacaatttc 60 tcatcttttg tttcctgaga agtttagacc accaagatat atgctgatga tgctgtagat 120 agctagctag ttttgcaatt acttatgggt tgcatcacaa tcagggtctg tttagttccc 180 aaacaaaatt tttcacgctg ttacatagga tgtttggaca catgcataga gtactaaatg 240 tagaaaaaaa acaattaaac atttcgcctt gaaattacga gacaaatctt ttaagcctaa 300 ttgcgccatg atttgacaat ttggtgctac aataaatatt tgctaataat agattaatta 360 ggcttaataa attcgtcttg cagtttccag acggaatctg taatttattt tatgagatac 420 agctgcttcg atcttccatc acatattcag accgtaccta atctgaaagg ttagtaattt 480 gaactgcgta gtaatgctac aaggtaaatc aatcatcatc atcttgaatt ggttcctctt 540 atagcactag gtaaaaagac aagggtgcat tctggctggg ctgtgttcga 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tcgagaaggt ggcgcacttc 2040 gcccgggagc gcatcccgga gcgcgtggtc cacgcccgcg gcgcctccgc caagggcttc 2100 ttcgagtgca cccacgacgt caccgacatc acctgcgccg acttcctccg gtccccgggc 2160 gcccagaccc ccgtcatcgt ccgcttctcc accgtcatcc acgagcgcgg cagcccggag 2220 acgatccgcg acccgcgcgg gttcgccgtc aagttctaca cccgcgaggg caactgggac 2280 ctcctcggca acaacttccc cgtcttcttc atccgcgacg gcatcaagtt ccccgacgtc 2340 atccacgcct tcaagcccaa cccgcgctcc catgtccagg agtactggag ggtcttcgac 2400 ttcttgtccc accaccccga gagcctccac accttcttct tcctcttcga cgacgtcggc 2460 atccccaccg attaccgcca catggacggc ttcggcgtca acacctacac cttcgtcacc 2520 cgcgacgcca aggccaggta cgtcaagttc cactggaagc ccacctgcgg cgtcagctgc 2580 ttgatggacg acgaggccac gctcgtcggc ggcaagaacc acagccacgc cacccaggac 2640 ctctacgact ccatcgccgc cggcaacttc cccgagtgga agctgttcgt ccaggtaggt 2700 gatcatccag aaattaacgc ctatacgatc tgagttcgaa gccgcagtac tccttctaat 2760 taattattta atactgttag gtgatcgacc cggaggagga ggagaggttc gacttcgacc 2820 cgctggatga caccaagaca tggccggagg acgaggtgcc gctccggccc gtggggcgcc 2880 tcgttctcaa ccgcaacgtc gacaacttct tcaacgagaa cgagcagctg gcgttcgggc 2940 cggggctggt ggtgccgggg atctactact ccgacgacaa gatgctgcag tgcagggtgt 3000 tcgcgtacgc cgacacgcag cgctacaggc tggggccaaa ctacctgatg ctgccggtga 3060 acgcgcccaa gtgcgcccac cacaacaacc actacgacgg cgccatgaac ttcatgcacc 3120 gggacgagga ggtggactac tacccatcgc gccacgcgcc gctccgccac gcgccgccga 3180 cgcccatcac gccgcgcccc gtggtgggga ggaggcagaa ggcgacgata cacaagcaga 3240 acgacttcaa gcagcccggg gagaggtaca ggtcgtgggc gccggataga caggagaggt 3300 tcatccccct tcgccggcga gtcgcgcacc ccaaggtctc ccctgagctc cgcgccatct 3360 gggtcaacta cctctcccag gtaattcata ccagcaattt agtattacct ccatttttgt 3420 ttttatgaca ctactagtta aagtttgaac taatcaacgt catataaaaa aaacggaggg 3480 agtagttatt agtaatgatt aattgttttc tcttagttaa tccacatgat taacaccatg 3540 tttagcacaa cagttttatg aatccataga taaattattt aatcctattt tatatgaaat 3600 atataatttt aaaccactgt agagaatttg aaattaatat gacttaatcg ctattaattt 3660 gcactaattc cggcaaaaaa agctattaat ttgcactaac tatgtaatta actcatttac 3720 ttcatgcagt gtgatgagtc gttgggggtg aagattgcga ataggctcaa cgtgaagcca 3780 agcatgtgaa gaaactaagg cacaagaatg catcatctct tgttaattaa ttggagtact 3840 accaaccaaa taaggccaga caatgtcaga tgcacgcatc ttctgttgtc gttgggccat 3900 cttttgtatg catcctattg ttaattacta gtacatgata tccaagtgat catcagcaag 3960 gctacagaaa ttctgtaata cgataaatta aaagaaacca aaatggagcc tgcatatgtg 4020 taacttaatt aatgtactgg cgtattaatg ccactgctgc atgttgtaat actccatcaa 4080 agagtctatt actattaagt atttaaatta tcacttcaat ggtctctttt ttttttccca 4140 aaccataggt ctatatacga accatatcta cgacatcagt ggtttaatta tcatgtttga 4200 caccgccaac ttcatacaga aactctacct caacattttg tttctccgct atacttacaa 4260 tgactttaat tagggaatgt gattgctgtg atattgagaa tggtaatatg ccgtctgact 4320 ttgagttctt tctaatttct taaaatcaat ttttaagctg agttatatca tgatcccagc 4380 cttacataac cttttggagc ggcaatgaaa caactgtgac ccacacagcg agtatattca 4440 ttggcgctga gttgttcgtg tcgatatgaa aacgaaataa aaacaaacct gtttatggta 4500 atgataatta atatctagtt ggatgaatca ttaatttttt ttatcttcat tccaaatttc 4560 agattaacca ataaaccatg ttaccggtgc tatcacctat catttactac gttgttcaaa 4620 caaaaatatg gtagattaat tctagcaccg tgaaagatgc aaatcgaatt 4670

Claims

꽃밥 및 화분, 꽃밥 또는 화분에 있어서 이종(異種)유전자를 특이적(特異的)으로 발현(發現)시키기 위한 식물발현용 카셋트로서 :

서열번호1로 나타내어지는 서열로 구성된 벼 CatA 유전자 프로모터; 및

이종유전자가 그 프로모터와 발현 가능하게 접속되도록, 그 이종유전자를 삽입하기 위한 부위

를 포함하는 식물발현용 카셋트.
꽃밥 및 화분, 꽃밥 또는 화분에 있어서 이종유전자를 특이적으로 발현시키기 위한 재조합 플래즈미드로서 :

서열번호1로 나타내어지는 서열로 구성된 벼 CatA 유전자 프로모터; 및

그 프로모터와 발현 가능하게 접속된 이종유전자

를 포함하는 재조합 플래즈미드.
제 2항에 있어서, 상기 이종유전자가 꽃밥 및 화분, 꽃밥 또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 가지는 재조합 플래즈미드.
꽃밥 및 화분, 꽃밥 또는 화분에 있어서의 특이적인 발현이 소망되는 이종유전자를 식물에 도입하는 방법으로서 :

제 2항에 기재된 재조합 플래즈미드로 식물세포를 형질 전환하는 공정; 및

그 형질 전환된 식물세포를 재분화시켜, 식물체를 얻는 공정

을 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 이종유전자가 꽃밥 및 화분, 꽃밥 또는 화분의 형성을 저해하는 기능을 가지는 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 식물세포가 단자엽 식물세포인 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 식물세포가 쌍자엽 식물세포인 방법.