KR20030077526A - 뿌리 및 슈트 정점 내에서의 외부 유전자의 발현을촉진하는 프로모터 - Google Patents

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KR20030077526A
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독립행정법인농업생물자원연구소
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Abstract

본 발명은 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 특이적으로 발현을 유도하기 위한 프로모터를 제공한다. 이러한 프로모터를 이용함으로서 뿌리 내에서 선충류 또는 토양 병원균에 대한 저항성 물질을 합성하고; 뿌리 내의 뿌리의 발달을 촉진시키는 물질을 합성하고; 식물이 어릴 때 재분화된 식물체 내의 선택적 마커의 발현이 뿌리에 제한되어 식물이 성숙되면 발현이 억제되는 유전자 재조합 식물을 생성하는 것이 가능하다. 또한 줄기 정점에서의 발현 능력은 활발하게 번식하는 세포 내에서 유전자 발현을 억제하기 위한 기술을 발달시키는데 이용될 수 있다.

Description

뿌리 및 슈트 정점 내에서의 외부 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터{Promoter promoting expression of a foreign gene in root and shoot apex}
뿌리는 식물이 쓰러지는 것을 방지하는 서포트로 작용하고, 더욱 중요하게는 물과 영양분을 끌어당긴다. 뿌리는 흡수할 수 있는 지역을 증가시키기 위해 표면 지역을 확장하도록 분기한다. 또한 뿌리는 물질을 인, 철 등에 더욱 흡수가능하게 하는 유기산을 분비하고, 연결하며 그들을 흡수하는 기능을 지닌다. 또한 뿌리는 토양에서 뿌리의 끝이 생장하도록 돕기 위해 윤활제와 같은 물질을 합성하고분비하는 기능을 지닌다. 식물 호르몬의 합성 및 보관도 뿌리의 역할이다. 또한 뿌리는 광합성에 의해 수득된 에너지를 보관하거나 유년 단계 동안에 인을 보관하고 미래에 이를 이동시킨다. 식물, 특히 뿌리는 주변 환경으로부터 많은 스트레스를 겪는 동물이 할 수 있는 이동을 할 수 없고, 그들에 대한 많은 대책을 세운다.
뿌리의 이들 기능은 예를 들어 쌀에서 하기의 유전자와 결합된다 : 시클로필린(cyclophyllin)(Cyp) 유전자(Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25: 837-843(1994)), 지질전이단백질(LTP) 유전자(Vignols et al., Gene 16:265-270) (1994)), 페닐알라닌암모니아리아제(phenylalanine ammonia lyase)(PAL-ZB8) 유전자(Zhu et al., Plant Mol. Biol. 29:535-550(1995)), 히스톤 H3 기본 키티나제(RC24) 유전자(Xu et al., Plant Mol. Biol. 30:387-401(1996)), 칼레오신(caleosin) 유전자(Nasested et al., Plant Mol. Biol. 44:463-476(2000)) 등으로 이들은 뿌리에서 발현되는 것으로 이미 알려져 있다.
쌀 이외의 식물에서 담배의 신장 인자, eEF1A 유전자(Tremousaygue et al., Plant J 20:553-561(1999), 미로시나제(myrosinase) 유전자 Pyk10(Nitz et al., Plant Science 161:337-346(2001)), 철 운반자(IRT2) 유전자(Vert et al., Plant Mol. Biol. 42:679-688(2000)), 질산 환원효소(Hasch et al., J. Exp. Bot. 52:1251-1258(2001)) 등; 또는 아마의 펙틴메틸에스테라제(Roger et al., PlantScience 160:713-721(2001)) 등은 뿌리에서 발현되는 것으로 이미 알려져 있다.
슈트 정점은 영양 생장 단계에서 줄기의 끝 및 주변 부분을 나타낸다. 고등식물에서 줄기 정점은 세포 분열을 착수하여 새로운 세포를 생성할 수 있는 능력을 지닌다. 줄기 정점 내에서 발현되는 유전자의 예는 담배의 지질 전이 단백질(Itp1) 유전자(Canevascini et al., Plant Physiol., 112:513-524(1996)). 호메오박스(homeobox)(NTH15) 유전자(Tamaoki et al., Plant Cell Physiol., 38:917-927 (1997)) 및 지베렐린 3베타-히드록실라제 유전자(Itoh et al., Plant J., 20:15-24 (1999)); 및 아라비돕시스의 피롤린-5-카르복실라제 환원효소 유전자(Hua et al., Plant Physiol., 114:1215-1224(1997)), ERECTA 유전자(Yokoyama et al., Plant J., 15:301-310(1998)), ATML1 유전자(Session et al., Plant J., 20:259-263 (1999)) 및 FAD3 유전자(Matsuda et al., Planta, 213:833-840(2001))을 포함한다. 이들 연구는 이들 유전자 발현의 조직 특이성은 그들의 프로모터에 의해 조절됨을 기술하였다.
최근 뿌리에서 발현가능한 프로모터를 뿌리의 발달, 질병 저항성 및 스트레스 저항성에 기여하는 것이 가능한 유전자와 연결하고, 상기 유전자를 식물 내에 도입하는 방법이 유망한 생물공학 기술로서 주목받고 있다.
식물 내에서 외부 유전자를 발현시키기 위해 바이러스성 유전자에 프로모터를 이용하는 시도가 되어왔다(즉, MacFarlane and Popovich, Virology 267:29-35 (2000); 및 Mazithulela et al., Plant Science 155:21-29(2000)). 그러나 바이러스는 감염후 유포된다. 식물 유전자로부터 유도된 프로모터는 세포성 수준으로 유전자의 발현 사이트를 제한하기 위한 목적으로는 바이러스성 유전자로부터 유도된 프로모터보다 우수하다.
옥수수 등에서 발견된 뿌리에서 발현되는 유전자에 대한 프로모터가 일부 알려져 있다. 재조합 DNA 기술은 뿌리에 질병 저항성을 부여하는데 이용될 수 있다. 미국 특허 제6,284,948호 "Gene and methods for control of nematodes in plants"는 뿌리에 선충류 저항성을 부여하는 예를 개시한다. 여기서 선충류 저항성 유전자는 식물 유비퀴틴 유전자 프로모터를 이용하여 발현된다. 그러나 이러한 유비퀴틴 프로모터는 낮은 수준의 기관 특이성을 지니고, 일정하게 발현된다.
뿌리-특이적 프로모터의 예는 미국 특허 제6,271,437호 "Soybean gene promote"에 개시되어 있다. 여기서 대두 포낭 선충류 유전자의 프로모터가 뿌리 내에서 외부 유전자를 발현시키는데 이용되는 방법은 기술되어 있다. 뿌리-특이적 프로모터의 예는 미국 특허출원 제2001-16954 "Root specific promoters" 내에 개시되어 있다. 이들 예는 아라비돕시스로부터 유도된 b1-튜블린 유전자 프로모터, 리보솜 단백질 RPL16A 유전자 프로모터, ARSK1 유저자 프로모터 및 대두 메탈로티오닌(methallothionein)-유사 유전자 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는선충류 저항성을 부여하는데 이용됨이 기술되어 있다.
이들 프로모터는 하기의 문제점을 지닌다 : 프로모터의 활성은 일반적으로 실용적인 적용을 제공하기에 불충분하다; 프로모터는 쌀과 같은 곡물을 포함하여 단자엽식물 내에서 기능하지 않는다; 등.
따라서 곡물의 다양한 발달 단계에서 활동하는 많은 프로모터가 분리되면 이들 프로모터의 형상이 드러나고, 다른 조직 특이성 및 높은 활성을 지닌 프로모터 카세트가 생성되어 이후 이러한 프로모터 카세트는 쌀과 같은 육종 농작물에 매우 유용하다.
(본 발명에 의해 해결되는 문제점)
본 발명의 목적은 뿌리 및/또는 줄기 정점 내에서 높은 수준의 활성을 지닌 식물 프로모터를 제공하는 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명의 목적은 통상의 프로모터의 활성의 문제점(즉, 활성은 일반적으로 실용적인 적용에 불충분하다; 활성은 쌀과 같은 단자엽식물 내에서 나타나지 않는다; 활성의 기관 특이성이 낮다; 등)을 극복하는 실용적인 프로모터를 제공하는 것이다.
발명의 개요
(문제점을 해결하기 위한 수단)
본 발명은 쌀 카탈라제 B(CatB)의 프로모터 구역의 기본 서열 부분이 뿌리에서 외부 유전자를 발현시키는데 이용될 수 있음을 발견하는데 바탕을 두고 완성되었다.
본 발명은 하기의 것을 제공한다.
1. 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
2. 제 1항목에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
3. 제 1항목에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 12로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
4. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 조성물
5. 제 4항목에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 조성물
6. 제 4항목에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 12로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 조성물
7. 제 4항목에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물임을 특징으로 하는 조성물
8. 제 4항목에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물임을 특징으로 하는 조성물
9. 제 4항목에 있어서, 상기 식물은 쌀, 아라비돕시스, 옥수수, 밀, 보리, 토마토, 오이, 가지, 감자, 상추, 일본 래디쉬 또는 당근임을 특징으로 하는 조성물
10. 제 4항목에 있어서, 상기 원하는 유전자는 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리펩티드, 뿌리의 발달을 촉진시키는 것이 가능한 펩티드 및 재분화된 식물체에 대한 선택적 마커로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자임을 특징으로 하는 조성물
11. 제 4항목에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 뿌리의 끝 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
12. 제 4항목에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 어린 단자엽식물의 분열조직 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
13. 제 4항목에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 줄기 정점 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
14. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 식물 발현 카세트
15. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 상기 프로모터는 원하는 유전자에 실시가능하게 연결됨을 특징으로 하며, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 플라스미드
16. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 세포
17. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 조직
18. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 형질전환 식물
19. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자 :
로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 종자
20. 1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하고;
2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
3) 프로모터가 작동하게 하는 조건하에 식물을 위치시키는 것 :
으로 구성된 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하는 방법
21. 1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하고;
2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
3) 프로모터가 작동하게 하는 조건하에 식물을 위치시키는 것 :
으로 구성된 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하는 방법에 의해 수득된 유전자 생성물
22. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터를 함유한 플라스미드를 제공하고;
2) 상기 플라스미드로 식물 세포를 형질전환하고; 및
3) 형질전환된 식물 세포를 재배하는 것 :
으로 구성된 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물을 생성하는 방법
제 14항목 내지 제 22항목은 제 5항목 내지 제 13항목의 형상에 의해 특정화된다.
본 발명은 뿌리 및/또는 줄기 정점 내에서 식물 내로 도입된 외부 유전자를 발현하는 프로모터에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 쌀 카탈라제(catalase) 유전자 B(이후 CatB로 표기됨)의 프로모터 구역의 부분을 이용하여 뿌리 및/또는 줄기 정점 내에서 외부 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 실험에 이용된 다양한 DNA 컨스트럭트를 나타낸다.
도 2는 B1(= CatBD1 - GUS/pTN2) 및 B2(= CatB2 - GUS/pTN2)를 생성하기 위한 방법을 나타낸다.
도 3은 도입된 B1을 지닌 쌀의 어린 식물의 GUS 염색을 나타내는 사진이다(To, 재분화된 첫 번째 세대).
도 4는 도입된 B1을 지닌 쌀의 어린 식물의 GUS 염색을 나타내는 사진이다(T2, 세대)((a) 어두운 배경; (b) 밝은 배경).
도 5는 CatB 프로모터 구역을 나타낸다.
본 발명을 통해 단수형 관사(즉, 영어로 "a", "an", "the" 등; 독일어로 "ein", "der", "das", "die" 등; 불어로 "un", une", "le", "la" 등; 및 다른 언어로 관사, 형용사 등)는 언급이 없는 경우 그들의 복수의 개념을 포함함이 이해되어야 한다. 또한 여기에 사용된 용어는 언급이 없는 경우 당분야에서 통상적으로 사용되는 정의를 지닌다.
서열의 설명
서열번호 1은 CatB 프로모터 구역(1364 bp)의 핵산 서열을 나타낸다(-1066 ∼ +298 cDNA의 시작점은 +1로 표기됨; 도 5 참조).
서열번호 2는 CatB 유전자의 핵산 서열을 나타낸다(4985 bp).
서열번호 3은 BΔ3 단편을 나타낸다(866 bp).
서열번호 4는 B1 단편을 나타낸다(627 bp). 1∼6 지점에서 CatB 카탈라제 유전자의 염기 서열 내의 AAAAAA는 HindⅢ 분열 사이트인 AAGCTT로 변화된다. 460 지점에서 T는 C로 대체되어 CatB 카탈라제 유전자의 번역 시작 코돈을 파괴한다.
서열번호 5는 B2 단편을 나타낸다(534 bp). 1∼6 지점에서 CatB 카탈라제 유전자의 염기 서열 내의 AAAAAA는 HindⅢ 분열 사이트인 AAGCTT로 변화된다. 357 지점에서 T는 C로 대체되어 CatB 카탈라제 유전자의 번역 시작 코돈을 파괴한다.
서열번호 6은 CatB cDNA의 102∼131에 상응하는 서열이다.
서열번호 7은 CatB cDNA의 484∼455에 상응하는 서열이다.
서열번호 8은 하나의 실시태양에서 사용된 프라이머 3D3-F1이다.
서열번호 9는 하나의 실시태양에서 사용된 프라이머 3D3-F2이다.
서열번호 10은 하나의 실시태양에서 사용된 프라이머 BD3-MR이다.
서열번호 11은 -329 내지 +298의 프로모터 구역을 나타낸다.
서열번호 12는 -329 내지 -227의 프로모터 구역을 나타낸다.
용어의 정의
여기에 사용된 "프로모터"는 RNA 중합효소가 결합하여 전사를 개시하는 유전적 요소 또는 인자를 나타낸다. 여기에 사용된 "프로모터 구역"은 특정한 구조적 유전자 서열에 인접한 프로모터 활성을 지닌 구역을 나타낸다. 프로모터 구역은 유전자의 전사가 개시될 때 RNA 중합효소가 결합하는 정상적 유전자의 상부 염기서열에 의해 특정화된다. 여기에 사용된 특정한 인자에 의해 처리되는 "프로모터 활성"은 전사가 RNA 중합효소 또는 이와 유사한 것에 활동하는 인자에 의해 개시되는 활성을 나타낸다.
여기에 사용된 "식물"은 어떤 단자엽식물 또는 쌍자엽식물도 포함한다. 바람직한 식물의 예는 밀, 옥수수, 쌀, 보리, 사탕수수 등과 같은 쌀과에 속하는 단자엽식물을 포함한다. 바람직한 식물의 다른 예는 담배, 피멘토, 가지, 메론, 토마토, 고구마, 양배추, 양파, 브로콜리, 당근, 오이, 감귤, 중국 양배추, 상추, 복숭아, 감자 및 사과를 포함한다. 바람직한 식물은 농작물에 한정되지 않고, 꽃, 나무, 잔디, 잡초 등을 포함한다. 식물은 특정화되지 않는다면 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포 및 종자를 포함한다. 식물 기관의 예는 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 등을 포함한다. 식물 세포의 예는 캘러스 및 현탁액 배양된 세포를 포함한다.
여기에 사용된 "뿌리 및 줄기 정점들의 적어도 하나 이상의 사이트"는 뿌리 및 줄기 정점으로 구성된 사이트 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 사이트를 나타낸다. 따라서 "뿌리 및 줄기 정점들의 적어도 하나 이상의 사이트"는 뿌리 부분 또는 줄기 정점의 부분을 포함한다. 또한 "뿌리 및 줄기 정점들의 적어도 하나 이상의 사이트" 분열조직을 포함한다.
여기에 사용된 "분열조직"은 분화된 세포 및 다른 분열 세포 또는 특정한 타입의 세포로 분화하는 것이 가능한 사이트로 구성된 식물 형성층을 나타낸다. 분열조직은 종종 생장하는 부분에서 관찰된다. 분열조직의 예는 생장점, 줄기 정점(슈트 정점), 뿌리 정점 또는 끝, 뿌리 정점 분열조직, 정점 분열조직 등을 포함한다.
여기에 사용된 "뿌리"는 지하에 존재하고, 지지자로 작용하고, 수분을 끌어당기는 기관을 나타낸다. 끝은 내부 부분이 표피에 의해 둘러싸이고, 중심 원주로 불리는 근관으로 불린다. 물관 및 체관은 중심 원주 내에서 작동한다. 표피 세포의 돌출한 부분인 근모는 뿌리의 끝의 약간 아래에 존재한다. 근모 내 또는 주변의 표피 세포는 활발하게 수분을 끌어당긴다. 근모의 수명은 뿌리가 일정하게 신장하는 동안 며칠에서 몇 주까지여서 근모의 위치는 앞으로 이동한다. 또한 전체 뿌리는 여기서 뿌리 시스템이라고 불린다. 예를 들어 쌀의 종자 뿌리에서 약 5∼20개의 우생 뿌리는 단일 자엽초의 각각의 마디 및 그 위로부터 생장한다. 마디로부터 생장하는 뿌리는 관근이라고 불린다. 더 많은 뿌리는 상부 마디로부터 생장한다. 첫 번째 및 두 번째 분기된 뿌리는 상부 마디로부터 생장한다. 뿌리는 최대 약 1m의 길이까지 생장한다. 뿌리는 분열조직을 포함한다.
여기에 사용된 "줄기 정점"은 슈트 정점으로도 불리고, 줄기 및 주변 사이트의 뿌리 정점 분열조직을 나타낸다. 줄기 정점은 줄기 및 측면 잎을 형성하는 발육성 줄기 정점 및 화서 또는 꽃을 형성하는 재생성 줄기 정점을 포함한다. 줄기 정점은 발육 단계에서의 줄기의 끝 및 그의 주변 부분을 나타낸다. 고등식물의줄기 정점은 새로운 세포로 분열하는 것이 가능하다.
여기에 사용된 "카탈라제"는 과산화물을 분해하는 반응을 촉매하는 것이 가능한 효소이다(EC1.11.1.6). 카탈라제는 H2O2, CH3OOH 및 C2H5OOH의 존재시 C2H5OH, CH3OH, CH3COOH, HCOOH, HNO2등을 산화시킨다. 카탈라제는 동물, 식물 또는 미생물인 것에 관계없이 어떤 호기성 세포 내에 존재한다. 동물에서는 간, 신장 및 적혈구가 많은 양의 카탈라제를 함유한다. 소 간 카탈라제는 약 230,000의 분자량을 지닌다. 이러한 효소의 하나의 분자는 기능적 그룹으로서 4개의 프로토헤마틴(protohematin)을 함유한다. 식물에서는 카탈라제는 본 발명자에 의해 분리된 카탈라제 B를 포함한다.
여기에 사용된 핵산 분자의 "단편"은 참조 DNA의 전체 길이 보다 더 짧은 길이를 지니나 적어도 프로브 또는 프라이머로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 특정한 DNA 단편은 단편이 유래된 핵산에 대한 선택적인 프로브 또는 선택적인 프라이머로서 사용되기 위해 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있어야 한다. 여기에 사용된 "특정한 DNA이 특이적으로 하이브리다이즈한다"는 제공된 핵산 분자가 그의 DNA 단편에 의해 개별적으로 검출되거나 증폭될 수 있다는 것을 나타낸다. 선택적인 프로브는 대표적으로 적어도 10 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 15 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 20뉴클레오타이드, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 30, 40, 50 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 지니고, 또한 50 뉴클레오타이드 이상의 길이를 지닌다. 선택적인 프로브는 선택적인 프라이머를 이용한 PCR 증폭의 생성물로서 이용가능하다. 선택적인 프라이머가 PCR에서 적어도 한 쌍이상의 프라이머로서 사용될 때 선택적 프라이머는 대표적으로 적어도 9 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 10 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 15 이상의 뉴클레오타이드, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 또는 50 이상의 뉴클레오타이드 또는 50 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 지닌다.
여기에 사용된 핵산 분자의 "상동체"는 참조 DNA의 뉴클레오타이드 서열에 상동적인 뉴클레오타이드 서열을 지닌 핵산 분자를 나타낸다. 대표적으로는 상동체는 스트린전트(stringent) 조건하에서 참조 핵산 분자에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 본 발명의 프로모터의 경우 프로모터의 "상동체"는 프로모터 서열과 상동성을 공유하는 핵산 서열을 지니고, 동일하거나 유사한 발현 특성(즉, 사이트 특이성, 주기 특이성, 스트레스에 대한 반응성 등)을 지닌 핵산 분자를 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이 유전자의 "상동성"은 2 또는 그 이상의 유전자 서열 사이의 동일성의 규모를 나타낸다. 따라서 2개의 유전자 사이의 상동성이 클수록 그들 서열 사이의 동일성이 크다. 2개의 유전자가 상동성을 지녔는지 여부는 그들의 서열을 직접 비교함으로서 또는 스트린전트 조건 하에서의 하이브리디제이션 방법에 의해 측정된다. 2개의 유전자 서열이 서로 직접 비교될 때 유전자는 대표적으로 서로 적어도 50% 이상, 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 지닌다면 상동성을 지닌다.
여기서 상동성 규모는 그의 디폴트(default) 파라미터를 이용한 서열분석 장치인, BLAST에 의해 측정된다.
따라서 본 발명의 프로모터 서열에 함유된 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열을 함유한 핵산 분자는 본 발명의 프로모터와 동일하거나 유사한 활성을 지닌다. 이러한 활성은 베타-글루쿠로니다제(GUS) 유전자, 루시페라제(luciferase) 유전자 또는 수용체 유전자로서의 GFP 유전자를 이용한 에세이 또는 생물학적 또는 세포학적 조직화학 시험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 에세이는 당분야에 일반적으로 이용되는 잘 알려진 기술이다(Malliga et al., Methods in Plant Molecular Biology: A laboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995); Jefferson, Plant Molec. Biol. Reports 5: 387 (1987); Ow et al., Science 234: 856 (1986); Sheen et al., Plant J. 8: 777-784 (1995)). 따라서 당업자가 어떤 어려움 없이 본 발명의 프로모터 서열에 함유된 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열을 함유한 핵산 분자가 본 발명의 프로모터에 동일하거나 유사한 활성 또는 실질적으로 더 높은 활성을 지니는지를 확인하는 것이 가능하다. 여기서 프로모터 활성은 검출 오차 내에서의 상기-기술된 에세이에 의해 확인될 때 본 발명의 프로모터 보다 실질적으로 더 높거나 동일하다고 기술된다.
본 발명의 프로모터의 길이는 일반적으로 적어도 10 이상의 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 적어도 20 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 30 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 40 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 50 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 60 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 70 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 80 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 90 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 100 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 150 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 200 이상의 뉴클레오타이드 및 적어도 300 이상의 뉴클레오타이드이다.
통상의 프로모터에 연결된 본 발명의 프로모터(즉, 최소 프로모터(35S 프로모터로부터 유도된 약 80 염기쌍을 함유한 프로모터(Hatton et al., Plant J., 7:859-876(1995); Rouster et al., Plant J., 15:435-440(1998); Washinda et al., Plant Mol. Biol., 40:1-12(1999)); 등)가 이용될 수 있다. 이러한 경우 본래 조직 특이성이 전혀 없거나 약하거나 또는 다른 타입의 특이성을 지닌 프로모터가 본 발명의 프로모터 또는 그의 단편에 연결되면 결과적인 프로모터는 뿌리 및/또는 줄기 정점에서 조직 특이적으로 기능할 수 있다(Hatton et al., Plant J., 7:859-876(1995); Rouster et al., Plant J., 15:435-440(1998); Washinda et al., Plant Mol. Biol., 40:1-12(1999)).
본 발명의 프로모터는 쌍자엽식물 및 다른 생물체뿐만 아니라 단자엽식물을 변형시키는데 이용된다. 이는 이 둘 식물이 조절 전사에 있어서 유사한 메카니즘을 지니기 때문이다. 예를 들어 옥수수의 제인(zein) 유전자 프로모터는 담배에서 동일한 조직 특성으로 발현되었고(Schernthaner et al., EMBO J., 7:1249-1255 (1988)); 쌀의 글루테린(glutelin) 유전자 프로모터는 담배에서 동일한 조직 특성으로 발현되었음(Leisy et al., Plant Mol. Biol., 14:41-50(1989))이 보고되었다. 특히 바람직한 시험 식물은 쌀 외에 밀가루, 옥수수, 보리, 사탕수수, 감귤, 중국 양배추, 상추, 토마토, 복숭아, 감자, 토마토 및 사과를 포함한다.
유전자가 여기서 논의될 때 "벡터"는 타겟 세포 내로 목적 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 것이 가능한 벡터를 나타낸다. 이러한 벡터는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포, 개체 동물 내에서의 자가-복제 또는 그의 염색체 내로의 통합 및 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 전사에 적당한 사이트 내로의 위치화되는 것이 가능한 프로모터를 함유한 벡터를 포함한다. 식물의 "재조합 벡터"는 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 포함한다.
벡터 도입 방법의 예는 어떤 식물세포 내로의 DNA 도입 방법, 예를 들어 세포감염, 형질도입 및 하기를 이용한 형질전환을 포함한다 : 아그로박테리움(일본공개공보 제59-140885호, 일본공개공보 제60-70080호 및 WO94/00977), 일렉트로포레이션 방법(일본공개공보 제60-251887호), 입자 총(유전자 총) 방법(일본 특허 제2606859호 및 일본 특허 제2517813호) 등.
본 발명의 프로모터 발현의 "검출 또는 자격증명"은 예를 들어 mRNA 측정 및 면역학적 측정 방법을 포함한 적당한 방법을 이용하여 달성된다. 분자생물학적 측정 방법은 예를 들어 노던 블럿(northern blot) 방법, 닷(dot) 블럿 방법, PCR 방법 등을 포함한다. 면역학적 측정 방법은 예를 들어 ELISA 방법, RIA 방법, 형광 항체 방법, 웨스턴 블럿 방법, 면역조직학적 염색 방법 및 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 이용한 것 등을 포함한다.
"발현 수준"은 본 발명의 단백질 또는 mRNA의 수준을 나타낸다. 이러한 발현 수준은 본 발명의 항체를 이용하여 ELISA 방법, RIA 방법, 형광 항체 방법, 웨스턴 블럿 방법, 면역조직학적 염색 방법 등과 같은 면역학적 측정 방법을 포함한 적당한 방법에 의해 평가된 본 발명의 폴리펩티드의 단백질 수준; 또는 노던 블럿 방법, 닷 블럿 방법, PCR 방법 등을 포함한 생물학적 측정 방법과 같은 적당한 방법에 의해 평가된 본 발명의 폴리펩티드의 mRNA 수준을 포함한다. "발현 수준의 변화"는 상기-기술된 면역학적 또는 생물학적 측정 방법을 포함한 적당한 방법에 의해 평가된 본 발명의 펩티드의 단백질 또는 mRNA 수준에 의해 측정된 발현 수준에 있어서의 증가 또는 감소를 나타낸다. 발현 수준의 절대적 또는 상대적 수치를 관찰함으로서 특정한 프로모터가 특이적으로 활동하는지 여부를 결정하는 것이 가능하다.
"형질전환체(transformant)"는 형질전환에 의해 생성된 세포 등과 같은 생물체의 전체 또는 부분을 나타낸다. 형질전환체의 예는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포 등을 포함한다. 또한 형질전환체는 무엇이 형질전환되었느냐에 따라 형질전환된 세포, 형질전환된 조직, 형질전환된 숙주 등으로 불린다.
여기에 표현된 "유전자"는 당분야에서의 일반적인 의미를 지니고, 유전적 특징을 결정하는 인자를 나타낸다. 본 발명의 방법에 의해 발현되기를 원하는 유전자는 선충류, 토양 병원균 등에 대해 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리펩티드, 뿌리 및 재분화된 식물체에 대한 선택적 마커 등의 발달을 가속화하는 것이 가능한 폴리펩티드를 포함하여 본 발명의 방법에 의해 특이적으로 발현되기를 원하는 어떤 유전자도 된다.
여기에 사용된 "재분화"는 전체 실체가 실체의 부분으로부터 재구성되는 현상을 나타낸다. 예를 들어 식물체는 세포, 잎, 뿌리 등과 같은 조직의 조각으로부터 형성된다.
형질전환체를 식물체로 재분화하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 Roger et al., Methods in Enzymology 118:627-640(1986); Tabata et al., Plant Cell Physiol., 28:73-82(1987); Shaw, Plant Molecular Biology : A practical approach. IRL press(1988); Shimamoto et al., Mature 338: 274(1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology : A laboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995); 등에 나타나 있다. 따라서 당업자가 목적 형질전환 식물에 따라 다르게 상기-기술된 잘-알려진 방법을 이용하여 재분화를 수행하는 것이 가능하다.
재분화된 형질전환체의 원하는 변형된 성질의 존재는 성질의 타입에 따라 다르게 적당한 에세이를 수행함으로서 확인된다. 예를 들어 수용체 유전자로서의 GUS 유전자는 형질전환체를 생성하기 위해 식물체 내로 도입되는 프로모터와 융합된다. 형질전환은 조직학적 염색에 의해 GUS 활성을 검출함으로서 확인될 수 있다. 이러한 경우 형광 단백질인 GFP 유전자 또는 루시페라제 유전자는 수용체 유전자로서 이용될 수 있다. 이들 유전자의 어떤 것도 다양한 프로모터에 대한 에세이에 이용된다. 유전자의 상세한 사항은 하기의 실시예 내에 기술될 것이다. 병원성 박테리아에 대한 저항성(스트레스 저항성)을 부여하고자 할 때 모델 박테리움(즉, Pseudomonas syringae pv. tabaci)은 재분화된 식물체 내로 접종된다. 이러한 경우 재분화된 식물체 내에서의 성질의 변화는 대조군 식물과 비교하여 변화의 유무를 관찰함으로서 평가된다.
여기서 식물은 당분야에 알려진 어떤 방법으로도 재배될 수 있다. 식물을 재배하는 방법은 예를 들어 "Moderu-shokubutsu-no-Jikken-Purotokoru For Ine ·Shiroinunazuna : Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu 4; Ine-no-saibaino [Experiment Protocol for Model Plants For Rice andArabidopsis thaliana: Cellular Engineering, Special Issue, Plant Cellular Engineering Series 4; Rice Cultivating Methods]"(Kazutoshi Okuno) pp. 28-32, 및 "Arabidopushisu-no-saibaiho [Cultivating Methods forArabidopsis]"(Yasuo Tanba) pp. 33-40 (Supervised by Ko Shimamoto and Kiyotaka Okada)에 나타나 있고, 이는 여기에 상세히 기술되지 않는다. 예를 들어 아라비돕시스 탈리아나는 토양 배양, 암면 배양 및 수분 배양의 어떤 것에 의해서도 재배될 수 있다. 식물이 백색 형광등의 일정한 광 조건하에서 재배되면 씨뿌리기 후 개화는 약 4주 내에 처음으로 관찰된다. 개화후 종자는 약 16일 내에 충분히 성숙된다. 40∼50개의 종자가 하나의 포드(pod)로부터 수득된다. 씨뿌리기에서 사멸까지 2∼3개월 동안 약 10,000개의 종자가 수득된다. 종자의 휴면 기간은 짧다. 약 1주일 건조 후 충분히-성숙된 종자는 수분을 흡수 2∼3일 후에 발아된다. 종자가 수분 흡수 및 씨뿌리기 후 2∼4일 동안 4℃에서 극저온 처리되면 종자는 일제히 발아됨을 주지하여야 한다.
본 발명을 수행하기 위한 수단
하나의 관점에서 본 발명은 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터에 관한 것이다. 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌다. 바람직하게는 상기 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된다.
더욱 바람직하게는 본 발명은 서열번호 12로 표시된 서열로 구성된 핵산 분자를 제공한다. 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 또는 더 큰 프로모터 활성을 지닌다. 이러한 핵산 분자는 분열조직을 포함한 뿌리 내에서의 발현을 특이적으로 촉진시키는 프로모터 활성을 지닌다. 본 발명의 지식에 있어서 이러한 프로모터 활성을 부여하는 것이 가능한 서열은 특히 쌀 및 아라비돕시스 내에서 이전에 발견되지 않았으며 따라서 본 발명은 당분야에서 이로운 효과를 달성한다고 기술될 수 있다.
상기-기술된 특이적 서열 범위는 본 발명의 바람직한 서열 범위만을 나타낸다. 본 발명은 한정적이지 않다. 따라서 본 발명은 여기에 기술된 바와 같은 방법에 따라 당업자에 의해 선택된 다른 적당한 구역으로서 특정화될 수 있다. 이러한 선택 방법은 당분야에 잘 알려진 통상적으로 사용되는 기술을 참조함으로서 과도한 실험없이 수행될 수 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 유전자를 발현하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터로서, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하고; 및
2) 원하는 유전자로
구성된다.
상기 기술된 바와 같이 프로모터는 1) 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트에 대해 특이적인 발현을 촉진시킨다. 따라서 이러한 조성물은 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트내에서 특이적으로 발현하는 것이 가능한 시스템, 즉 당분야에서 이로운 유용성을 제공한다.
하나의 실시태양에서 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌다.
또다른 실시태양에서 프로모터는 서열번호 12로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌다. 또다른 실시태양에서 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물이다. 생물체는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물에 한정적이지 않다. 따라서 본 발명의 프로모터는 프로모터가 동일한 효과를 지니는한 식물 이외에 동물 또는 단자엽식물 및 쌍자엽식물 이외의 식물과 같은 생물체로부터 유도된다. 바람직한 실시태양에서 식물은 단자엽식물이다. 더욱 바람직하게는 식물은 쌀, 아라비돕시스, 옥수수, 밀, 보리, 토마토, 오이, 가지, 감자, 상추, 일본 래디쉬 또는 당근이다.
또다른 바람직한 실시태양에서 본 발명의 프로모터의 길이는 또다른 프로모터와 연결된다. 이러한 경우 본래 조직 특이성이 전혀 없거나 약하거나 또는 다른 타입의 특이성을 지닌 프로모터를 본 발명의 프로모터 또는 그의 단편에 연결함으로서 뿌리 및/또는 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트에서 조직 특이적으로 기능할 수 있는 프로모터를 생성하는 것이 가능하다.
또다른 실시태양에서 원하는 유전자는 선충류, 토양 병원균 등에 대해 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리펩티드, 뿌리 및 재분화된 식물체에 대한 선택적 마커의 발달을 촉진시키 것이 가능한 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다.
또다른 실시태양에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 뿌리의 끝 부분을 포함한다. 또다른 실시태양에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 줄기 정점 부분을 포함한다. 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 어린 단자엽식물(즉, 쌀)의 분열조직을 포함한다. 어린 식물에서만 발현을 촉진시킴으로서 도입된 유전자의 생성물이 발현되지 않거나 방치되지 않는 농작물(즉, 쌀)을 생성하는 것이 가능하다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 식물 발현 카세트를 제공한다. 식물 발현 카세트는 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 식물 발현 카세트는 당분야에서 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 생성 기술은 여기에 실시예 내에 예시된다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 플라스미드를 제공한다. 플라스미드는 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 프로모터는 원하는 유전자에 실시가능하게 연결된다. 플라스미드(또는 벡터)는 당분야에서 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 생성 기술은 여기에 실시예 내에 예시된다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 세포를 제공한다. 식물 세포는 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 이러한 식물 세포는 당분야에서 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어 이러한 식물 세포는 본 발명의 플라스미드를 이용하여 형질전환, 세포감염 또는 형질도입에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 여기에 실시예 내에 특정하게 예시되고, 예증된다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 조직을 제공한다. 식물 조직은 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 식물 조직은 예를 들어 본 발명의 식물 세포를 재분화하도록 유발함으로서 생성될 수 있다. 또한 식물 조직 내로 본 발명의 조성물을 직접적으로 주입함으로서 식물 조직이 생성되는 것이 가능하다. 이러한 기술은 당분야에 잘 알려져 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 형질전환 식물을 제공한다. 형질전환 식물은 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 식물 조직은 예를 들어 본 발명의 식물 세포를 재분화하도록 유발함으로서 생성될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 : 쌍자엽식물의 경우(즉, 담배, 아라비돕시스 등) Roger et al., Methods in Enzymology 118:627-640(1986); Tabata et al., Plant Cell Physiol., 28:73-82(1987); Shaw, Plant Molecular Biology: A practical approach. IRL press(1988); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology: A laboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995); 쌀의 경우 Shimamoto et al., Nature 338: 274(1989); Hiei et al., Plant J. 6:271-282(1994); Toki, Plant Mol. Biol. Rep. 15:16-21(1997); 등을 포함하여 당분야에 잘 알려져 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 종자를 제공한다. 식물 종자는 :
1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
2) 원하는 유전자
로 구성된다. 이러한 식물 종자는 번식력을 유지하는 동안 상기-기술된 재분화에 의해 생성될 수 있다. 이러한 재분화 기술은 예를 들어 : 쌍자엽식물의 경우(즉, 담배, 아라비돕시스 등) Roger et al., Methods in Enzymology 118:627-640(1986); Tabata et al., Plant Cell Physiol., 28:73-82(1987); Shaw, Plant Molecular Biology: A practical approach. IRL press(1988); Maliga et al.,Methods in Plant Molecular Biology: A laboratory course. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995); 쌀의 경우 Shimamoto et al., Nature 338: 274(1989); Hiei et al., Plant J. 6:271-282(1994); Toki, Plant Mol. Biol. Rep. 15:16-21(1997); 등을 포함하여 당분야에 잘 알려져 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 :
1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고;
2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
3) 프로모터를 작동하게 하는 조건 하에 식물을 위치시키는 것으로 구성된다. 이러한 방법은 본 발명의 프로모터가 특정화되면 당분야에서 통상적으로 사용되는 잘 알려진 기술로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기에 기술된다.
또다른 관점에서 본 발명은 식물의 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 방법에 의해 수득된 유전자 생성물을 제공한다. 방법은 :
1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰프로모터 활성을 지닌 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고;
2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
3) 프로모터를 작동하게 하는 조건 하에 식물을 위치시키는 것으로 구성된다. 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상은 활발히 증식하는 조직이다. 이렇나 방법으로 큰 부피의 원하는 유전자가 수득될 수 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 :
1) 플라스미드에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터를 함유한 플라스미드를 제공하고;
2) 식물 세포를 플라스미드로 형질전환시키고; 및
3) 형질전환된 식물 세포를 배양하는 것으로 구성된다. 플라스미드를 제공하는 방법, 형질전환 방법 및 배양 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 이미 여기에 기술되어 있다.
본 발명자는 이미 살 카탈라제 CatB 유전자의 구조를 분리하고 분석하였다(DDBJ 등록번호 : D64013). 또한 5'-상위 프로모터 구역(-1066 ∼ +298 : 이러한 DNA 단편은 여기서 BΔ0으로 불리고, cDNA 시작점은 +1로 표기된다)은 수용체 유전자와 융합된다(베타-글루쿠로니다제(GUS)). 이러한 결합은 프로모터 활성의 측정을 위한 지표로서의 일시적인 유전자 발현에 기인한 GUS 효소 활성을 이용하기 위해 쌀 배양 세포주(Oc 세포)로부터 제조된 프로토플라스트(protoplast) 내로 일렉트로포레이션을 이용하여 도입되었다. 그 결과로서 식물 내로 유전자 도입에 통상적으로 이용되는 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터보다 약 20배 더 큰 활성을 지닌 것으로 나타났다. 따라서 프로모터는 유용한 유전자를 발현하기 위한 프로모터 카세트를 생성하는데 이용될 수 있음이 판명되었고, 본 발명은 특허출원으로 완성되었고 제출되었다(일본 특허 제2955644 "쌀 CatB 유전자 프로모터").
또한 노던 하이브리디제이션 분석에 의해 본 발명자는 CatB가 어린 쌀 식물의 뿌리에서는 강하게 발현되는 반면 성숙된 개체내에서는 발현되지 않고; 잎, 줄기 및 꽃에서 강하게 발현되지 않음을 판명하였다(Iwamoto et al., Plant Science 151:39-46(2000))(표 1).
쌀 카탈라제 유전자 발현의 기관 특이성의 요약(주요 발현 사이트)
유전자 명칭 어린 쌀 슈트의 발현 기관 개화-단계 쌀의 발현 기관
CatA 잎집 꽃밥
CatB 뿌리 (-)
CatC 잎사귀 잎사귀
(Iwamoto et al., Plant Science 151:39-41(2000)에 의해 발표된 노던 분석데이터 및 이후 수득된 데이터의 요약)
상기-기술된 결과를 기초로 기관 특이성을 조절하는 CatB 유전자 프로모터 구역(일본 특허등록 제2955644호)의 부분을 확인하는 시도가 되었다.
특히 CatB 유전자 프로모터 구역 BΔ0으로부터 5'-사이드 구역을 삭제함으로서 생성된 다양한 DNA 단편은 수용체 유전자(GUS)와 융합되었고, 이후 벡터 내로 도입되었다(도 1 및 2). 벡터는 형질전환을 위해 쌀 및 아라비돕시스 내로 도입되었다. 재분화된 식물의 첫 번째 세대 또는 하위 세대 식물의 다양한 조직은 발현 사이트를 조사하기 위해 GUS 조직 염색되었다.
그 결과로서 cDNA 시작점(+1)의 -329 ∼ +298 상위의 짧은 프로모터 DNA 단편(B1) 조차도 수용체 유전자가 어린 쌀 식물의 뿌리(도 3, 표 2 및 3) 및 어린 아라비돕시스 식물의 뿌리 및 줄기 정점(도 4, 표 4) 내에서 발현되도록 유발할 수 있다.
어린 쌀 식물의 GUS 염색의 요약(To, 재분화된 첫 번째 세대)
강하게 염색된 사이트 BΔ0-도입된 쌀 BΔ3-도입된 쌀 BΔ1-도입된 쌀 BΔ2-도입된 쌀
뿌리 25 12 13 3
뿌리,잎집,잎사귀 0 4 0 0
잎집,잎사귀 6 ND 12 9
염색없음 4 0 2 4
총계 35 16 27 16
숫자 : 개체수; ND = 측정되지 않음(조사없음)
개화-단계 쌀 식물의 GUS 염색의 요약(To, 재분화된 첫 번째 세대)
강하게 염색된 사이트 BΔ0-도입된 쌀 BΔ3-도입된 쌀 BΔ1-도입된 쌀 BΔ2-도입된 쌀
뿌리 0 0 2 1
뿌리,잎집,잎사귀 3 1 1 0
잎집,잎사귀 8 3 8 7
염색없음 0 2 1 2
총계 11 6 12 10
어린 아라비돕시스 식물의 GUS 염색의 요약(T2 세대)
염색된사이트 B1-1 B1-2 B1-3 B1-4 B1-5 B2-3 B2-4 B2-5 B2-6 B2-8
뿌리만
줄기 정점만 13 8 9
뿌리,줄기 정점 1 23 7 20 19 1 1
뿌리,줄기 정점,다른 기관 7 6 1
줄기 정점,다른 기관 5 9 12 4
다른 기관 7
염색없음 4 2 8 6 1 24 6 10 10
총계 12 25 21 26 24 24 24 24 24 24
도입된 B1::GUS 컨스트럭트를 지닌 첫 번째 세대 재분화된 쌀 식물의 약 반에서 수용체 유전자가 뿌리에서 강하게 발현되었더라도 발현의 기관 특이성의 규모는 형질전환 식물 개체들 사이에서 변화한다(도 1에서의 B1). 유사하게 쌀의 경우 수용체 유전자가 줄기 정점에서 강하게 발현되었음이 고려된다.
어린 쌀 식물의 뿌리에 대한 발현 특이성은 프로모터 구역의 5'-사이드 더 큰 구역이 삭제되면 감소된다. BΔ0(71%) = BΔ3(75%) > B1(48%) > B2(19%)는 가장 높은 발현 특이성의 순서이다(표 2). 프로모터 구역이 길수록 발현 특이성이 강해진다. B1로부터 조차도 원하는 식물이 재분화된 개체군으로부터 스크린된다면 특이적인 발현을 수행하는 식물체를 수득하는 것이 가능하다. 따라서 BΔ0, BΔ3 또는 B1은 목적에 따라 달라질 수 있다.
-329 ∼ -227이 없는 프로모터(B2)는 쌀과 아라비돕시스의 뿌리에서 매우 감소된 발현 수준을 지닌다(표 2 및 4). 따라서 이러한 -329 ∼ -227 구역은 뿌리에서의 발현에 필수적이다. 이러한 구역은 뿌리에서의 발현에 관련된 어떤 알려진 시스(cis) 요소도 지니지 않는다. 신규한 시스 요소가 이러한 구역에 존재한다는 것은 매우 가능하다.
이러한 결과에 따라 특허 출원으로 앞서 제출된 쌀 카탈라제 CatB 유전자로부터 유도된 1,364-염기 프로모터 구역의 약 630 염기까지의 길이를 지닌 다양한 서열이 단자엽식물(즉, 쌀 등) 및 쌍자엽식물(즉, 아라비돕시스 등)의 어린 식물의 뿌리 및 줄기 정점 내에서 외부 유전자를 발현하는데 이용될 수 있는 방법이 발달되었다.
일반적으로 프로모터의 염기 서열의 보존성이 낮다. 몇 백개 염기의 프로모터 염기 서열을 이용한 스크리닝에 의해 유사한 수준의 활성을 지닌 프로모터를 검출하는 것이 용이하지 않다. 전사 조절 인자(단백질)가 결합하는 프로모터 구역 사이트(시스 요소)의 보존성은 높다. 따라서 본 발명의 특정한 서열에 기초하여 컴퓨터를 이용한 시스 요소 데이터베이스 검색에 의해 많은 시스 요소 후보가 수득된다. 생물정보과학 기술이 시스 요소 후보가 실제로 기능하는지를 결정하는데 이용될 수 있다.
이후 본 발명은 실시예를 통해 기술될 것이다. 하기의 실시예는 예시를 목적으로만 제공된다. 따라서 본 발명의 범위가 동반된 청구항에 의한 것을 제외하고는 실시예에 의해 한정되지 않는다.
(실시예 1) 쌀 카탈라제 CatB 유전자의 분리
쌀 카탈라제 CatB 유전자를 분리하는 방법이 일본 특허 제2955644호 "살 CatB 유전자 프로모터"(등록일자 " 1999년 1월)에 기술되어 있다. 간단히 방법이 기술될 것이다.
게놈 라이브러리로부터의 스크리닝
CatA cDNA의 부분이 CatB 유전자의 클로닝에 이용되었다. CatA cDNA의 클로닝 동안 수득된 비-전체-길이 cDNA(5'-비번역 구역의 약 450 bp 및 일부 코드 구역이 삭제된 약 1.8 kbp의 전체 길이의 3'-말단 1.35 kbp)를 함유한 λ파지(클론 #51)의 삽입 부분이 PCR에 의해 증폭되었다. DNA는 동일한 파지로부터 제조되었고, 주형으로 사용되었다. 프라이머로서 λgt11-전방 프라이머 및 λgt11 역 프라이머(Toyobo Co., Ltd.)가 사용되었다. 생성물은 25ng/10㎕의 농도로 센트리콘(Centricon)-100(Amicon)을 이용하여 정제되었고, 멀티-프라임 표지 방법을 위한 프로브(Amersham)로서 사용되었다.
CLONTECH Laboratories Inc.(Palo Alto, CA, US)에서 구입한 쌀 게노믹 DNA 라이브러리(쌀 게놈 라이브러리)가 하기와 같이 CatB 유전자에 대해 스크린되었다. 게놈 라이브러리를 함유한 파지 λEMBL-3이 일반적으로 사용되는 방법에 따라 E. coli 균주 NM538을 감염시키는데 이용되어 파지 플라크가 형성되었다. 파지 플라크는 상기-기술된 프로브에 하이브리다이즈되도록 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 프로브는32P로 표지되었음을 주지해야 한다.
하이브리디제이션 용액 : 6x SSC-0.1% SDS, 5x Denhardt's, 100㎍/ml 연어정자 DNA; 하이브리디제이션 온도: 65℃; 하이브리디제이션 시간: 오버나이트.
이후 멤브레인은 하기의 상대적으로 순한 조건하에서 세척되었다. 세척 조건: 2x SSC-0.1% SDS, 상온, 5분 + 30분; 1x SSC-0.1% SDS, 68℃, 1시간.
세척후 나일론 멤브레인은 프로브에 하이브리다이즈하는 클론을 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법에 따라 방사능사진촬영되었다. DNA는 하이브리디제이션을 착수하는지 확인된 각각의 파지로부터 제조되었다.
상기-기술된 파지 DNA는 제한효소 SalⅠ 및 ScaⅠ의 결합으로 분해되었다. 분해된 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었다. 분리된 DNA 단편은 프로브로서 상기-기술된 CatA cDNA 단편에 하이브리다이즈되는 것이 가능하도록 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 하이브리디제이션 조건은 상기와 동일하다. 멤브레인은 하기의 조건하에서 세척되었다. 세척 조건: 2x SSC, 상온, 5∼10분, 2시간; 2x SSC-0.1% SDS, 65℃, 30분.
세척후 나일론 멤브레인은 프로브에 하이브리다이즈하는 클론을 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 잘 알려진 방법에 따라 방사능사진촬영되었다.
실질적으로 동일한 시그널 강도 및 밴드 패턴을 지닌(즉, 동일한 구조를 지닌 것으로 추론됨) 클론 및 단지 부분적으로-매치된 밴드 패턴을 지닌 클론의 그룹이 있다. 실질적으로 동일한 시그널 강도 및 밴드 패턴을 지닌 전자 클론은 CatA 유전자에 상응하는 것으로 여겨진다. 실질적으로 클론 제74호가 CatA cDNA에 상응하는 유전자였다. 반대로 단지 부분적으로-매치된 밴드 패턴을 지닌 후자 클론은 아마도 CatA 유전자 또는 CatA 유전자 이외의 카탈라제 유전자 클론이 없는 클론이었다. 따라서 CatA cDNA는 하기의 순한 조건 또는 스트린전트 조건 하에서 하이브리디제이션을 수행하는 프로브로서 이용될 수 있고, 결과적인 패턴은 서로 비교되었다.
순한 하이브리디제이션 조건: 50% 포름아마이드-첨가된, 6x SSC-0.1% SDS, 5x Denardt's, 100㎍/ml 연어 정자 DNA; 하이브리디제이션 온도: 37℃; 하이브리디제이션 시간: 오버나이트.
멤브레인에 대한 세척 조건은 상기와 동일하였다: 2x SSC-0.1% SDS, 상온, 5분 + 30분; 1x SSC-0.1% SDS, 68℃, 1시간.
스트린전트 하이브리다이즈 조건: 50% 포름아마이드-첨가된, 6x SSC-0.1% SDS, 5x Denardt's, 100㎍/ml 연어 정자 DNA; 하이브리디제이션 온도: 42℃; 하이브리디제이션 시간: 오버나이트.
멤브레인에 대한 세척 조건은 상기와 동일하였다: 2x SSC-0.1% SDS, 상온, 5분 + 30분; 1x SSC-0.1% SDS, 68℃, 1시간.
스트린전트 조건하에서의 하이브리디제이션한 결과 표준 하이브리디제이션과 동일한 수의 밴드가 검출되었다. 반대로 순한 조건하에서의 하이브리디제이션은 스트린전트 조건하에서의 하이브리디제이션 보다 큰 많은 밴드를 나타내었다. 이들 결과에 따라 단지 부분적으로-매치된 밴드 패턴만을 지닌 클론이 CatA와 유사한 매우 가능성의 DNA였고, 부분적으로 다른 염기서열 즉, CatA 이외의 카탈라제 유전자를 지니나 CatA 유전자-부재 클론은 아님이 판명되었다.
단지 부분적으로-매치된 밴드 패턴만을 지닌 약 20개 클론이 카탈라제 동질효소(isoenzyme) 유전자의 후보로 고려되었고 더욱 분석되었다. 이들 클론 중에 클론 제7호가 서던 분석, 부분적 염기서열분석, CatA 염기서열에 기초한 PCR 분석 등에 딸 CatA와 다른 카탈라제 유전자로 추론되었다. 또한 클론 제7호는 CatB cDNA의 서열과 다른 서열을 지니는 것으로 판명되었고, CatC로 명명되었다. CatC의 염기서열은 Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry 68, 404(1994)에 기술되어 있다.
CatA 및 클론 제7호(CatC)와 다른 패턴을 지닌 클론이 있었다. 클론 중에 클론 제6호는 더욱 상세히 분석되었다. 또한 클론 제6호의 DNA의 염기서열은 부분적으로 분석되었다. 이러한 서열을 CatB 유전자의 cDNA 서열과 매치하였다(Plant Physiol.(1994) 105:1015-1016).
상기-기술된 정보에 기초하여 2개의 DNA 올리고머(oligomer)는 CatB 유전자의 5'-비번역 구역을 수득하기 위해 합성되었다.
GGTCGATTCTCATCTCTCCCACAACAAATC : 서열번호 6(CatB cDNAdml 102∼131에 상응)
CAATGTCTCAGGGCTTCCACGCTCATGCAC : 서열번호 7(CatB cDNAdml 484∼455에 상응)
반대로 쌀 cDNA 라이브러리는 캘러스로부터 제조되었다. 이러한 cDNA 라이브러리의 DNA는 주형으로서 사용되었고, 상기-기술된 2개의 합성된 DNA는 표준 조건하에서 PCR을 수행하는 프라이머로서 사용되었다. 증폭후 약 400-bp DNA 단편이 수득되었다. 이들 400-bp DNA 단편은 CatB 유전자로 여겨지는 상기-기술된 클론을 다시 스크린하는 프로브로서 사용되었다. 그 결과로서 일부 하이브리다이즈가능한 클론이 수득되었다.
이들 중에 상기-기술된 클론 제6호는 PCR 증폭에 의해 수득된 400 bp의 적어도 약 1 kbp 상위 이상의 5'-상위 구역을 지녔고, 전체 길이는 적어도 약 5 kbp 이상이었다. 이러한 클론은 클론 U6로 명명되었다. 클론 U6의 제한효소 지도가 생성되었다(나타내지 않음).
약 1 kbp의 5'-상부 구역을 함유한 단편(SalⅠ-Eco RI 분해된 단편) 및 그의 하부 단편(Eco RI-Eco RI 분해된 단편)은 클론 U6으로 절단되었고, 서열 분석을 위해 벡터(pUC18)내로 삽입되어 염기서열의 결정을 위한 매우 큰 5' 세그먼트 및 3' 세그먼트가 단계적으로 부재한 많은 플라스미드를 생성하였다. 따라서 CatB(4985 bp)의 핵산 서열은 서열번호 2로 표시된다.
(실시예 2) CatBΔ0(-1066 ∼ +298)-GUS/pBⅠ121의 구조
CatBΔ0(-1066 ∼ +298)-GUS/pBⅠ121는 일본 특허 제2955644 "쌀 CatB 유전자 프로모터" 내에 기술된 바와 같이 구조되었다. 간단히 이러한 구조가 하기에 기술될 것이다.
수득된 CatB 유전자는 4985 bp 길이였다. 또한 첫 번째 엑손은 서열번호 2의 1073∼1216에 존재하고; 두 번째 엑손은 1333∼1429내에 존재하고; 세 번째 엑손은 2341∼2618내에 존재하고; 네 번째 엑손은 2970∼3746내에 존재하고; 다섯 번째 엑손은 3968∼4057내에 존재하고; 여섯 번째 엑손은 4252∼4319내에 존재하고; 일곱 번째 엑손은 4410∼4503내에 존재하고; 여덟 번째 엑손은 4616∼4881내에 존재하고, 첫 번째 내지 일곱 번째 인트론은 상응하는 엑손 사이에 존재한다. 상기-기술된 서열에 기초하여 프로모터 구역은 1073 전에 위치한 서열로 추론되었다. 이러한 서열 정보는 프로모터 구역을 절단하는데 이용될 수 있다. 쌀 CatB 유전자 프로모터를 지닌 플라스미드 CatB-GUS-Δ0가 하기에 제조되었다.
클론 U6은 2.3-Kbp 단편을 절단하는 SalⅠ 및 EcoRI로 분열되었다. 이러한 단편은 SalⅠ 및 EcoRI로 분열된 pUC18에 연결되었다. 결과적인 재조합 플라스미드는 Eco47Ⅰ(Toyobo Co., Ltd. 제조)로 분해되었고, 약 2-kbp 단편이 수집되었다. 이러한 단편은 DNA 중합효소의 Klenow 단편으로 분해되고, PstⅠ로 분해되었다. 그 결과로서 클론 U6의 7∼1370으로부터의 서열(서열번호 2)을 지닌 단편 A가 수득되었다. 이러한 단편 A는 첫 번째 엑손의 상위 서열, 첫 번째 엑손, 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손의 일부를 함유하였다. 단편의 5'-말단은 PstⅠ이고, 3'-말단은 블런트 말단이다.
식물 세포의 발현 벡터 pBI221(Clonetech)은 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, β-글로쿠로니다제(GUS) 코딩 구역 및 노팔린(nopaline) 합성효소 종결자(NOS-T)를 지닌다. 이러한 큰 단편 B는 CaMV 35S 프로모터 구역은 pBI221로부터 제거되게 된다. 큰 단편 B는 클론 U6의 7∼1370의 서열을 지닌 단편 A에 연결되어 CatB-GUS-Δ0을 생성한다.
쌀 세포의 형질전환 및 GUS 유전자의 발현
하기의 조성물을 지닌 AA 배지의 70ml가 300-ml 플라스크 내에 위치되었다. 쌀 Oc 세포가 순하게 교반되면서(90 rpm) 현탁액 배양되었다.
AA 배지의 조성(Mol. Gen. Genet. 161:67-76(1978))
1) 무기염 농도(mg/l)
MnSO4·4-6H2O10
H3BO33
ZnSO4·7H2O2
Na2MoO4·2H2O0.25
CuSO4·2H2O0.025
CoCl2·6H2O0.025
KI0.75
CaCl2·2H2O150
MgSO4·7H2O250
NaH2PO4·H2O150
KCl3,000
2) 철 성분
Fe-EDTA40
3) 비타민 ·유기 성분
슈크로스40
니코틴산 1-염산티아민10
염산피리독신1
미오-이노시톨100
L-아르기닌177
L-글리신7.5
L-글로타민900
L-아스파르트산300
4) 호르몬산
2,4-D1
키네틴0.2
GA30.1
배양액의 10ml가 매주 70ml의 신선한 배지로 옮겨졌다. 옮긴후 5-일 세포가 프로토플라스트를 생성하는데 사용되었다. 프로토플라스트는 Mol. Gen. Genet. 206:408-413(1987)에 기술된 방법에 따라 생성되었다. 5-일 하위배양된 캘러스 세포 현탁액은 플라스틱 페트리디쉬로 옮겨졌다. 배지는 흡출기로 제거되었다. 20ml의 효소 용액(4% 캘러스 RS(Yakult), 1% 마세로자임(macerozyme) R10(Yakult), 0.4M 만니톨, 0.5% CaCl2·2H2O, 0.5% 덱스트란 황산칼륨). 페트리디쉬는 파라필름으로 덮였고, 28℃ 어두운 곳에서 놓아두었다. 약 5시간 후 배지는 나일론 메쉬 여과되어 분해되지 않은 물질을 제거하였고, 이어서 반복적으로 세척하였다.
이와같이-수득된 프로토플라스트는 EP 완충액(5mM MgCl2, 70mM KCl, 0.1% MES, 0.4M 만니톨;pH 5.6으로 증류수가 첨가됨; 멸균은 필터를 이용하여 수행됨, Nature 338:274-276(1989)) 내에 현탁되었다. 현탁액의 일부(0.5ml)가 취해지고, 20㎍/ml의 상기-기술된 플라스미드 DNA 및 연어 30㎕/ml의 정자 DNA와 혼합되었다. 이후 혼합물은 정전용량이 500㎌이고, 저항은 100Ω인 Gene-Pulser(Bio-Rad, CA)를 이용하여 디스포살 큐베트(disposal cuvette)(전극 사이의 거리는 0.4㎝) 내에서 일렉트로포레이션(300 V/㎝)되었다. 프로토플라스트는 10분간 얼음 상에서 인큐베이트되었다. 1.5ml의 R2P 배양 배지가 프로토플라스트 내로 첨가되었다. 혼합물은 Millicell(Millipore, CA) 내에 위치되었다. Millicell은 5ml의 R2P 배지를 함유한 6-㎝ 플라스틱디쉬 내에 위치되었다. 널스 셀(nurse cell)이 Millecell 외부에 첨가되었다. 배양은 28℃ 어두운 곳에서 수행되었다. 널스 셀의 존재는 CatA-GUS-Δ0, CatB-GUS-Δ0 및 CatC-GUS-Δ0의 발현상에 아무런 영향을 미치지 않았다.
R2P 배지의 조성
(1) 주요 성분 농도(mg/l)
KNO34000
(NH4)2SO4335
MgSO4·7H20250
CaCl2·2H20150
NaH2PO4273
(2) 적은 성분
MnSO4·4-6H2O1.6
ZnSO4·7H2O2.2
CuSO4·5H2O0.125
H3BO33.0
NaMoO4·2H2O0.125
Na2EDTA7.5
FeSO4·7H2O5.5
(3) 유기 성분(mg/ml)
이노시톨100
니코틴산1.0
염산피리독신1.0
염산티이민10
슈크로스(g/l)137
2,4-D(mg/l)2.0
pH 5.6
GUS를 활성화시키기 위한 프로토플라스트는 하기와 같이 "Rabo-manyuaru : Shokubutsu-idennshi-no-kino-kaiseki [Laboratory Manual : Analysis of Plant Gene Functions] (Masaki Iwabuti ·Toshiro Shimura, Maruzen, 1992, P. 55)에 기본적으로 기술된 바와 같이 처리되었다. 일렉트로포레이션 후 프로토플라스트는 28℃ 어두운 곳에서 4일간 배양되었다. 결과적인 프로토플라스트는 1-ml Falcon 피펫(#7521)을 이용하여 수집되었고, 1.5ml의 마이크로튜브에 놓였고, 상온에서 3분간 9,000 rpm으로 원심분리되었다. 결과적인 펠렛은 분석전까지 -80℃에서 보관되었다.
200㎕의 추출 완충액(50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0), 10mM Na2EDTA, 0.1% TritonX-100, 0.1% 소듐 라우릴 사크로신, 10mM β-멀캅토에탄올)이 5분간 얼음물 내의 동결된 펠렛로 첨가되어 녹게하였다. 혼합물은 조건: 아웃풋 컨트롤 2 및 듀티(Duty) 사이클 10% 하에서 울트라-소니케이션 장치(Branson Sonifier model 250)에 의해 1분간 처리되었다. 처리후 혼합물은 15,000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리되었다. 상청액(프로토플라스트 추출물)이 수집되었고, GUS 활성을 측정하기 위한 표본으로 사용되었다. 표본의 단백질 농도는 Bradford 방법(Anal. Biochem 72:248-254(1976))에 의해 측정되었다.
GUS 활성은 Jefferson et al.(상동) 내에 기술된 방법에 따라 측정되었다. 내생적 GUS 활성은 20%(v/v) 메탄올을 반응 용액에 첨가함으로서 최소화되었다. 결과는 적어도 2회 이상의 실험으로부터 수득되었고, 각각은 동일한 실험에서 3반복(3개 표본)되었다.
이들 결과는 CatB 유전자 프로모터가 대조군 즉, CaMV CatA 및 CatC 프로모터(나타나지 않음)와 비교하여 상당히 높은 수준의 활성을 지닌다.
(실시예 3) PCR 방법에 의한 CatB의 시작 코돈의 기초 변형과 5'-상위 DNA 단편(B1 단편, B2 단편)의 생성 및 플라스미드의 구조
시작 코돈 내에 점돌연변이를 지닌 쌀 카탈라제 유전자 CatB5'-상위 DNA 단편(B1 단편 및 B2 단편)이 PCR 방법에 의해 생성되었다. B1 단편(-329 ∼ +298, cDNA의 시작점은 +1로 표기됨)은 주형으로서 CatBΔ0(-1066 ∼ +298)-GUS/pBI121 및 HindⅢ 분열 사이트를 DNA 단편의 5'-말단의 근처에 도입하기 위한 프라이머인 3D3-F1(5'-GTG AAG CTT TCG ATC ATG AGC GAG-3')(서열번호: 8) 및 CatB의 시작 코돈 ATG의 T를 C로 대치시키기 위한 프라이머인 BD3-MR(5'-GTA GGG ATC CGT GGC GTG ATT TG-3')(서열번호: 9) 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성되었다.
B2 단편(-226 ∼ +298)은 HindⅢ 분열 사이트를 DNA 단편의 5'-말단의 근처에 도입하기 위한 프라이머인 3D3-F2(5'-GTT AAG CTT GTC TTA TCT CCT CGT GAT CC-3')(서열번호: 10) 및 BD3-MR을 이용한 PCR 증폭에 의해 생성되었다.
수득된 DNA 단편은 제한효소 HindⅢ 및 BamHI로 처리되었고, 이후 DNA 라이게이션 키트 Ver.2(Takara Shuzo)를 이용하여 HindⅢ 및 BamHI로 처리된 벡터 CatBΔ0-GUS/pBI221의 GUS 유전자의 상위 구역 내로 통합되었다. 벡터는 형질전환용 E. coli인 적당히 높은 DH5 알파(Toyobo Co., Ltd.) 내로 통합되었다. 벡터는 E. coli로부터 정제되었고, 염기서열이 측정 및 확인되었다. 벡터는 제한효소 HindⅢ 및 EcoRI로 처리되어 B1 또는 B2 단편을 함유한 DNA 단편, GUS 유전자 및 노팔린 합성효소 유전자 종결자(NOS-ter)로 절단되었다. 이러한 DNA 단편은 HindⅢ 및 EcoRI로 처리된 이원 벡터 TN2(Fukuoka et al., Plant Cell Reports 19:815-820(2000)) 내로 통합되었다.
(실시예 5) 유전자의 식물 내로의 도입
pTN2는 아그로박테리움(EHA105)을 이용한 Hiei et al.(Plant J. 6:271-282(1994)) 및 Toki(Plant Mol. Biol. Rep. 15:16-21(1997))에 기술된 방법에 따라 쌀(품종: Nipponbare) 내로 도입되었다.
pTN2는 "Moderu-shokubutsu-no-Jikken-Purotokoru For Ine ·Shiroinunazuna : Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu 4; Genatsu-Shitsujyun-
ho-niyoru-Keishitsu-tenkan [Experimental Protocol for Model Plants For Rice andArabidopsis thaliana: Cellular Engineering, Special Issue, Plant CellularEngineering Series 4; Transforamtion by a vaccum infiltration method"(Takashi Araki) pp. 109-113(Ko Shimamoto and Kiyotaka Okada에 의해 통제됨)에 기술된 방법으로부터 부분적으로 변형된 방법에 의해 아라비돕시스 내로 도입되었다.
(실시예 6) 식물의 GUS 조직 염색 방법
GUS 활성은 "shokubutsu-no-saibo-wo-miru-jikken-purotokoru: Idenshihat-
sugen-kara-saibonaikouzou ·kino-made; Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo
-kogaku 냐갸켜 62-3; Saibo-reberu-de-GUSkassei-wo-miru-hoho [Experimental Protocol for Observing Plant Cells: From Gene Expression to Intracellular Structure ·Function; Cellular Engineering, Special Issue, Plant Cellular Engineering Series 62-3; Method for Observing GUS activity at Cellular Level], (Misa Takahashi and Hiromichi Morikawa), pp. 71-79(Hiroho Fukuda, Mikio Nishimura, and Kenzo Nakamura에 의해 통제됨) 내에 기술된 방법으로부터 부분적으로 변형된 방법에 의해 관찰되었다.
① X-Gluc 용액[100mM 인산염 완충액(pH 7.0), 1mM X-Gluc, 0.3mM 페리시안칼륨, 0.3mM 페로시안칼륨, 0.2% 트리톤-X100]이 제조되었다.
② 500㎕의 X-Gluc 용액은 24-웰 적정 플레이트의 각 웰 내로 분산되었다.
③ 쌀 및 아라비돕시스의 각각의 조직 또는 섹션이 웰 내에 위치되었고, 28℃에서 16시간 동안 처리되었다.
④ X-Gluc 용액이 제거되었다. 70% 에탄올이 탈색을 위해 첨가되었다.
⑤ 70% 에탄올이 제거되었고, 조직 ·섹션이 50% 글리세롤 용액 내에 담겼다.
⑥ 조직 ·섹션이 현미경 또는 실체현미경에 의해 관찰되었다.
결과
기관 특이성의 규모는 형질전환된 식물 개체들 사이에서 다양하다. 그럼에도불구하고 도입된 B1::GUS 컨스트럭트(도 1의 B1)을 지닌 첫 번째 세대 재분화된 쌀 식물의 약 반에서 수용체 유전자가 뿌리에서 강하게 발현되었다. 형질전환된 아라비돕시스의 경우 수용체 유전자는 도입된 B1::GUS 컨스트럭트를 지닌 아라비돕시스 T2 세대의 대부분에서 뿌리 및 줄기 정점 내에서 강하게 발현되었다(도 1의 B1).
이러한 프로모터를 이용함으로서 뿌리 내에서 선충류 또는 토양 병원균에 대한 저항성 물질을 합성하고; 뿌리 내의 뿌리의 발달을 촉진시키는 물질을 합성하고; 식물이 어릴 때 재분화된 식물체 내의 선택적 마커의 발현이 뿌리에 제한되어식물이 성숙되면 발현이 억제되는 유전자 재조합 식물을 생성하는 것이 가능하다. 또한 줄기 정점에서의 발현 능력은 활발하게 번식하는 세포 내에서 유전자 발현을 억제하기 위한 기술을 발달시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 CatB 유전자 프로모터 구역의 염기 서열 부분은 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 외부 유전자를 발현하는데 이용할 수 있다. 따라서 이러한 프로모터는 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 또는 세포 외부로 분비된 물질을 이용한 유전자 조작에 의해 식물(즉, 쌀 등)을 번식하기 위해 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나의 사이트 내에 특이적인 프로모터의 발달에 유용하다.
예를 들어 이러한 프로모터를 이용함으로서 선충류 또는 토양 병원균에 대한 저항성 물질을 합성하고; 뿌리 내에서 뿌리 발달을 촉진시키는 물질을 합성하고; 재분화된 식물체 내의 선택적 마커의 발현이 뿌리에 제한되어 식물이 성숙되면 발현이 억제되는 유전자 재조합 식물을 생성하는 것이 가능하다.

Claims (22)

  1. 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 12로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터
  4. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 조성물
  5. 제 4항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 11로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 조성물
  6. 제 4항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 12로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 조성물
  7. 제 4항에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물임을 특징으로 하는 조성물
  8. 제 4항에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물임을 특징으로 하는 조성물
  9. 제 4항에 있어서, 상기 식물은 쌀, 아라비돕시스, 옥수수, 밀, 보리, 토마토, 오이, 가지, 감자, 상추, 일본 래디쉬 또는 당근임을 특징으로 하는 조성물
  10. 제 4항에 있어서, 상기 원하는 유전자는 저항성을 부여하는 것이 가능한 폴리펩티드, 뿌리의 발달을 촉진시키는 것이 가능한 펩티드 및 재분화된 식물체에 대한 선택적 마커로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자임을 특징으로 하는 조성물
  11. 제 4항에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 뿌리의 끝 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
  12. 제 4항에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 어린 단자엽식물의 분열조직 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
  13. 제 4항에 있어서, 상기 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트는 줄기 정점 부분을 포함함을 특징으로 하는 조성물
  14. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 식물 발현 카세트
  15. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 상기 프로모터는 원하는 유전자에 실시가능하게 연결됨을 특징으로 하며, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하기 위한 플라스미드
  16. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 세포
  17. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 조직
  18. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 형질전환 식물
  19. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지닌 프로모터; 및
    2) 원하는 유전자 :
    로 구성되고, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물 종자
  20. 1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하고;
    2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
    3) 프로모터가 작동하게 하는 조건하에 식물을 위치시키는 것 :
    으로 구성된, 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트내에서 원하는 유전자를 발현하는 방법
  21. 1) 식물에 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성된 프로모터를 인코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하고;
    2) 식물에 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공하고; 및
    3) 프로모터가 작동하게 하는 조건하에 식물을 위치시키는 것 :
    으로 구성된 식물 내에서 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하는 방법에 의해 수득된 유전자 생성물
  22. 1) 서열번호 1로 표시된 서열의 적어도 10 이상의 인접 뉴클레오타이드의 서열로 구성되고, 서열번호 1로 표시된 서열과 실질적으로 동일하거나 더 큰 프로모터 활성을 지님을 특징으로 하는 프로모터를 함유한 플라스미드를 제공하고;
    2) 상기 플라스미드로 식물 세포를 형질전환하고; 및
    3) 형질전환된 식물 세포를 재배하는 것 :
    으로 구성된 뿌리 및 줄기 정점의 적어도 하나 이상의 사이트 내에서 원하는 유전자를 발현하도록 적응된 식물을 생성하는 방법
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