CN117362405A - 一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋白及其应用 - Google Patents

一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋白及其应用，属于功能基因技术领域。一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明将所述基因PbNPR3转入到植物中，基因PbNPR3过量表达，所转基因植物与野生愈伤组织相比对炭疽病较为敏感；而将该基因沉默，所得转基因植物与野生株相比能有效增强转基因植株的抗炭疽病能力。因此，本发明提供的水杨酸通路基因PbNPR3为培育抗炭疽病植物新品种以及提高植物对炭疽菌耐受性具有重要意义。

Description

一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋 白及其应用
技术领域
本发明属于功能基因技术领域，具体涉及一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋白及其应用。
背景技术
梨在全球范围内广泛种植，在中国更是仅次于苹果和柑橘的第三大水果，种植面积非常广泛，形成了从东北到广西，云南到山东都有种植的“三区四点”产区布局模式。虽然梨种植面积广大且大部分梨园布局规划都比较合理，但是由于不同地区的环境因素差异、各种自然灾害的影响以及人类长期不合理的开发利用，这对农业生产、粮食安全及各种果蔬和观景植物的种植构成巨大威胁，也使梨产业的发展面临盐碱，干旱，冻害，洪涝的影响。胁迫环境是限制植物生长的主要因素之一，胁迫分为非炭疽病以及炭疽病。在炭疽病中，真菌感染是一种危害性极大的胁迫，真菌菌丝可以侵染进植物根、茎、叶以及果实中，造成巨大的经济损失。对于梨树作物，胶胞杆菌引起的梨树炭疽病是最广泛的真菌病害之一，在中国长江流域，每年夏季高温多雨的时候都会爆发炭疽病害，对梨树产量造成巨大危害。因此，急需通过育种手段获得耐旱抗病的梨树品种。杜梨作为梨产业中应用较普遍的一种砧木，其抗病性极高，是研究木本植物抗病性和克隆有关抗病基因的理想材料。因此，克隆杜梨抗病相关基因是抗病基因工程的关键和基础。
植物不能主动躲避不良环境的胁迫，因此植物进化出了一系列体内反应机制以应对各种不良环境的胁迫。植物有一套基因调控网络，在受到外界胁迫信号时，可以迅速诱导体内胁迫相关基因的表达，从而应对各种胁迫环境。水杨酸(SA)是一种酚类激素，作为植物应对生物胁迫及非生物胁迫反应的重要信号分子，能诱导植物对这些胁迫产生抗性反应。水杨酸的生物合成主要通过两条途径，包括Isochorismate synthase(ICS)途径和phenylalanine ammonia lyase(PAL)途径，对拟南芥SA缺陷突变体的分析表明，病原菌诱导SA主要通过ICS途径产生。NPR1蛋白作为水杨酸信号传递途径的一个关键蛋白，NPR1蛋白的表达水平对植物的抗病性非常重要，它可以协同转录调控因子促进PR基因等抗病基因的表达。NPR1是SA信号的受体，过表达NPR1蛋白的基因可以显著提高作物的抗病性。
炭疽病是一类由炭疽菌侵染植物果实、叶片、花穗、枝干引致受侵染组织局部坏死的一类病害。其危害范围较广，对果树、蔬菜等农作物以及林木和花卉等由具有侵染致病性。炭疽菌的分生孢子可通过雨水、风、昆虫等传播，一年可频繁多次，并且炭疽菌可以在植物的叶片生长期、花期和果实期等不同生长阶段进行侵染，直接影响植物的生长和产量。因此，炭疽病的防治是农业种植中较为关注的问题。遗憾的是目前还未有关于如何调节基因表达通过水杨酸合成来实现炭疽病的防治。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水杨酸通路基因PbNPR3，该基因使植物对炭疽病较为敏感性，而敲除该基因后，使植物对炭疽病具有良好的抗性。
本发明提供了一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种扩增所述水杨酸通路基因PbNPR3的引物，包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IN NO:4所示的反向引物。
本发明提供了一种重组载体，包括所述水杨酸通路基因PbNPR3。
优选的，所述重组载体的骨架载体包括表达载体和病毒沉默载体。
本发明提供了一种重组菌，包括所述水杨酸通路基因PbNPR3或所述重组表达载体。
本发明提供了所述水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白、所述水杨酸通路基因PbNPR3、所述重组表达载体或所述重组菌在调节植物抗炭疽病中的应用。
本发明提供了一种敲除或下调所述水杨酸通路基因PbNPR3表达的试剂在植物抗炭疽病或培育抗炭疽病的植物品种中的应用。
优选的，所述试剂包括含PbNPR3基因序列的病毒沉默载体。
本发明提供了一种检测所述水杨酸通路基因PbNPR3表达水平的试剂在评估植物对炭疽病及其致病菌敏感性中的应用。
本发明提供了一种对炭疽病表现敏感的水杨酸通路基因PbNPR3。本发明将所述水杨酸通路基因PbNPR3转入到梨愈伤组织中，所得的超表达转基因植物就表现出炭疽菌敏感性状，基因PbNPR3可作为炭疽菌敏感性的标志物，预警植物的真菌感染。本发明提供的敲除掉PbNPR3基因或使PbNPR3基因表达量降低，使植物表现出抗炭疽病感染性状。试验结果表明：PbNPR3的转录水平在植物受到炭疽病菌处理后逐渐降低，表明水杨酸通路基因PbNPR3在植物抗炭疽病能力中起到重要作用。本发明将水杨酸通路基因PbNPR3转入到梨愈伤组织中，得到的转基因植物中水杨酸通路基因PbNPR3过量表达，所得的转基因愈伤组织与野生愈伤组织相比能够有效减弱转基因植株的抗炭疽病能力，细胞损伤更大；同时将其进行基因沉默，所得的转基因植物与野生株相比能够有效增强转基因植株的抗炭疽病能力，细胞损伤更小。可见，本发明提供的水杨酸通路基因PbNPR3对培育耐炭疽病新品种，以及植物对炭疽菌耐受性的研究具有重要意义。
附图说明
图1为一种本发明的技术流程示意图；
图2为PbNPR3在炭疽病处理下的表达模式；
图3为PbNPR3编码基因亚细胞定位，其中A为GFP基因在GFP场、明场、融合场下的成像；B为PbNPR3-GFP编码基因在GFP场、明场、DAPI场、融合场下的成像；
图4为超表达PbNPR3愈伤组织的鉴定结果；
图5为PbNPR3沉默植株的鉴定结果；
图6为超表达PbNPR3愈伤组织炭疽病处理的表型和生理测定结果；
图7为PbNPR3沉默植株炭疽病处理的表型和生理测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1(MAHSAEPSSSLSFTSSPHLSNGSISHNLSCSGSESVPSLEVISLSKLSSSLE QLLIDPGCDYSDADIVVEGIPVGVHRCILASRSGFFRELFKRDKGSSGKEDRPKYCMSDFLPYGDVGYEAFLVFLSYVYTGKLKPSPVEVSTCVHNVCAHDACRPAINFVVELMYAASIFQMPDLVSIFERRLLNFVGKALSDNVIPILVVAFHCQLNQLIDQCIDRVARSDIDDISLEKGLPDEVVKKIKILRRNYQQDSDPNLPPADPLLEKRIRRIHKALDSDDVELVKLLLTESNITLDEANALHYAAAYCDPKVVTEVLALGLADVNLRNARGYTVLHIAVMRKEPSIIVLLLTKGARASELTSDGQSAVSICRRLTRPKDYHSKTEQGQEANKDRICIDVLEREMRRNPMAGDASISSQIMPDDLHMELLNLENRVALARLFFPAEAKLAMVIAHAETSEFAAPSSSKGSSGNLMEVDLNETPTVQNKRLHSRLEALMKTVRLGRCYFPHCSEVLDKFIADDLPDLFYLEPGSSDEQKVKRRRFMELKEEVQKAFDKDKAECNLSGLSSSSSTTSPEKIGANQKVREP*)所示。
本发明提供了一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3，核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ATGGCCCATTCAGCTGAACCATCATCCTCTCTGAGCTTTACTTCATCG CCCCATTTATCAAATGGTTCAATAAGCCACAACTTATCGTGTTCTGGCTCCGAATCGGTGCCAAGTCTTGAAGTCATCAGTTTGTCCAAGCTTAGCTCTAGTTTGGAGCAGTTGTTGATTGATCCTGGCTGTGATTATAGTGATGCTGATATCGTAGTTGAGGGGATTCCTGTTGGTGTACACCGATGTATATTGGCTTCTAGGAGTGGATTTTTTCGCGAACTATTCAAGCGAGACAAGGGGTCTTCTGGAAAGGAGGACAGGCCAAAGTACTGTATGAGTGATTTTCTGCCTTATGGCGATGTTGGATATGAAGCCTTCTTGGTTTTCTTAAGCTATGTGTATACGGGAAAGCTTAAGCCTTCTCCCGTGGAGGTGTCAACCTGCGTTCACAATGTATGTGCCCATGACGCATGTAGACCTGCTATCAATTTCGTTGTGGAATTGATGTACGCCGCTTCCATTTTCCAAATGCCTGATTTGGTTTCGATATTCGAGCGGCGCCTTCTTAATTTTGTTGGGAAAGCTCTGTCAGACAATGTTATCCCAATTCTCGTGGTTGCTTTCCATTGTCAGTTGAATCAGCTCATCGATCAGTGTATAGATAGAGTGGCACGATCAGATATTGATGACATCTCT CTTGAGAAGGGACTTCCTGATGAGGTTGTGAAGAAAATCAAAATTCTTCGCCGCAATTATCAGCAGGATTCTGACCCAAACTTGCCACCTGCCGATCCCTTGCTTGAAAAGAGAATCCGAAGAATACATAAGGCTTTGGACTCGGATGATGTCGAGCTTGTGAAACTTCTTTTAACGGAGTCTAATATAACCTTGGATGAAGCAAATGCTCTCCATTATGCTGCAGCTTACTGCGATCCTAAGGTTGTGACCGAAGTGCTTGCTCTGGGCCTCGCTGATGTTAACCTCCGGAATGCTAGGGGTTATACAGTGCTTCACATTGCTGTGATGCGCAAAGAGCCATCAATTATTGTATTGCTACTGACTAAAGGAGCTCGTGCATCGGAGCTGACATCAGATGGTCAGAGTGCTGTTAGTATTTGCAGGAGGTTGACGAGACCAAAGGATTACCATTCAAAAACAGAGCAGGGGCAAGAAGCAAACAAAGACCGAATATGCATTGATGTTCTAGAGAGGGAAATGCGGCGGAATCCAATGGCTGGAGATGCATCTATATCTTCCCAAATAATGCCTGATGATCTGCACATGGAGTTGCTGAACCTGGAGAACAGAGTGGCATTGGCCCGATTGTTTTTCCCTGCAGAAGCCAAGCTAGCCATGGTCATTGCCCATGCGGAGACATCTGAGTTTGCTGCGCCATCATCATCGAAAGGCTCAAGTGGGAATCTGATGGAGGTTGATTTAAACGAGACCCCCACCGTGCAGAACAAAAGACTTCATTCCAGGTTGGAAGCCCTTATGAAAACAGTCCGTTTGGGTAGATGCTATTTCCCTCATTGCTCGGAAGTCCTGGATAAGTTCATTGCGGACGACCTCCCTGATTTGTTTTACCTCGAGCCTGGCTCCTCCGACGAGCAGAAGGTAAAGAGGAGGCGTTTCATGGAGCTCAAGGAGGAAGTACAAAAAGCATTTGACAAGGACAAGGCCGAGTGTAACCTCTCCGGATTGTCTTCATCATCCTCCACGACATCTCCGGAAAAAATTGGTGCAAATCAGAAGGTTAGGGAACCGTGA)所示。
本发明从杜梨中筛选到一种对炭疽病表现敏感的水杨酸通路基因PbNPR3。本发明提供的抗生物逆境水杨酸通路基因PbNPR3在植物炭疽病胁迫中起负调控作用，在多种生物逆境对抗中具有重要作用。
本发明提供了一种扩增所述水杨酸通路基因PbNPR3的引物，包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3(ATGGCCCATTCAGCTGAACC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IN NO:4(CGGTTCCCTAACCTTCTGATTTG)所示的反向引物。
本发明对所述引物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物委托上海生工生物工程有限公司合成。
本发明提供了一种重组载体，包括所述水杨酸通路基因PbNPR3。
在本发明中，所述重组载体的骨架载体包括表达质粒(p1300)和病毒沉默载体(pTRV2)。重组载体p1300-PbNPR3中PbNPR3基因插入的多克隆位点为Xbal I和BamH I两个酶切位点。重组载体pTRV2-PbNPR3中PbNPR3基因序列插入的多克隆位点为Xbal I和Sma I两个酶切位点。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组载体的构建方法即可。
本发明提供了一种重组菌，包括所述水杨酸通路基因PbNPR3或所述重组表达载体。
在本发明中，所述重组菌的宿主优选包括农杆菌。本发明对所述重组菌的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组菌的制备方法即可。
本发明提供了所述水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白、所述水杨酸通路基因PbNPR3、所述重组表达载体或所述重组菌在调节植物抗炭疽病中的应用。
在本发明中，所述植物优选为双子叶植物。所述植物优选包括愈伤组织和杜梨。本发明以杜梨为植物代表说明该基因PbNPR3在调节植物抗炭疽病性能中的应用。实验证明，当植物中基因PbNPR3高表达时，该植物对炭疽病的敏感性较高，易发生炭疽病。当植物中基因PbNPR3下调表达或敲除后，该植物抗炭疽病的性能提高，不易发生炭疽病。同时实验证明，将所述的杜梨中水杨酸通路基因PbNPR3或所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中重组表达，得到的重组植物具有易感炭疽病的特性。将所述的杜梨中水杨酸通路基因PbNPR3或所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中沉默，得到的植物抗炭疽病能力增强。因此，以基因PbNPR3为靶点，通过调节其表达量能够实现植物对炭疽病的敏感性和抗病性调节。
基于上述基因PbNPR3表达水平与植物对炭疽病的敏感性及抗病性的关系，本发明提供了一种检测所述水杨酸通路基因PbNPR3表达水平的试剂在评估植物对炭疽病及其致病菌敏感性中的应用。
本发明提供了一种敲除或下调所述水杨酸通路基因PbNPR3表达的试剂在植物抗炭疽病或培育抗炭疽病的植物品种中的应用。
在本发明中，所述试剂优选包括含PbNPR3基因序列的病毒沉默载体(pTRV2-PbNPR3)。
在本发明实施例中，通过生理指标测定，结果发现：超表达了PbNPR3的梨愈伤组织相比于对照更易受到炭疽病的侵染，而沉默了PbNPR3的杜梨叶片相比于对照更加抵抗炭疽病侵染。这表明基因PbNPR3的敲除或下调表达有利于提高植物的抗炭疽病的性能，同时构建敲除或敲低基因PbNPR3的转基因植物从而培育得到一种抗炭疽病的新品种。
下面结合实施例对本发明提供的一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3、蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
杜梨水杨酸通路基因PbNPR3基因全长cDNA的克隆
从杜梨中筛选到一个水杨酸通路基因PbNPR3，根据水杨酸通路基因PbNPR3基因的序列和primerpremier 5.0设计引物，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：cDNA第一链的合成参照TIANGEN反转录试剂盒的操作说明进行。所得的第一链cDNA用于水杨酸通路基因PbNPR3基因的扩增。PCR反应总体积50μl，其中杜梨cDNA1μl，上下游引物(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)各2.5μl，taq酶1μl，Buffer 25μl，ddH2O18μl。PCR按以下程序完成：1、94℃预变性3min；2、94℃变性30s，3、58℃退火30s，4、72℃延伸55s，步骤2-4重复35个循环；5、循环完成后72℃延伸10min，6、最后4℃保存30min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，按胶回收试剂盒使用说明步骤回收特异目的条带。
回收纯化的产物与pEASY-BluntZero载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是5μl，其中4.5μl的PCR纯化的产物，0.5μl载体，25℃连接30min，采用热激法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。
实施例2
生物逆境条件处理下水杨酸通路基因PbNPR3的qRT-PCR分析
为了分析杜梨中PbNPR3基因对炭疽病处理的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbNPR3基因的表达模式进行分析。采用成都福际生物技术有限公司Plant TotalRNAIsolation KitPlus提取RNA，DNA第一链的合成参照TANGEN反转录试剂盒的操作手册进行。在10μl的反应体系中有：5μl 2×SYBR Premix ExTaq，0.1μl cDNA，0.4μl引物(PbNPR3的qRT-PCR引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；以Tubulin为内参引物，Tubulin正向引物：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID NO：7)；Tubulin反向引物：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID NO：8))，4.5μl水。实时定量PCR的程序如表1所示：
表1实时定量PCR程序
结果见图2。杜梨的实生苗在炭疽病孢子悬浮液处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析所述编码基因的相对表达量。由图2可以看出，PbNPR3对炭疽病有非常强烈的响应，且表达量呈下调趋势。
实施例3
PbNPR3的编码蛋白的亚细胞定位
根据PbNPR3的编码基因的核苷酸序列和pJIT166-GFP载体图，在基因序列前后分别加入Xba I和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)扩增，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。用Xba I和BamH I限制性内切酶对pJIT166-GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4小时后纯化回收。酶切过后的pJIT166-GFP载体与凝胶回收PbNPR3片段经重组连接酶连接，37℃连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为GFP-PbNPR3。
农杆菌介导烟草细胞瞬时转化：重组的GFP-PbNPR3载体质粒转化至含农杆菌感受态GV3101中，将活化的含重组质粒的农杆菌在含50mg/mL卡娜和50mg/mL利福平的LB液体培养基，250rpm、28℃恒温摇床中扩繁。6000rpm离心10min，并用侵染液(100mL：10mL 100mMMgCl2，10mL 100mM MES，75μL 200mMAS，ddH2O 80mL)重悬至OD600为0.8。室温孵育3～4h后侵染烟草叶片细胞。将侵染后的烟草避光培养24h，然后用DAPI染色，用于标记细胞核，并制片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)拍照。
结果见图3。图3是所述PbNPR3的编码基因亚细胞定位，根据细胞定位图能够得到PbNPR3定位在细胞核。
实施例4
愈伤的遗传转化
1.植物转化载体构建
根据PCMBIA1300载体的多克隆位点和PbNPR3基因的编码区序列，加入酶切位点XbaI和BamHI，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计出上、下游PCR引物(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)。以PbNPR3基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序与PbNPR3基因克隆相同。在扩增过后进行胶纯化回收胡美君。PCMBIA1300载体双酶切反应体积为40μl，其中：有PCMBIA1300的载体质粒10μl，10×M缓冲液4μl，XbaI及BamHI各1μl，加双蒸水24μl。放置于37℃酶切3～4h后纯化回收。在连接反应体系中加入PbNPR3基因与载体PCMBIA1300的摩尔比为2:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，DNA重组酶1μl，双酶切回收的PbNPR3基因4ul，双酶切回收的PCMBIA1300载体产物2μl，双蒸水2μl，在37℃反应30min得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养16h。将筛选出的阳性克隆挑点后摇菌，抽提质粒进行PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为p1300-PbNPR3重组载体，应用冻融法将重组载体p1300-PbNPR3导入到农杆菌GV3101中。
2.农杆菌介导的愈伤遗传转化步骤如下：
(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB的平板上划线，置于28℃培养箱培养36～48小时，刮取划线菌斑，加入液体MS(2.37g/LMS+50g/L蔗糖+0.1mg/L IBA，pH＝5.8)培养基中，28℃转30min振荡培养，菌液浓度达到OD为0.8～1.0时加入表面活性剂sweet77200μl/L作浸染。
(2)浸染：取状态良好野生型愈伤组织，去除全部种荚，然后浸泡于根癌农杆菌菌液中1h，避光培养24h。
3.转基因阳性苗的的筛选
按照上述方法得到转PbNPR3基因愈伤组织转移到含50mg/L潮霉素和50mg/L特美汀的MS选择培养基上，置于22℃避光培养，生长一个月后挑选生长快的愈伤组织，移栽到新的培养基继代培养。
3.1转基因愈伤DNA提取
按照上述方法得到转PbNPR3基因愈伤，把愈伤提取DNA，设计引物基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性愈伤。
(1)取适量愈伤用液氮研磨至粉末状，然后加入500μl 65℃预热的CTAB(100mmol/LTris-HClpH8.0，1.5mmol/LNaCl，50mmol/L EDTA pH＝8.0，2％w/v CTAB，65℃水浴充分溶解备用)和10μlβ-巯基乙醇，混匀。
(2)在65℃水浴锅中加热30min，每隔10min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g常温离心10min；取上清，加500μl氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀；
(3)10000g离心10min，取上清液450μl至新的1.5ml离心管，加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀。
(4)10000g，离心10min，弃去上清，用1mL 75％的乙醇漂洗2次，10000g，离心10min，将乙醇彻底去除，放在超净工作台通风干燥，直至DNA呈无色透明状
(5)加入50μl超纯水，放置于65℃培养箱中溶解40min，做胶检测。
3.2阳性转基因愈伤检测
采用引物基因特异引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表2、表3。采用基因上游引物和载体下游引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)进行PCR，在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系。
表2PCR反应程序
表3PCR反应体系
反应组分 用量(μl)
模板DNA 1
PCR Buffer 2
dNTD Mix(2.5mmol/L) 1.6
右侧正向引物 1
左侧反向引物 1
Taq DNA聚合酶(5U) 0.2
无核酶水 13.2
如图4，转基因株系中都可以跑出目的条带，而WT中没有，表明所获得的愈伤是转基因阳性愈伤。
实施例5
杜梨幼苗的瞬时转化
1.病毒诱导基因沉默载体构建
按照实施例4的方法构建病毒沉默载体。病毒沉默载体pTRV2双酶切位点为XbaI和SmaI，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计上、下游引物(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)将PbNPR3基因扩增并插入至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2-PbNPR3，并转入农杆菌GV3101感受态中。
2.病毒诱导杜梨幼苗基因沉默
(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB液体培养基中28℃，220rpm振荡培养12h。将培养后的菌液6000g离心10min收集菌体，用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH 5.6)重悬沉淀，至浓度达到OD600为0.8～1.0；
(2)菌液诱导：将调好OD值的菌液放在黑暗条件下，100rpm常温诱导4h；
(3)梨苗注射：pTRV1和pTRV2菌液按照1:1比例混合作为对照组，pTRV1和pTRV2-PbNPR3菌液按照1:1比例混合作为实验组，分别注射苗龄45天，生长状况一致且健康状况良好的杜梨实生苗幼苗。
3.病毒诱导基因沉默抑制阳性苗鉴定
将注射完成后的梨苗在常温下黑暗处理12h，然后恢复正常培养5天，每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过跑胶检测其结构完整，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用梨的Tubulin作为内参进行qPCR扩增，具体方法同实施例2记载。
如图5，用Tubulin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PbNPR3特异引物进行qRT-PCR检测，分析待检测株系的表达量，根据PbNPR3基因的表达量，选择表达量较低的三个植株作为病毒沉默阳性株系。
结果见图5所示，利用基因特异引物和内参引物Tubulin进行qRT-PCR检测基因沉默阳性植株的基因表达量。图5说明了病毒沉默杜梨幼苗阳性株系的PbNPR3基因被沉默。
实施例6
PbNPR3转基因植株抗性鉴定
为了鉴定PbNPR3转基因愈伤是否和抗炭疽病胁迫有关，将对照系和转基因系进行炭疽病逆境处理。结果表明，超表达PbNPR3的梨愈伤组织相比野生型愈伤对炭疽病更加敏感，表现在菌丝体在超表达PbNPR3的梨愈伤组织上的生长速度显著快于野生型，过氧化氢酶CAT、几丁质酶CHI、苯丙氨酸解氨酶PAL、多酚氧化酶PPO都是可以衡量植物抗病原菌能力的生理指标，在受到炭疽病侵染后，PbNPR3超表达愈伤的CAT、CHI、PAL、PPO活性均显著低于对照，而在侵染之前均无差异，因此，超表达了PbNPR3的梨愈伤组织相比于对照更易受到炭疽病的侵染(图6)。
实施例7
PbNPR3病毒沉默植株抗性鉴定
为了研究PbNPR3在应对炭疽病的功能，我们将PbNPR3沉默植株以及对照的植株用无菌针穿刺处理，随后喷施炭疽病的孢子悬浮液，叶片置于25℃黑暗培养4天，结果显示，PbNPR3沉默植株叶片的病斑直径相比于对照显著更小、叶片的气孔开度更小。在受到炭疽病侵染后，PbNPR3沉默植株叶片内的CAT、CHI、PAL和PPO含量均显著高于对照。综上所述，通过VIGS沉默PbNPR3的杜梨相比于对照更能抵抗炭疽病的侵染。
对以上结果的分析表明，PbNPR3基因与植物抗炭疽病密切相关，过表达的PbNPR3基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，维持细胞内离子平衡和渗透势稳态，从而提高植株的抗炭疽病能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种影响植物对炭疽病敏感性的水杨酸通路基因PbNPR3，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种扩增权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ INNO:4所示的反向引物。
4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3。
5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括表达载体和病毒沉默载体。
6.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3或权利要求4或5所述重组表达载体。
7.权利要求1所述水杨酸通路基因PbNPR3编码的蛋白、权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3、权利要求4或5所述重组表达载体或权利要求6所述重组菌在调节植物抗炭疽病性能中的应用。
8.一种敲除或下调权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3表达的试剂在植物抗炭疽病或培育抗炭疽病的植物品种中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述试剂包括含PbNPR3基因序列的病毒沉默载体。
10.一种检测权利要求2所述水杨酸通路基因PbNPR3表达水平的试剂在评估植物对炭疽病及其致病菌敏感性中的应用。
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