CN116445502A - 二色补血草基因Lb2G12567及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二色补血草基因Lb2G12567及其应用。本发明首次从二色补血草中克隆得到基因Lb2G12567及其启动子，并分析了启动子元件。基于VIGS技术，构建Lb2G12567基因沉默载体，注射六叶龄二色补血草后进行表达量鉴定和表型观察，与对照组对比发现Lb2G12567基因沉默后盐腺数量明显减少，叶圆盘分泌实验发现基因沉默株系的泌盐能力明显下降，经由DAB和NBT染色验证其抗逆程度显著下降，表明基因Lb2G12567与盐腺发育的形态建成表现为与盐腺数量有关，正向调控盐腺发育，且在二色补血草内与基因调控通路配合特异性发挥功能。本发明为泌盐盐生植物盐腺发育的机理研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因Lb2G12567及其应用。
背景技术
我国是人口大国，粮食问题是国家发展的基础保障。利用或者改良盐碱地不仅可以增加土地资源缓解粮食问题，还能够改善环境涵养水土提高环境质量。
盐生植物，因其能够在盐碱地上正常生长、乃至适量的盐有助于其生长而被广泛研究。根据抗盐机理不同，盐生植物被分为三种类型，其中泌盐盐生植物通过利用特殊结构将体内多余的盐分排出来适应盐环境。二色补血草是一种具有特殊泌盐结构盐腺的泌盐盐生植物，其盐腺由十六细胞组成的复合体，其分泌功能以及表观特征都有了具体且深入的研究，但它的具体发育机制还有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供二色补血草基因Lb2G12567及其应用。
本发明基于二色补血草的转录组等研究，在前期对LbSAD2基因(SEQ ID NO:4)的基础研究上，筛选到LbSAD2基因的下游互作基因Lb2G12567，针对Lb2G12567基因在盐腺中的功能及对盐腺发育的作用展开探究。
第一方面，本发明提供二色补血草基因Lb2G12567，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
基因Lb2G12567全长为：
1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供二色补血草基因Lb2G12567启动子，其为：
i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的Lb2G12567基因全长549bp，编码182个氨基酸，定量PCR显示在盐腺发育时期具有高表达量，亚细胞定位于细胞核，属于非跨膜蛋白。克隆得到Lb2G12567的启动子序列2000bp，具有参与脱落酸反应的顺式作用元件(ABRE)，参与MeJA反应的顺式作用元件(CGTCA-motif)，参与赤霉素反应的顺式作用元件(TATC box)以及水杨酸反应元件(TCA-element)，同时还具有CGTCA-motif(MBS)。
第三方面，本发明提供含有所述基因Lb2G12567或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。
第四方面，本发明提供所述基因Lb2G12567、所述启动子或含有所述基因Lb2G12567或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。
第五方面，本发明提供所述基因Lb2G12567或含有该基因的生物材料的以下任一应用：
(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；
(2)用于调控泌盐盐生植物的泌盐能力；
(3)用于调控泌盐盐生植物的抗逆性；
(4)用于植物品种改良。
其中，(1)～(3)中所述的调控为正调控，例如正调控盐腺数量、盐腺泌盐能力等。
优选地，所述植物为二色补血草。
第六方面，本发明提供一种使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常、泌盐能力下降、抗逆性下降的方法，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因Lb2G12567，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因Lb2G12567的表达。
所述方法包括：利用VIGS技术沉默二色补血草的基因Lb2G12567。
进一步地，构建插入二色补血草基因Lb2G12567片段的重组病毒，侵染二色补血草，筛选基因Lb2G12567沉默株系。
用于扩增二色补血草基因Lb2G12567片段的引物对如下(SEQ ID NO:5-6)：
Lb2G12567-VIGS-S：5’-CCGGAATTCATGATGGACCCAATGGATATAG-3’
Lb2G12567-VIGS-A：5’-CGGGGTACCAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG-3’。
第七方面，本发明提供一种使二色补血草盐腺细胞数目增加、促进盐腺发育、提高泌盐能力的方法，所述方法如下：
①使植物表达二色补血草基因Lb2G12567编码的蛋白；或
②在植物中过表达二色补血草基因Lb2G12567。
所述过表达的方式可选自以下a)～e)，或任选的组合：
a)通过导入具有所述基因的质粒；
b)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
c)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
d)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
e)通过导入增强子。
第八方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因植物的以下任一应用：i.用于植物育种；ii.用于盐碱地种植。
所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
本发明利用VIGS基因沉默技术，构建pTRV2-Lb2G12567沉默载体，注射六叶龄二色补血草后进行表达量鉴定和表型观察，与对照组对比发现Lb2G12567基因沉默后盐腺数量明显减少，叶圆盘分泌实验发现Lb2G12567基因沉默株系的泌盐能力明显下降，经由DAB和NBT染色验证其抗逆程度显著下降。上述实验结果表明互作基因Lb2G12567与盐腺发育的形态建成表现为与盐腺数量有关，正向调控盐腺发育，且在二色补血草内与基因调控通路配合特异性发挥功能。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中PCR(A)及测序(B)结果。
图2为本发明较佳实施例中启动子克隆结果。其中，(A)双酶切回收结果，M：DL5000DNAMarker，左第一泳道：pCAMBIA3301，其他泳道：Hind III/Nco I双酶切产物；(B)Lb2G12567基因启动子克隆电泳图，M：DNA Marker 2000；(C)pCAMBIA3301-pLb2G12567-GUS大肠杆菌菌落PCR跑胶图，M：DNAMarker5000；(D)启动子测序对比结果。
图3为本发明较佳实施例中Lb2G12567蛋白的亲疏水性分析(A)、二级结构分析(B)、跨膜结构域分析(C)、信号肽分析(D)以及亚细胞定位预测(E)。
图4为本发明较佳实施例中Lb2G12567蛋白的NCBI Blast结果(A)、三级结构模式图(B)以及保守结构域预测结果(C)。
图5为本发明较佳实施例中pCAMBIA1300-Lb2G12567载体构建结果(A)以及测序结果碱基序列对比(B)。A为大肠杆菌菌落PCR，DNAMarker:DL2,000。
图6为本发明较佳实施例中Lb2G12567基因的亚细胞定位分析。35S::GFP为1300空载体，蓝色荧光DAPI染色表示细胞核位置(左:Bar＝25μm，右:Bar＝25μm)。
图7为本发明较佳实施例中Lb2G12567VIGS片段与各自参考序列的比对。
图8为本发明较佳实施例中pTRV2载体图谱。
图9为本发明较佳实施例中VIGS沉默株系和对照株系中基因的相对表达量。
图10为本发明较佳实施例中LbSAD2和Lb2G12567沉默株系叶圆盘泌盐检测。其中，(A)对照组TRV::0和实验组TRV::LbSAD2和Lb2G12567叶圆盘泌盐情况；(B)对照组TRV::0和实验组TRV::LbSAD2和Lb2G12567叶圆盘的24小时分泌量；(C)对照组TRV::0和实验组TRV::LbSAD2和Lb2G12567的单个盐腺每小时泌盐量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的引物信息如下：
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Lb2G12567-S | ATGTCGACAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| Lb2G12567-A | GGATGATGGACCCAATGGATATAGTTG |
| Lb2G12567-P-S | TATGACCATGATTAC |
| Lb2G12567-P-A | TATCTGTGATGAGACCAG |
| Lb2G12567-1300-S | GCCCTTGCTCACCATGTCGACAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| Lb2G12567-1300-A | GGATCCTCTAGAGTCGACATGATGGACCCAATGGATATAGTT |
| Lb2G12567-VIGS-S | CCGGAATTCATGATGGACCCAATGGATATAG |
| Lb2G12567-VIGS-A | CGGGGTACCAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| RT-Lb2G12567-S | CCGGAATTCATGATGGACCCAATGGATATAG |
| RT-Lb2G12567-A | CGGGGTACCAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| LbTubuli-S | GGTTGAGTGAGCAGTTCAC |
| LbTubuli-A | GATAACCAGCCACACCTTAGC |
实施例1 Lb2G12567基因及其启动子的克隆及功能分析
1.LbSAD2互作蛋白基因Lb2G12567的筛选与验证
由于LbSAD2无自激活活性，因此将LbSAD2基因全长(SEQ ID NO:4)插入BD载体进行核酵母筛库，获得候选互作蛋白后，基于互作蛋白的保守结构域和盐腺发育时期高表达特征，进一步获得目的基因，并对候选基因进行克隆。经由酵母双杂交一对一验证和双分子荧光互补实验确认互作关系后，获得LbSAD2的互作蛋白Lb2G12567，暗示了LbSAD2通过与Lb2G12567互作共同调控盐腺发育。
2.Lb2G12567基因的全长克隆
根据LbSAD2核酵母双杂筛库的结果，在阳性克隆中根据预测的蛋白结构、功能以及表达位置等问题，选择Lb2G12567基因进行进一步的研究，首先是对其互作关系的进一步验证。参照二色补血草三代测序组中Lb2G12567基因全长序列信息(SEQ ID NO:1)，我们设计了基因扩增引物如表1所示，利用二色补血草cDNA作为模板进行基因的克隆。
表1扩增基因Lb2G12567的引物
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Lb2G12567-S | ATGTCGACAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| Lb2G12567-A | GGATGATGGACCCAATGGATATAGTTG |
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择大小正确且条带清晰明亮的条带进行回收。将回收到的基因片段产物与转录组数据对比，结果完全匹配(图1，A和B)。
3.启动子元件分析及克隆
(1)通过Plant Care对Lb2G12567基因的启动子序列进行顺式作用元件分析。
(2)利用二色补血草总DNA对Lb2G12567启动子进行克隆。用于克隆Lb2G12567基因启动子的引物见表2。
表2克隆Lb2G12567基因启动子使用的引物
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Lb2G12567-P-S | TATGACCATGATTAC |
| Lb2G12567-P-A | TATCTGTGATGAGACCAG |
将跑胶的启动子条带进行测序，测序对比结果如图2所示，启动子测序结果重合度高可用于后续实验。
4.Lb2G12567基因的生物信息学分析
在确定Lb2G12567基因全长后，获得其编码的核苷酸序列，可对基因进行生物信息学分析：通过二色补血草三代转录组数据结果以及利用PCR技术对Lb2G12567进行克隆，得到549bp的开放阅读框，编码182个氨基酸。通过各类生物信息学分析工具分析，发现Lb2G12567基因所编码的蛋白质相对分子量是19749.11，等电点(PI)为4.53，蛋白质分子式为：C1621H2695N549O674S106，原子总数5645个，其中带负电的氨基酸(Asp+Glu)31个，带正电的氨基酸(Arg+Lys)17个，脂肪酸指数(Aliphatic index)为65.99。Lb2G12567蛋白的亲水区域占比多，整体呈亲水性(图3A)。二级结构各类元件占比分别为α-螺旋(Hh)36.26％，无规则卷曲(Cc)54.40％，延伸链(Ee)9.34％(图3B)。Lb2G12567蛋白前端可能跨膜(图3C)，并且该序列无信号肽，不属于分泌性蛋白(图3D)。通过亚细胞定位预测基因定位在细胞核中表达(图3E)。
通过NCBI Blast分析，与结果中的35个来自其它物种的蛋白质进行比对，通过MEGA6软件绘制系统进化树，分析发现，二色补血草Lb2G12567与甜菜(Beta vulgarissubspecies vulgaris)的spastin具有相对较高的同源性，其次是藜麦(Chemopodiumquinoa)(图4A)。Lb2G12567蛋白的三级结构分析如图4所示(图4B)。蛋白的保守结构域仅具有低复杂度结构域(图4C)。
5.亚细胞定位
(1)pCAMBIA1300-Lb2G12567载体的构建
将Lb2G12567基因与pCAMBIA1300-35S-sGFP线性化表达载体连接，凝胶电泳图以及测序图如图5所示，连接后的载体经测序后，序列结果确证正确，重组质粒构建完成。
具体步骤如下：
1)Lb2G12567片段的克隆及回收
选择pCAMBIA1300-35S-sGFP表达载体上的限制酶切位点Sal I，并设计扩增Lb2G12567基因的同源重组引物，引物如表3所示。进行PCR扩增并对扩增片段进行胶回收。
表3过表载体构建引物
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Lb2G12567-1300-S | GCCCTTGCTCACCATGTCGACAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
| Lb2G12567-1300-A | GGATCCTCTAGAGTCGACATGATGGACCCAATGGATATAGTT |
2)pCAMBIA1300载体的线性化
通过Sal I内切酶对pCAMBIA1300-35S-sGFP空载体进行酶切获得线性化载体，用于后续的实验操作，PCR体系配置与反应程序如下：
PCR配置体系：
PCR反应程序：37℃1h；4℃∞。
反应完成后进行跑胶及胶回收。
3)Lb2G12567基因片段与载体连接
PCR配置体系根据ClonExpressⅡ说明书配置体系，最适克隆载体使用量0.03pmol，最是插入片段使用量为0.06pmol，插入片段与载体的摩尔比为2:1，本次实验配比为：
PCR反应程序：37℃30min；4℃∞。
反应完成后用胶回收试剂盒进行胶回收。
4)Lb2G12567重组质粒转化大肠杆菌
连接产物转化入DH5α感受态细胞，按照DH5αChemically Competent Cell11802ES80(Yeasen,Shanghai,China)说明书进行转化。
挑单菌落进行PCR实验验证，体系如下：
PCR反应程序：
测序确认正确后摇菌，使用质粒提取试剂盒提取质粒。
5)Lb2G12567重组质粒转化农杆菌
按照GV3101 Chemically Competent Cell说明书将重组质粒转入农杆菌，并对菌种进行保存。
(a)无菌环境下挑取测序正确的菌落，通过加入Kan(50μg/mL)和Rif(50μg/mL)的YEB液体培养基进行培养，于28℃摇床，180r/min培养16-18h；
(b)在EP管中加入80％甘油300μl与待保存菌液700μl震荡混合，液氮速冻1-2min；
(c)速冻后的菌种于-80℃冰箱保存。
(2)亚细胞定位
通过含有pCAMBIA1300-Lb2G12567载体的GV3101农杆菌侵染洋葱鳞片叶内表皮细胞，通过观察GFP的发光位置来确认Lb2G12567的定位情况，具体方法如下：
1)通过75％乙醇处理洋葱鳞片叶内表皮，选择幼嫩且平整透明的内表皮浸泡10-15min，在超净工作台内通过灭菌的ddH2O冲洗3-4次，在1/2MS培养基上平整铺展开，暗培养18-24h。
2)通过50mL MS或1/2MS液体培养基重悬转入pCAMBIA1300-Lb2G12567载体的农杆菌离心液以及pCAMBIA1300-35S-sGFP空载体的GV3101农杆菌离心液，并加入乙酰丁香酮即AS(使其终浓度达到200μM)，菌液重悬液的OD600在0.8-1.2。
3)将暗培养结束的洋葱鳞片叶内表皮用镊子取出放于2)的培养基中，侵染30min，期间不时进行摇晃均匀，后将洋葱鳞片叶内表皮平整得铺到1/2MS培养基上，组培室正常光照培养1-2天。
4)取出培养结束的洋葱鳞片叶内表皮制成临时装片，在双分子荧光显微镜下观察，并使用核染色剂DAPI染色5min来明确细胞核的位置，GFP显示基因表达位置。
Lb2G12567洋葱亚细胞定位结果：通过显微镜观察报告基因GFP的位置即Lb2G12567的表达位置，通过双光子共聚焦显微镜对洋葱鳞片叶表皮内表皮装片进行观察，根据绿色荧光蛋白报告基因显示结果，观察到Lb2G12567基因在细胞核中表达，与预测的结果一致(图6)。
实施例2 Lb2G12567基因功能研究
1.pTRV2-Lb2G12567 VIGS沉默载体的构建
(1)VIGS沉默片段的克隆及酶切
为Lb2G12567基因设计基因重组引物，并参考pTRV2载体中多克隆位点处的酶切位点，通过EcoR I和Xho I进行双酶切后使用T4连接酶进行连接，设计的引物需参考T4链接酶功能及说明在两端添加酶切位点以及保护碱基。片段扩增引物设计如表4所示(SEQ ID NO:5-6)：
表4 Lb2G12567VIGS片段克隆引物
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| Lb2G12567-VIGS-S | CCGGAATTCATGATGGACCCAATGGATATAG |
| Lb2G12567-VIGS-A | CGGGGTACCAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG |
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
以Lb2G12567的全长CDS作为模板，克隆出Lb2G12567的549bp碱基片段，获得片段的测序结果与参考序列比对无误(图7)。
(2)TRV-RNA2载体的酶切
TRV是指RNA烟草脆裂病毒，同时包含正义链和反义链。一般将外源片段插入TRV2中发挥沉默基因功能，pTRV2载体图谱如图8所示。
使用EcoR I和Xho I两种酶对载体进行双酶切。同时也对克隆片段进行双酶切。体系如下：
(3)片段与载体的回收：按照胶回收试剂盒说明操作。
(4)Lb2G12567基因与片段载体的连接
将胶回收的酶切质粒和基因片段通过T4连接酶连接，线性载体和基因片段的物质的量比值在5到3之间，具体使用量通过NEBio Calculator在线计算获得。按照NEB T4连接酶说明书操作。
(5)重组质粒转化大肠杆菌
连接产物转化入DH5α感受态细胞，按照DH5αChemically Competent Cell11802ES80(Yeasen,Shanghai,China)说明书进行转化。
挑单菌落进行PCR实验验证，体系如下：
PCR反应程序如下：
测序确认正确后摇菌，使用质粒提取试剂盒提取质粒。
(6)重组质粒转化农杆菌及保存
按照GV3101 Chemically Competent Cell说明书将重组质粒转入农杆菌，并对菌种进行保存。方法同实施例1。
2.VIGS基因沉默实验
(1)VIGS侵染液的制备
a.将pTRV1农杆菌和(携带有Lb2G12567片段)pTRV2农杆菌分别通过YEB液体培养基(含有卡那霉素50μg/mL以及利福平50μg/mL)进行摇菌。
b.摇好的菌液各吸出少许复摇，至OD600值为1.2时进行下一步实验。
c.使用50mL离心管将菌液离心富集，3000rpm离心10min，离心后弃上清。
d.用配制好的MMA重悬液重悬农杆菌，于4℃静置4小时。
(2)VIGS侵染二色补血草
a.pTRV1重悬菌液和连有Lb2G12567片段的pTRV2重悬菌液(实验组)以及pTRV1重悬菌液和pTRV2重悬菌液(对照组)以1:1比例混合进行后续实验。
b.二色补血草培养至六叶期，遮光3小时后，使用注射器进行叶片注射，处理10株成苗，操作方法类似于注射烟草叶片的操作。
c.注射叶片结束后暗培养2天左右，掀膜，然后继续培养。
(3)沉默株系表达量验证
对继续培养两周后的二色补血草成苗的叶片进行取材，按照Quick RNAIsolation Kit(Huayueyang,Beijing,China)试剂盒的说明进行提取总RNA并进行反转录获得cDNA。
利用获得的实验苗cDNA进行实时荧光定量PCR实验，Real-Time PCR使用的引物如表5所示：
表5 Real-Time PCR引物
| 名称 | 正向引物序列(5’-3’) | 反向引物序列(5’-3’) |
| RT-Lb2G12567 | TCCTCAATGTAATCTCCAA | TCTTGTATCATCCGAATCA |
| LbTubuli | GGTTGAGTGAGCAGTTCAC | GATAACCAGCCACACCTTAGC |
配置反应体系如下，使用相对定量法分析数据。
反应条件如下：
(4)叶圆盘法收集分泌液
a.在同一叶位避开叶脉处通过10mm打孔器取材获得二色补血草叶片材料，用去离子水彻底洗净，并吸干水分。
b.配制200mM的NaCl溶液分装于培养皿中，将叶圆盘轻轻放入，下表面接触盐溶液，上表面滴加矿物油铺满叶片。
c.组培室培养24小时后，小心收集分泌出的小液泡于离心管中。
(5)DAB和NBT染色
NBT(氯化硝基四氮唑蓝)可与超氧阴离子自由基(·O2-)反应生成不溶于水的蓝色甲DAB(二氨基联苯胺)可与过氧化氢反应生成金黄色沉淀，二者都可指示植物组织内活性氧含量。因此我们选择用NBT和DAB染色液来处理植物组织，通过着色的深浅来判断植物组织受到的活性氧胁迫程度。染色方法如下：
NBT染色步骤：
1)将0.05gNBT粉末溶于100mL的10mMPBS中，充分溶解后调pH至7.6。
2)避光浸泡二色补血草的叶圆盘3小时。
3)通过80％乙醇叶片煮沸脱色用于后续观察。
DAB染色步骤：
1)将0.1g DAB粉末溶于100mL的ddH2O中，充分溶解后调pH至5.8。
2)避光浸泡二色补血草的叶圆盘8小时。
3)通过80％乙醇叶片煮沸脱色用于后续观察。
(6)叶片临时装片的制备
1)制备卡诺固定液(无水乙醇:乙酸(V/V)＝3:1)，脱色液(70％无水乙醇)以及透明液(乳酸饱和水合氯醛，震荡溶解15分钟)。
2)将二色补血草的叶圆盘放入卡诺固定液固定约3～4小时。
3)通过脱色液进行脱色，脱色直至叶片由绿色至白色近乎透明。
4)将叶圆盘制成透明装片，将充分脱色后的叶圆盘放置于载坡片上，先滴加1～2滴透明液，浸没材料，再滴加1～2滴透明液，轻轻盖上盖玻片，待装片凝固用于下一步的观察。
VIGS沉默株系的鉴定及表型观察：为验证Lb2G12567基因的基因沉默的效果，采取基因沉默叶片提取RNA并反转获得cDNA进行实时荧光定量PCR验证基因的表达量来检测VIGS的沉默效率。与对照组相比，Lb2G12567基因沉默株系中的Lb2G12567基因表达量显著降低(图9)。
为探讨Lb2G12567的基因沉默是否会影响盐腺的发育和泌盐能力，同时为了将Lb2G12567和LbSAD2的功能做对比，我们将二者基因沉默的叶片同时处理和观察，并将结果图组合展示。将叶圆盘放到200mM的NaCl溶液观察泌盐情况，发现基因沉默后的二色补血草株系叶圆盘的盐分分泌泡与对照相比较均明显变小且减少(图10A)，用移液器收集各叶圆盘的泌出液，离心后去除上层甘油，测量分泌液的体积进行数量化统计发现结果与观察到是现象一致(图10B)，将分泌液稀释100倍后通过火焰分光光度计测量它的Na+浓度(图10C)，并计算出单个叶圆盘的的泌盐量，发现其变化不明显。
实验结果表明，LbSAD2和Lb2G12567基因的表达量下降会使得盐腺泌盐能力下降，随之会导致沉默株系的耐逆能力的下降。
随后，将盐处理后的两种二色补血草基因沉默的叶圆盘进行了DAB和NBT的染色实验来比较它们的活性氧伤害程度。染色结果发现盐处理后，两种基因沉默后叶片受到的活性氧(ROS)伤害均增加，明显高于对照组，因此LbSAD2和Lb2G12567基因的表达量下降后使得二色补血草清除活性氧的能力有所下降。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.二色补血草基因Lb2G12567，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.二色补血草基因Lb2G12567启动子，其特征在于，其为：
i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
3.含有权利要求1所述基因Lb2G12567或权利要求2所述启动子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.权利要求1所述基因Lb2G12567、权利要求2所述启动子或权利要求3所述生物材料在制备转基因植物中的应用。
5.权利要求1所述基因Lb2G12567或含有该基因的生物材料的以下任一应用：
(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；
(2)用于调控泌盐盐生植物的泌盐能力；
(3)用于调控泌盐盐生植物的抗逆性；
(4)用于植物品种改良；
其中，(1)～(3)中所述的调控为正调控；
优选地，所述植物为二色补血草。
6.使二色补血草盐腺细胞数目减少、盐腺发育异常、泌盐能力下降、抗逆性下降的方法，其特征在于，利用基因工程手段，弱化二色补血草基因Lb2G12567，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因Lb2G12567的表达；所述二色补血草基因Lb2G12567同权利要求1中所述。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用VIGS技术沉默二色补血草的基因Lb2G12567。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，构建插入二色补血草基因Lb2G12567片段的重组病毒，侵染二色补血草，筛选基因Lb2G12567沉默株系；
用于扩增二色补血草基因Lb2G12567片段的引物对如下：
Lb2G12567-VIGS-S：5’-CCGGAATTCATGATGGACCCAATGGATATAG-3’
Lb2G12567-VIGS-A：5’-CGGGGTACCAGTCTCCGGAGTCGGGTTGG-3’。
9.使二色补血草盐腺细胞数目增加、促进盐腺发育、提高泌盐能力的方法，其特征在于，所述方法如下：
①使植物表达二色补血草基因Lb2G12567编码的蛋白；
②在植物中过表达二色补血草基因Lb2G12567；
其中，所述二色补血草基因Lb2G12567同权利要求1中所述；
所述过表达的方式选自以下a)～e)，或任选的组合：
a)通过导入具有所述基因的质粒；
b)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
c)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
d)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
e)通过导入增强子。
10.按照权利要求9所述方法获得的转基因植物的以下任一应用：
i.用于植物育种；
ii.用于盐碱地种植。
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