CN1476477A - 在根和苗端表达外源基因的启动子 - Google Patents

在根和苗端表达外源基因的启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN1476477A
CN1476477A CNA028031873A CN02803187A CN1476477A CN 1476477 A CN1476477 A CN 1476477A CN A028031873 A CNA028031873 A CN A028031873A CN 02803187 A CN02803187 A CN 02803187A CN 1476477 A CN1476477 A CN 1476477A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
plant
promotor
seq
root
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028031873A
Other languages
English (en)
Inventor
�ʺ�һ
肥后健一
岩本政雄
肥后广美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An
Original Assignee
Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An filed Critical Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An
Publication of CN1476477A publication Critical patent/CN1476477A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8226—Stem-specific, e.g. including tubers, beets
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种在根和茎端的至少一个位置特异性诱导表达的启动子。利用该启动子，有可能在根中合成抗线虫或抗土壤病原体的抗性物质；在根中合成促进根发育的物质；产生基因重组植物，其中再分化植物体的选择性标记限定在幼株植物的根部表达，而在植物成熟时抑制该表达；等。而且，茎端的表达能力可用于开发在增殖活动旺盛的细胞中抑制基因表达的技术。

Description

在根和苗端表达外源基因的启动子
发明领域
本发明涉及能使导入植物的外源基因在根和/或茎端表达的启动子。更具体地，本发明涉及在根和/或茎端表达外源基因的方法，是利用水稻过氧化氢酶基因B(下面用CatB表示)的部分启动子区进行的。
背景技术
根作为支持物起到防止植物倒下的作用，更重要的是，根可以吸收水分和养料。根的分支延伸扩展了其表面积以致增加了吸收的面积。根还具有分泌有机酸，使有机酸与磷、铁等结合，从而促进它们的吸收。根还有合成和分泌如润滑剂等物质的功能，这有助于根尖在土壤中的生长。根还可合成和储藏植物激素。而且，根蓄积通过光合作用获得的能量，或者在幼苗期蓄积磷并在日后移送。不能象动物一样移动的植物，尤其是根，遭受来自周围环境的很多压力，它们采取许多措施以抵抗这些压力。
根的这些功能，例如在水稻中，与下面的基因有关：环叶绿素(cyclophyllin)(Cyp)基因(Buchholz etal.，plant Mol.Biol.25：837-843(1994))，脂转移蛋白(LTP)基因(Vignols etal.，Gene 16：265-270(1994))，苯丙氨酸氨基裂合酶(PAL-ZB8)基因(Zhu et al.，Plant Mol.Biol.29：535-550(1995))，组蛋白H3基因(Terada et al.Plant Mol.Biol.27：17-26(1995))，碱性几丁质酶(RC24)基因(Xu et al.，Plant Mol.Biol.30：387-401(1996))，caleosin基因(Naested et al.，Plant Mol.Biol.44：463-476(2000))等，它们已知能在根中表达。
在除了水稻以外的一些植物中，拟南芥属的延伸因子eFF1A基因(Tremousaygue et al.，Plant J 20：553-561(1999))，黑芥子酶基因Pyk10(Nitz etal.，Plant Science 161：337-346(2001))，铁转运者(IRT2)基因(Vert et al.，Plant J26：181-189(2001))等；烟草的谷光甘肽S转移酶(GST)基因(Klinedinst et al.，Plant Mol Biol 42：679-688(2000))，硝酸盐还原酶(Hansch et al.，J Exp Bot52：1251-1258(2001))等；或亚麻的果胶甲酯酶(Roger et al.，Plant Science160：713-721(2001))等，已知它们能在根中表达。
苗端指的是营养生长期的茎端和其周围的部分。在高等植物中，茎端能进行细胞分化以产生新的细胞。茎端中表达的基因的实例包括烟草(Nicotiana tabacum)的脂质转移蛋白(Itp1)基因(Canevascini et al.，PlantPhysiol.，112：513-524(1996))，同源框(NTH15)基因(Tamaoki et al.，Plant CellPhysiol.，38：917-927(1997))，和赤霉素3β羟化酶基因(Itoh et al.，Plant J.，20：15-24(1999))；拟南芥属二氢吡咯-5-羧酸酯还原酶基因(Hua et al.，PlantPhysiol.，114：1215-1224(1997))，ERECTA基因(Yokoyama et al.，PlantJ.，15：301-310(1998))，ATML1基因(Sessions et al.，Plant J.，20：259-263(1998))，和FAD3基因(Matsuda et al.，Planta，213：833-840(2001))。这些研究证实以上基因表达的组织特异性受其启动子调控。
近来，将能在根中表达的启动子与能对根的发育，抗病性和胁迫抗性有作用的基因联系起来，以及将基因导入植物的方法，作为有前景的生物技术受到人们的注意。
有人尝试利用病毒基因的启动子在植物中表达外源基因(例如，MacFarlane and Poppvich，Virology 267：29-35(2000)；和Mazithulela et al.，Plant Science 155：21-29(2000))。然而，病毒感染后会造成传播。衍生于植物基因的启动子比衍生于病毒基因的启动子更能将基因的表达位置限制在细胞水平。
在玉米等中已经发现一些已知在根中表达的基因的启动子。重组DNA技术可在根中赋予抗病性。题为“控制植物中线虫的基因和方法”的美国专利6,284,948公开了赋予根抗线虫性的实例。此处，利用植物遍在蛋白基因启动子使线虫抗性基因得以表达。然而，该遍在蛋白启动子的器官特异性水平低并且被恒定地表达。
根特异性启动子的一个实例在美国专利6,271,437中公开，该专利名称为“大豆基因启动子”。它描述了一种方法，其中用大豆包囊线虫基因的启动子在根中表达外源基因。根特异性启动子实例参见美国专利申请2001/0016954，其名称为“根特异性启动子”。这些实例包括衍生于拟南芥的b1-微管蛋白基因启动子，核糖体蛋白RPL16A基因启动子，ARSK1基因启动子，和大豆金属硫蛋白(metallothionein)样的基因的启动子。据记载这些启动子可用于赋予线虫抗性。
这些启动子有下面的问题：启动子的活性通常不足以用于实际应用；启动子在单子叶植物包括谷类诸如水稻等中不起作用；它们的器官特异性较低；等等。
因此，如果分离出能在谷类的各种发育阶段发挥作用的启动子，揭示出这些启动子的特征，制备出具有不同组织特异性和高活性的启动子盒，所述的启动子盒将对作物诸如水稻等的育种非常有用。
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供在根和/或茎端中具有高水平活性的的植物启动子。更具体的是，本发明的目的是提供实用启动子，其克服了常规启动子的活性问题(即活性通常不足以用于实际应用；在单子叶植物例如水稻等中并未显示所述的活性，活性的器官特异性低；等等)。
发明内容
(解决问题的手段)
基于水稻过氧化氢酶B(CatB)基因启动子区的部分碱基序列能用于在根中表达外源基因这一发现得出本发明。
本发明提供：
1.一种启动子，包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
2.1项中所述的启动子，其中所述启动子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
3.1项中所述的启动子，其中所述启动子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
4.用于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的组合物，该组合物包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
5.项4中的组合物，其中所述启动子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
6.项4中的组合物，其中所述启动子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
7.项4中的组合物，其中所述的植物是单子叶植物或双子叶植物。
8.项4中的组合物，其中所述的植物是单子叶植物。
9.项4中的组合物，其中所述的植物是水稻，拟南芥属，玉米，小麦，大麦，番茄，黄瓜，茄子，马铃薯，莴苣(lettuce)，日本小萝卜(Japanese radish)，胡萝卜。
10.项4中的组合物，其中目的基因编码选自下组的至少一种多肽：可赋予抗性的多肽，促进根发育的多肽，和用于再分化植物体的选择标记。
11.项4中的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括根尖部分。
12.项4中的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括单子叶植物幼苗的分生组织区域。
13.项4中的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括茎端部分。
14.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物表达盒，该植物表达盒包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
15.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的质粒，该质粒包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因，
其中启动子与目的基因可操纵地连接。
16.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物细胞，该植物细胞包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
17.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物组织，该植物细胞包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
18.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的转基因植物，该转基因植物包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
19.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物种子，该植物种子包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
20.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法，该方法包括：
1)提供植物，该植物包含编码启动子的核酸，该启动子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供植物，该植物包含编码目的基因的核酸，和
3)将植物置于允许启动子进行操作的条件下。
21.由在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法得到的基因产物，该方法包括：
1)提供植物，该植物包含编码启动子的核酸，该启动子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供植物，该植物包含编码目的基因的核酸，和
3)将植物置于允许启动子作用的条件下。
22.产生适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物的方法，该方法包括：
1)提供一种包含启动子的质粒，该启动子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)用所述质粒转化植物细胞；并且
3)培养转化的植物细胞。
14-22项由5-13项的特征具体说明。
附图简述
图1显示的是实验中所用的各种DNA构建体。
图2显示制备B1(＝CatBD1-GUS/pTN2)和B2(＝CatBD2-GUS/pTN2)的方法。
图3为导有B1的水稻幼株(T0代，再分化第一代)的GUS染色照片。
图4为导有B1的拟南芥属幼株(T2代)的GUS染色照片((a)黑色背景；(b)亮背景)。
图5为Cat启动子区。
发明详述
除非特别指出，本发明书中单数形式的冠词(例如，英文的“a”，“an”，“the”等；德文的“ein”，“der”，“das”，“die”等；法文的“un”，“une”，“le”，“1a”等；及其它语言中的冠词，形容词等)应理解为包括复数形式的概念。还应理解的是本文所用术语具有本领域通常理解的定义，除非特别说明。
(序列描述)
SEQ ID No.1为CatB启动子区(1364bp)的核酸序列(-1066到+298，以cDNA起台点为+1；见图5)。
SEQ ID No.2为CatB基因(4985bp)核酸序列。
SEQ ID No.3为BΔ3片段(866bp)。
SEQ ID No.4为B1片段(627bp)。在位点1到6，CatB过氧化氢酶基因的碱基序列中AAAAAA变为AAGCTT，这是HindIII的切割位点。在460位，T由C取代，由此破坏了CatB过氧化氢酶基因的翻译起始密码子。
SEQ ID No.5为B2片段(524bp)。在位点1到6，CatB过氧化氢酶基因的碱基序列中AAAAAA变为AAGCTT，这是HindIII的切割位点。在位点357，T由C取代，由此破坏了CatB过氧化氢酶基因的翻译起始密码子。
SEQ ID No.6为相应于CatB cDNA的102-131的序列。
SEQ ID No.7为相应于CatB cDNA的484-455的序列。
SEQ ID No.8为本文一实施方案中所用的引物3D3-F1。
SEQ ID No.9为本文一实施方案中所用的引物3D3-F2。
SEQ ID No.10为本文一实施方案中所用的引物BD3-MR。
SEO ID No.11为-329到+298的启动子区。
SEQ ID No.12为-329到-227的启动子区。
(术语定义)
本文所用“启动子”指的是与RNA聚合酶结合以起始转录的遗传元件或因子。本文所用“启动子区”指的是在某结构基因序列的邻近区具有启动子活性的区域。启动子区是指正常基因上游的特定碱基序列，该序列在该基因转录开始时与RNA聚合酶结合。本文“启动子活性”指的是，通过特定因子作用于RNA聚合酶等而起始转录的活性。
本文的“植物”包括任何单子叶植物和双子叶植物。优选植物的实例包括属于稻科的单子叶植物，诸如小麦，玉米，水稻，大麦，高梁等，优选植物的其它实例包括烟草，甜辣椒(pimento)，茄子，瓜，番茄，甘薯，卷心菜，洋葱，花椰菜，胡萝卜，黄瓜，柑橘属果树，中国卷心菜(Chinesecabbage)，莴苣，桃，马铃薯，和苹果。优选的植物并不限于作物，还包括花，树，草，杂草等。除非特别说明，否则植物指的是完整植物，植物器官，植物组织，植物细胞和种子。植物器官的实例包括根，叶，茎，花等。植物细胞的实例包括愈伤组织和悬浮培养的细胞。
本文的“根和茎端的至少一个位置”指由根和茎端组成的一组位置中选出的至少一个位置。因此，“根和茎端的至少一个位置”包括根的一部分和茎端的一部分。“根和茎端的至少一个位置”还包括分生组织。
本文的“分生组织”指的是植物的形成层，该层包括分化细胞和能分化成其它分裂细胞或特定类型细胞的位点。分生组织经常在生长部位观察到。分生组织的实施例包括生长点，茎端(苗端)，根端或根尖，根端分生组织，顶端分生组织等等。
本文的“根”指的是存在于地下的，起支持作用并吸收水分的器官。尖部称为根冠，其内部由表皮包绕并称为中柱。中柱内通行导管和筛管。根毛为表皮细胞伸出的部分，位置略靠根尖后方。根毛内的或周围的表皮细胞强有力的吸水。根毛的寿命从数天到数周不等，期间根不断延伸，使根毛的位置不断向前。整个根还称为根系统。例如，在水稻种子根中，从单个胚芽鞘的各个节或其以上的部位长出约5-20个不定根。自节点生长的根称为冠根(crown root)。大量的根生长自上节点。第一和第二分支根生长自上节点。根的长度最大可约有1m。根包含分生组织。
本文的“茎端”还指苗端，以及茎及其周围位置的根端分生组织。茎端包括形成茎和侧叶的营养茎端，和形成花序和花的生殖茎端。茎端包含分生组织。茎端指的是营养期的茎端和其周围部分。高等植物的茎端能分裂成新的细胞。
本文的“过氧化氢酶”指的是能催化分解过氧化物的反应的酶(EC1.11.1.6)。在有H2O2，CH3OOH，C2H5OOH存在时，过氧化氢酶可以氧化C2H5OH，CH3OH，CH3COOH，HCOOH， HNO2，等等。过氧化氢酶存在于任何需氧细胞中，无论它们是动物，植物或微生物来源。在动物中，肝脏，肾和红细胞包含大量的过氧化氢酶。牛肝过氧化氢酶分子量约为230000。一个该酶分子包含4个血红素功能基团。在植物中，过氧化氢酶包括本发明人分离的过氧化氢酶B。
本文中核酸分子的“片段”指的是长度短于参考DNA的全长，但却足以用作探针或引物的多核苷酸。一种DNA片段如果要作为其来源核酸分子的选择性探针或选择性引物，必需具有特异性杂交能力。本文中“与...特异性杂交的DNA”是给定核酸分子能通过其DNA片段而被单独检测出或被扩增。选择性探针代表性的长度为至少10个核苷酸，优选至少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，甚至更优选30，40或50个核苷酸，进一步可以有大于50个核苷酸的长度。利用选择性引物进行PCR扩增可得到选择性探针。当用选择性引物作为PCR引物对中的至少一个引物时，该选择性引物的代表性长度为9个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选15个核苷酸，甚至更优选至少17，18，19，20，21，22，23，24，25，30或50个核苷酸，或超过50个核苷酸。
本文所用核酸分子的“同系物”指的是具有与参考DNA核苷酸序列同源的核苷酸序列的核酸分子。代表性的是，同系物指的是在严谨条件下与参考核酸分子杂交的多核苷酸。在本发明启动子的情况中，启动子的“同系物”指的是具有与该启动子同源的核酸序列，并且具有相同或相似的特征(例如，位点特异性，时期特异性，对胁迫的反应等)的核酸分子。
本文中基因“同源性”指的是在两个或更多个基因序列间同一性的幅度。因此，两基因间同源性越高，其序列间同一性越大。两基因间是否具有同源性可通过直接比较它们的序列或通过在严谨条件下杂交的方法来确定。在两基因序列直接互相比较时，如果基因序列代表性地互相具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，则这些基因具有同源性。
本文同源性的幅度利用序列分析工具BLAST以默认参数确定。
因此，如果核酸分子含有本发明启动子序列中至少10个连续核苷酸的序列，则该核酸分子与本发明启动子序列具有相同或相似的活性。这种活性可利用β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，萤光素酶基因，或GFP基因作为报道基因而分析确定，或通过生物学或细胞组织学检测来证实。这样的分析是本领域常用的已知技术。(Maliga et al，Methods in Plant Molecular Biology：Alaboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；Jefferson，PlantMolec.Biol.Reporter 5：387(1987)；Ow et al.，Science 234：856(1986)；Sheen etal.，Plant J.8：777-784(1995))。因此，本领域的技术人员能毫无困难的证实：含有本发明启动子序列中至少10个连续核苷酸的序列的核酸分子与本发明启动子序列具有相同或相似的活性，或有实质上高于或等同于本发明启动子序列的活性。本文中，当启动子活性在检测误差范围内通过上述分析得到证实时，称该启动子活性具有实质上高于或等同于本发明启动子的活性。
本发明启动子的长度通常为至少10个核苷酸，可以优选至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，至少90个核苷酸，至少100个核苷酸，至少150个核苷酸，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸。
可以使用与常规启动子(例如，最小启动子(衍生自35S的包含有约80个碱基对的启动子)(Hatton et al.Plant J.，7：859-876(1995)；Rouster et al.，PlantJ.，15：435-440(1998)；Washida et al.，Plant Mol.Biol.，40：1-12(1999)；等)相连的本发明的启动子。这种情况中，如果最初没有或具有弱的组织特异性的启动子，或具有另一类特异性的启动子，与本发明的启动子或其片段相连，则所得的启动子可在根和/或茎端有组织特异性的功能(Hatton et al.Plant J.，7：859-876(1995)；Rouster et al.，Plant J.，15：435-440(1998)；Washida et al.，PlantMol.Biol.，40：1-12(1999)。
本发明的启动子可用于修饰单子叶植物和双子叶植物以及其它生物体。这是由于这两种植物具有相似的转录调控机制。例如，据报道玉米醇溶蛋白基因启动子以相同的组织特异性在烟草中表达(Schernthaner et al.，EMBO J.，&：1249-1255(1988))；水稻谷蛋白基因启动子以相同的组织特异性在烟草中表达(Leisy et al.，Plant Mol.Biol.，14：41-50(1989))。尤其优选的受试植物除水稻外包括小麦，玉米，大麦，高粱，柑桔，中国卷心菜，莴苣，烟草，桃，马铃薯，番茄和苹果。
本文在论述基因时，“载体”指的是能将靶多核苷酸序列导入靶细胞的载体。这样的载体含有能在原核细胞，酵母，动物细胞，植物细胞，昆虫细胞，动物个体中自我复制或被并入其染色体，并位于适合本发明多核苷酸转录的位点的启动子。植物细胞的“重组载体”包括Ti质粒，烟草花叶病毒载体，等等。
载体导入方法的实例包括将DNA导入植物的的任何方法。例如，转染，转导，以及利用以下物质进行的转化：土壤杆菌(日本专利申请59-140885，日本专利申请60-70080，和WO94/00977)，电穿孔的方法(日本专利申请60-251887)，粒子枪(基因枪)的方法(日本专利2606856和日本专利2517813)等。
对本发明启动子表达的“检测或鉴定”通过下面所述合适的方法进行，例如，mRNA测量和免疫测定的方法。分子生物学测量方法，包括，例如，northern印迹方法，斑点印迹的方法，PCR的方法等。免疫学的方法包括例如，ELISA的方法，RIA的方法，荧光抗体的方法，western印迹的方法，免疫组织学染色的方法，等使用微量滴定板的方法。鉴定方法包括ELISA方法，RIA方法等。
“表达水平”指的是在靶细胞等中表达的本发明蛋白质或mRNA的水平。这种表达水平包括：通过任何合适的方法(包括利用本发明的抗体进行的免疫测定方法，例如ELISA的方法，RIA的方法，荧光抗体的方法，western印迹的方法，免疫组织学染色的方法等)评估的本发明多肽的蛋白质水平；通过包括生物学测量方法(包括northern印迹方法，斑点印迹的方法，PCR的方法等)的任何合适的方法评估的本发明多肽的mRNA的水平。“表达水平的改变”指的是由本发明肽的蛋白质或mRNA水平所确定的表达水平的升高或降低，所述肽的蛋白质或mRNA的水平可通过包括上述的免疫学或生物学测量方法的任何合适的方法评估。通过观察表达水平的绝对值或相对值，就有可能确定特定启动子是否特异性地作用。
“转化体”指的是通过转化产生的整个生物或其部分，例如细胞等。转化体的实例包括原核细胞，酵母，动物细胞，植物细胞，昆虫细胞等。转化体也称转化细胞，转化组织，转化宿主等，这取决于所转化的物质。
本文所表达的“基因”具有本领域通常的含义，指能确定遗传特征的因子。由本发明的方法表达的目的基因是期望通过本发明的方法而能够特异表达的任何基因，包括能赋予抗线虫抗性的，抗土壤病原体抗性等的多肽，能促进根发育的多肽，再分化植物体的选择性标记等。
本文中的“再分化”指的是自实体(entity)的一部分重建整个实体的现象。例如，从组织诸如细胞，叶，根等形成植物体。
使转化体再分化为植物体的方法在本领域是熟知的。这种方法在下面文献中进行了说明，Rogers et al.，Methods in Enzymology 118：627-640(1986)；Tabata et al.，Plant Cell Physiol.，28：73-82(1987)；Shaw，Plant MolecularBiology：A practical approach.IRL press(1988)；Shimamoto et al.，Nature 338：274(1989)；Maliga et al.，Methods in Plant Molecular Biology：A laboratoorycourse.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)等。因此，本领域的技术人员可基于目的转基因植物来利用上述熟知的方法实施再分化。
再分化转化体中经修饰的目标特性的存在通过基于该特性的类型实施相应试验而证实。例如，GUS基因作为报道基因与启动子融合，然后将其导入植物体以产生转化体。通过组织学染色检测GUS活性来证实转化。在这种情况中，GFP基因或萤光素酶基因(其是荧光蛋白质的编码基因)可用作报道基因。任何这些基因可用于各种启动子的分析中。在下面的实施例中对这些基因进行了详述。在欲于赋予病原菌抗性(胁迫抗性)时，模式菌(例如，丁香假单胞菌烟草致病菌种)被接种到再分化植物体。在该情况中，再分化植物体特性的变化可通过将其与对照植物比较而观察有无变化来评估。
可通过本领域任何已知的方法培养植物。下面举例说明培养植物的方法，例如“Moderu-shokubutsu-no-Jikken-Purotokoru For Ine·Shiroinunazuna：Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu4；Ine-nosaibaiho[Experimental Protocol for Model plants For Rice and Arabidopsis thaliana：Celluar Engineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 4；RiceCultivating Methods]”(Kazutoshi Okuno)pp.28-32，and“Arabidopushisu-no-saibaiho[Cultivating Methods for Arabidopsis]”(YasuoTanba)pp.33-40(Supervised by Koshimamoto and Kiyotaka Okada)，它们在本文并没有详细描述。例如，拟南芥可通过利用土壤培养，岩棉(rock wool)培养，或水培养进行培养。播种后，如果是在白色荧光灯(约6000lux)的恒定光照下培养植物，大约四周就可先观察到开花。开花后约16天种子才能完全成熟。一荚(pod)中可得40-50个种子。自播种到死亡的2-3个月期间，约可获得10000粒种子。种子的休眠期短。完全成熟的种子干燥约一周，吸水后2-3天便萌芽。注意的是，如果种子在吸水并播种后于4℃低温处理2-4天，则会很快萌芽。
(优选的实施方案)
本发明一方面涉及包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的启动子。所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。优选的是，启动子包含SEQ ID NO.11所示序列的至少10个连续的核苷酸。
更优选的是，本发明提供一种核酸分子，其包含SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续的核苷酸。启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。该核酸分子具有在根(包括分生组织)中特异性启动表达的启动子活性。就本发明人所知，这种能赋予启动子活性的序列先前并未具体在水稻和拟南芥属中发现，因此，本发明可以说在本领域获得了有益的效果。
上述具体序列范围仅表明本发明的一个优选的序列范围。本发明并不限于此。因此，根据本发明所描述的方法，本发明可指定为由本领域技术人员所筛选的另一合适区域。通过参考本领域通常用的已知技术，无需经过大量实验就可实施这类筛选方法。
另一方面，本发明提供用于在植物的根和茎端的至少一个位置表达基因的组合物，该组合物包括：
1)启动子，它包含SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)目的基因。
如上所述，启动子1)启动特异于根和茎端的至少一个位置的表达。因此，该组合物提供能在根和茎端的至少一个位置特异性表达的系统，即在本领域中具有有益的用途。
在一实施方案中，启动子可包含SEQ ID NO.11所示序列中至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
在另一实施方案中，启动子可包含SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。在另一实施方案中，植物可以是单子叶植物或双子叶植物。生物体并不限于单子叶植物或双子叶植物。因此，本发明的启动子可衍生自除了植物以外的生物体，例如动物等，或除了单子叶植物和双子叶植物以外的其它植物，只要该启动子具备相同的效应。在另一优选的实施方案中，植物可以为单子叶植物。更优选的是，植物可以为水稻，拟南芥属植物，玉米，小麦，大麦，番茄，黄瓜，茄子，马铃薯，莴苣，日本小萝卜或胡萝卜。
在另一优选的实施方案中，本发明启动子的长度可为至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，至少40个核苷酸，至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，至少70个核苷酸，至少80个核苷酸，至少90个核苷酸，至少100个核苷酸，至少150个核苷酸，至少200个核苷酸，或至少300个核苷酸。
在另一实施方案中，本发明的启动子可以与另一启动子相连。这种情况中，通过将最初没有或具有弱的组织特异性，或具有另一种类型的特异性的启动子，与本发明的启动子或其片段相连，有可能产生一种可在根和/或茎端的至少一个位置具有组织特异性的启动子。
在另一实施方案中，目的基因可以是编码选自下述的至少一种多肽的基因：能赋予抗性，例如抗线虫抗性或抗土壤病原体抗性的多肽，能促进根发育的多肽，以及再分化植株的选择性标记。
在另一实施方案中，根和茎端的至少一个位置可包括根尖部分。在另一实施方案中，根和茎端的至少一个位置可包括茎端部分。根和茎端的至少一个位置可包括单子叶植物(例如水稻)幼苗的分生组织。通过仅在幼苗植物中启动表达，有可能产生一种作物(例如水稻)，该作物中导入的基因不表达产物或者其产物不会残留。
另一方面，本发明提供在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物表达盒，该植物表达盒包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
植物表达盒可通过本领域熟知的技术来制备。这类制备技术在本文实施例中举例说明。
另一方面，本发明提供在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的质粒，该质粒包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列的至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
所述启动子与目的基因可操纵地连接。所述质粒(或载体)可通过本领域熟知的技术来制备。这种制备技术在实施例中举例说明。
另一方面，本发明提供一种适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物细胞，该植物细胞包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
所述植物细胞可通过本领域所熟知的技术制备。例如，这种植物细胞可利用本发明的质粒通过转化，转染或转导制备。这类方法在本文实施例中具体举例说明。
另一方面，本发明提供一种适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物组织，该植物组织包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列的至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
所述的植物组织可通过例如，使本发明的植物细胞再分化来制备。或者可将本发明的组合物直接注入到植物组织来制备该植物组织。这样的技术是本领域所熟知的。
另一方面，本发明提供一种适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的转基因植物，该转基因植物包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
植物组织可通过例如，使本发明的植物细胞再分化来制备。这样的技术在本领域是熟知的，包括例如对于双子叶植物(例如，烟草，拟南芥属，等)。Rogers et al.，Methods in Enzymology 118：627-640(1986)；Tabata et al.，Plant Cell Physiol.，28：73-82(1987)；Shaw，Plant Molecular Biology：A Practicalapproach.IRL press(1988)；Maliga et al.，Methods in Plant Molecular Biology：A laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；对于水稻，Shimamoto et al.，Nature 338：274(1989)；Hiei et al.，Plant J.6：271-282(1994)；Toki，Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21(1997)；等。
另一方面，本发明提供一种适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物种子。该植物种子包括：
1)一种启动子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
这样的植物种子可通过上述再分化并同时保持其生育力而制备。这样的再分化技术在本领域是熟知的，包括如对于双子叶植物(例如，烟草，拟南芥属，等)。Rogers et al.，Methods in Enzymology 118：627-640(1986)；Tabataet al.，Plant Cell Physiol.，28：73-82(1987)；Shaw，Plant Molecular Biology：APractical approach.IRL press(1988)；Maliga et al.，Methods in Plant MolecularBiology：A laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；对于水稻，Shimamoto et al.，Nature 338：274(1989)；Hiei et al.，PlantJ.6：271-282(1994)；Toki，Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21(1997)。
另一方面，本发明提供一种在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法，该方法包括：
1)提供具有编码启动子的核酸的植物，其中该启动子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供具有编码目的基因的核酸的植物，和
3)将植物置于允许启动子进行操作的条件下。
一旦指定了本发明的启动子，上述方法可利用本领域通常所用的熟知的技术实施。所述表达方法在上文中描述。
另一方面，本发明提供经由在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法得到的基因产物，该方法包括：
1)提供具有编码启动子的核酸的植物，其中所述启动子包括如SEQ IDNO.1所示序列的至少10个连续的核苷酸，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供具有编码目的基因的核酸的植物，和
3)将植物置于允许启动子进行操作的条件下。
根和茎端的至少一个位置是活跃增生的组织。利用该方法可以得到大量的目的基因。
另一方面，本发明提供一种产生适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物的方法，该方法包括：
1)提供一种包含启动子的质粒，该启动子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续的核苷酸，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)用所述质粒转化植物细胞；并且
3)培养所转化的植物细胞。
提供质粒的方法，转化方法和培养方法在本领域是熟知的，并且已在本文中进行了描述。
本发明人已经分离并分析了水稻过氧化氢酶CatB基因(DDBJ登记号：D64013)的结构。而且，5′上游启动子区(-1066到+298：该DNA片段在本文中称为BΔ0，其中cDNA起始点为+1)与报道基因(β-葡糖醛酸酶(GUS))融合。将融合体利用电穿孔导入由水稻培养细胞系(Oc细胞)制备的原生质体中，以便利用因短暂基因表达所致的GUS酶活来指示测量启动子活性的强度。结果发现，其具有的活性比通常用于将基因导入植物的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子高约20倍。因此，这揭示了该启动子可用于产生表达有用基因的启动子盒，本发明得以完成并以此提交专利申请(日本专利2955644，题目为“水稻CatB基因启动子”)。
进一步地，通过northern杂交分析，本发明人公开CatB在水稻植株幼苗的根部表达较强，而在成熟个体中却不表达；并且在叶，茎，花中不能很强地表达(Iwamoto et al.Plant Science 151：39-46(2000))(表1)。
     表1水稻过氧化氢酶基因表达的器官特异性(主要表达位置)
    基因名称     幼苗期的水稻表达器官     花期的水稻表达器官
    CatA     叶鞘     花药
    CatB     根     (-)
    CatC     叶片     叶片
(由Iwamoto et al.，Plant Science 151：39-46(2000)发表的northern分析数据以及其后得到的数据的概括。)
基于上述的结果，本文力图鉴定CatB基因启动子区中调控器官特异性的部分(日本登记号2955644)。
具体地，使CatB基因启动子区BΔ0缺失5′-侧区域，产生多种DNA片段，将它们与报道基因(GUS)融合，然后导入载体(图1和2)。将载体导入水稻和拟南芥属进行转化。对第一代再分化植物或后代植物的各种组织进行GUS组织染色以研究表达位点。
结果显示，即使是cDNA起始点(+1)上游-329到+298的短启动子DNA片段(B1)也能使报道基因在水稻幼苗的根中表达(图3，表2和表3)，以及在拟南芥属幼苗植株的根和茎端表达(图4，表4)。
           表2水稻幼株的GUS染色(T0再分化第一代)
强染色位置 导入BΔ0的水稻 导入BΔ3的水稻 导入BΔ1的水稻 导入BΔ2的水稻
根     25     12     13     3
根，叶鞘，叶片     0     4     0     0
叶鞘，叶片     6     ND     12     9
未染色     4     0     2     4
总计     35     16     27     16
数字：个体数；ND＝未确定(未研究)
           表3花期的水稻植株的GUS染色(T0再分化第一代)
强染色位置 导入BΔ0的水稻 导入BΔ3的水稻 导入BΔ1的水稻 导入BΔ2的水稻
根     0     0     2     1
根，叶鞘，叶片     3     1     1     0
叶鞘，叶片     8     3     8     7
未染色     0     2     1     2
总计     11     6     12     10
                           表4拟南芥属幼苗植株的GUS染色(T2代)
染色位置   B1-1   B1-2   B1-3   B1-4    B1-5    B2-3   B2-4  B2-5   B2-6    B2-8
仅根
仅茎端   13   8    9
根，茎端   1   23   7   20    19   1    1
根，茎端，其它器官   7   6   1
茎端，其它器官   5   9   12    4
其它器官   7
未染色   4   2   8   6    1    24   6   10    10
总计   12   25   21   26    24    24   24   24   24    24
器官特异性表达幅度在转化植物个体间有差异，但在约一半的第一代再分化水稻植株中(具有导入的B1∷GUS构建体(图1中的B1))，报道基因在根中强表达。据认为在水稻中报道基因的类似地在茎端强表达。
由于启动子区的5′侧逐渐增大的较大区域缺失，水稻幼株根部表达的特异性降低。按照表达特异性从高到低的顺序依次为BΔ0(71％)＝BΔ3(75％)＞B1(48％)＞B2(19％)(表2)。启动子区越长，表达的特异性越强。如果目的植物是从再分化个体组成的组筛选的，则甚至有可能从B1获得特异性表达的植物体。因此，可根据目的来筛选BΔ0，BΔ3，或B1。
缺失-329到-227的区域的启动子(B2)在水稻和拟南芥属的根中具有较低的表达水平(表2和4)。因此，该-329到-227区域是根中表达所必需的。该区没有与根中表达相关的已知的顺式元件。很有可能在该区中存在新的顺式元件。
根据这一结果，开发了一种方法，它可以从水稻过氧化氢酶CatB基因的1364个碱基的启动子区(先前作为专利申请提交)获得多种最长达630个碱基的序列，用于在单子叶植物(例如水稻等)和双子叶植物(例如拟南芥属等)幼株的根和茎端表达外源基因。
通常而言，启动子碱基序列的保守性是低的。利用几百个碱基的启动子碱基序列进行筛选不容易检测出具有相似活性水平的启动子。启动子区域与转录调控因子(蛋白质)结合的位置(顺式元件)的保守性较高。因此，根据本发明的特异性序列利用计算机搜寻顺式元件数据库，可得到许多顺式元件候选物。相信可用生物信息学技术确定顺式元件候选物的真实作用。
在后文中，本发明利用实施例进行描述。下面所提供的实施例仅仅是举例说明。因此，本发明的范围不仅仅限于实施例，而是由所附的权利要求书限定。
                        实施例
( 实施例1：水稻过氧化氢酶CatB基因的分离)
分离水稻过氧化氢酶CatB基因的方法在日本专利2955644，题目为“水稻CatB基因的启动子”中描述(注册日：1999年7月)。简而言之，该方法如下。
(从基因组库中进行筛选)
用CatA cDNA的一部分克隆CatB基因。λ噬菌体的插入部分(克隆#51)通过PCR进行扩增，该部分含有非全长的cDNA(约1.8kbp全长的3′末端1.35kbp，其中总共约450bp的5′非翻译区和一些编码区缺失)，是在CatAcDNA克隆期间获得的。自相同噬菌体制备DNA并用作模板。使用λgt11-正向引物和λgt11-反向引物(Toyobo Co.，Ltd.)。产物用Centricon-100(Amicon)纯化浓度为25ng/10ul，并用作多引发(multi-prime)标记方法的探针(Amersham)。
水稻基因组DNA库(RICE Genomic Library)购自CLONTECHLaboratories Inc.(Palo Alto，CA，US)，用于筛选CatB基因，如下。噬菌体λEMBL-3含有该基因组库，根据本领域常用的方法，用其感染大肠杆菌菌株NM538，以形成噬菌斑。将噬菌斑转移到尼龙膜上以允许与上述的探针杂交。注意探针已用32P标记。
杂交溶液：6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鲑精DNA；杂交温度：65℃；杂交时间：过夜。
此后，在下面相对温和的条件下洗膜。洗涤条件：2×SSC-0.1％SDS，室温，5分钟+30分钟；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小时。
洗涤之后，将尼龙膜根据通常所用方法进行放射自显影以检测与探针杂交的克隆。从证实发生了杂交的每种噬菌体制备DNA。
用限制酶Sal I和Sca I消化上述噬菌体DNA。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分离。将分离的DNA片段转移到尼龙膜上以允许与上述作为探针的CatA cDNA片段杂交。杂交的条件与上面所述的相同。在下面所述的条件下洗膜。洗涤条件：2×SSC，室温，5-10分钟，两次；2×SSC-0.1％SDS，65℃，30分钟。
洗涤之后，将尼龙膜根据通常本领域所熟知的方法放射自显影以检测与探针杂交的DNA片段。
发现了具有基本上相同的信号强度和带型的克隆(推定它们具有相同的结构)，以及带型仅部分匹配的克隆。前一类具有基本上相同的信号强度和带型的克隆被认为对应于CatA基因。实际上，克隆74是对应于CatAcDNA的基因。另一方面，后一类具有仅部分匹配的带型的克隆可能是缺乏CatA基因的克隆或者是具有除CatA以外的其它的过氧化氢酶基因的克隆。所以，用CatA cDNA作探针在下述温和条件或严谨条件下实施杂交，对所得的模式互相比较。
温和杂交条件：50％甲酰胺，6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鲑精DNA；杂交温度：37℃；杂交时间：过夜。
洗膜的条件与上述的相同：2×SSC-0.1％SDS，室温，5分钟+30分钟；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小时。
严谨杂交条件：50％甲酰胺，6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鲑精DNA；杂交温度：42℃；杂交时间：过夜。
洗膜的条件：2×SSC-0.1％SDS，室温，5分钟+30分钟；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小时。
严谨条件下的杂交检测到与标准杂交相同数目的条带。另一方面，温和条件下的杂交显示的条带数目大于在严谨条件下杂交的数目。根据这些结果，发现具有仅部分匹配的带型的克隆很有可能是与CatA相似并具有部分不同的碱基序列的DNA，即，除了CatA以外的过氧化氢酶基因，但不是缺乏CatA基因的克隆。
约20个具有仅部分匹配的带型的克隆被认为是过氧化氢酶同功酶基因的候选基因，对它们进行进一步进行分析。在这些克隆之中，根据详述的基于CatA碱基序列的Southern分析，部分碱基序列分析，PCR分析等推断克隆7为不同于CatA的过氧化氢酶基因。还发现克隆7具有与CatB cDNA不同的序列，将其指定为CatC。CatC碱基序列在The journal of Japan Societyfor Bioscience，Biotechnology，and Agrochemistry 68,404(1994)中描述。
有一些克隆具有带型不同于CatA和克隆7(CatC)的带型中，其中对克隆6进行更详细的分析。克隆6的DNA的碱基序列也进行部分分析。该序列与CatB基因的cDNA序列匹配(Plant Physiol.(1994)105：1015-1016)。
基于上述的信息，合成两种DNA寡聚物以得到CatB基因的5′非翻译区。
GGTCGATTCTCATCTCTCCCACAACAAATC：SEQ ID No.6(对应于CatB cDNA的102-131)
CAATGTCTCAGGGCTTCCACGCTCATGCAC：SEQ ID No.7(对应于CatB cDNA的484-455)
另一方面，从愈伤组织制备水稻cDNA库。用该cDNA库的DNA作模板，用上述两种合成DNA作引物，在标准条件下实施PCR。扩增后，获得约400bp的DNA片段。用这些400bp的DNA片段作探针以再次筛选上述的被认为是CatB基因的克隆。结果获得几个可杂交的克隆。
其中，上述的克隆6在400bpPCR扩增产物上游的至少约1kbp处具有5′-上游区，并且全长至少约5kbp。该克隆命名为克隆U6。制备克隆U6的限制酶图谱(未显示)。
包含5′-上游区约1kbp的多个片段(Sal I-Eco RI消化的片段)和它们的下游片段(Eco RI-Eco RI消化的片段)从克隆U6中切下，插入到用于序列分析的载体(pUC18)中以产生逐步递增地缺失较大的5′节段和3′节段的大量质粒从而确定碱基序列。因此，CatB(4985bp)的核酸序列由SEQ ID No.2表示。
( 实施例2：构建CatBΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121)
如在题为“水稻CatB基因的启动子”的日本专利2955644中所述，构建CatBΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121。简而言之，如下进行构建。
所得CatB基因长度为4985bp。而且，发现第一外显子存在于SEQ IDNo.2的1073到1216；第二外显子存在于1333到1429；第三外显子存在于2341到2618；第四外显子存在于2970到3746；第五外显子存在于3968到4057；第六外显子存在于4252到4319；第七外显子存在于4410到4503；第八外显子存在于4616到4881；第一到第七内含子存在于相应外显子之间。基于上述的序列，推断启动子区为位于1073前的序列。该序列信息可用于切出启动子区。具有水稻CatB基因启动子的质粒CatB-GUS-Δ0如下述制备。
克隆U6用SalI和EcoRI切割以切下2.3kbp的片段。该片段与已用SalI和EcoRI切割的pUC 18连接。所得的重组质粒用Eco47I(Toyoboco.，Ltd.制备)消化。收集约2kbp的片段。该片段用DNA聚合酶的K1enow片段消化，然后用PstI消化。结果，得到具有克隆U6中7到1370位所示序列(SEQ IDNo.2)的片段A。该片段A包含有第一外显子上游的序列，第一外显子，第一内含子，和第二外显子。该片段的5′-末端为PstI位点，3′-末端为平末端。
植物细胞的表达载体pBI221(Clonetech)具有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，β-葡糖醛酸酶(GUS)编码区，胭脂氨酸合成酶终止子(NOS·T)。该pBI221用PstI和SmaI消化，收集PstI-SmaI大片段B。该大片段B从pBI221去除了CaMV 35S启动子区。将大片段B与具有克隆U6中7到1370位序列的片段A连接，以产生CatB-GUS-Δ0。
(水稻细胞的转化和GUS基因的表达)
将70ml具有下述组成的AA培养基放入300-ml烧瓶中。对水稻Oc细胞进行悬浮培养并温和搅拌(90rpm)。
AA培养基的组成(Mol.Gen.Genet.161：67-76(1978))
1)无机盐                             浓度(mg/l)
MnSO4·4-6H2O                       10
H3BO3                              3
ZnSO4·7H2O                        2
Na2MoO4·2H2O                     0.25
CuSO4·2H2O                           0.025
CoCl2·6H2O                           0.025
KI                                       0.75
CaCl2·2H2O                           150
MgSO4·7H2O                           250
NaH2PO4·H2O                         150
KCl                                      3000
2)铁成分
Fe-EDTA                                  40
3)维生素，有机成分
蔗糖                                     20000
烟酸1-硫胺素盐酸                         10
盐酸吡哆醇                               1
肌醇                                     100
L-精氨酸                                 177
L-甘氨酸                                 7.5
L-谷氨酰胺                               900
L-天冬氨酸                               300
4)激素酸
2，4-D                                   1
细胞分裂素                               0.2
GA3                                      0.1
每周将10ml所述培养物转移到70ml新鲜培养基中。转移之后，第5天的细胞用来制备原生质体。根据Mol Gen.Genet 206：408-413(1987)所描述的方法制备原生质体。将第5天传代培养的愈伤组织细胞悬浮物转移到塑料Petri培养皿中。用抽吸器除去培养基。20ml酶溶液(4％纤维素酶RS(Yakult)，1％解析酶R10(Yakult)，0.4M甘露糖醇，0.5％CaCL2·2H2O，0.5％硫酸葡聚糖钾。用石蜡膜覆封培养皿并置于28℃的暗处。约5小时后，将培养基进行尼龙网过滤以除去未消化的物质，然后接着进行多次洗涤。
将由此获得的原生质体悬浮于EP缓冲液(5mM MgCL2，70mM KCL，0.1％ MES，0.4M甘露糖醇，加入双蒸水至pH5.6；过滤除菌，Nature338：274-276(1989))中。取出部分(0.5ml)悬浮液与20μg/ml的上述质粒DNA和30μl/ml的鲑精DNA混合。然后，将混合物在一次性小杯中利用Gene-Pulser(Bio-Rad，CA)进行电穿孔(300V/cm)(电极间距为0.4cm)，其中电容500μF，电阻100Ω。原生质体在冰上静置10分钟。将1.5ml R2P培养基添加到原生质体中。混合物置于Millicell(Millipore，CA)中。将Millicell置于含有5ml R2P培养基的6cm塑料盘中(Plant Cell Physiol.14：1113-1121(1973))。在Millicell外添加抚育细胞。在暗处28℃进行培养。抚育细胞的存在对Cat A-GUS-Δ0，Cat B-GUS-Δ0和Cat C-GUS-Δ0的表达没有影响。
R2P培养基的组分
(1)主要成分(mg/ml)
KNO3                               4000
(NH4)2SO4                        335
MgSO4·7H2O                       250
Ca2Cl2·2H2O                     150
NaH2PO4·H2O                     273
(2)次要成分(mg/ml)
MnSO4·4H2O                       1.6
ZnSO4·7H2O                       2.2
CuSO4·5H2O                       0.125
H3BO3                             3.0
NaMoO4·2H2O                      0.125
Na2EDTA                            7.5
FeSO4·7H2O                       5.5
(3)有机成分(mg/ml)
肌醇                                 100
烟酸                                 1.0
盐酸吡哆醇                           1
盐酸硫胺素                           10
蔗糖(g/l)                            137
2，4-D(mg/l)                         2.0
pH5.6
用于激活GUS的原生质体如下述进行基本处理，“Rabo-manyuaru：Shokubutsu-idennshi-no-kino-kaiseki[Laboratory Manual：Analysis of PlantGene Functions]”(Masaki Iwabuti.Toshiro Shimura，Maruzen，1992，p.55)，电穿孔之后，将原生质体在暗处28℃培养4天。用1ml Falcon pipette(#7521)收集所得原生质体并置于1.5ml微量管中，接着室温9000rpm离心3分钟。所得沉淀分析前保持在-80℃。
将200μl提取缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10mM Na2EDTA，0.1％TritonX-100，0.1％十二烷基肌氨酸，10mM β-巯基乙醇)添加到冰水中冰冻的沉淀中，静置5分钟以使其解冻。通过超声装置(Branson Sonifier250型)在下述条件下处理混合物1分钟：Output control 2和Duty Cycle 10％。处理之后，将混合物在4℃15000rpm离心20分钏。收集上清(原生质体提取物)并用作测定GUS活性的样品，利用Bradford方法(Anal.Biochem 72：248-254(1976))测定样品的蛋白质浓度。
根据Jefferson等(同上)描述的方法测定GUS的活性。通过向反应液中添加20％(v/v)甲醇而消除内源GUS活性。从至少两次试验中获得结果，试验包括三次相同的试验(三份样品)。
结果显示CatB基因启动子与对照即CaMV CatA和CatC启动子(未显示)相比具有相对高水平的活性。
( 实施例3：通过PCR方法修饰起始密码子的碱基和制备CatB的5′上 游DNA片段(B1片段，B2片段)，及构建质粒)
通过PCR制备水稻过氧化氢酶基因CatB的5′-上游DNA片段(B1片段，B2片段)，该片段在起始密码子中带有点突变。以Cat BΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121为模板，用引物3D3-F1(5′GTG AAG CTT TCG ATC ACG ATGAGC GAG-3′(SEQ ID No.8)和BD3-MR(5′-GTA GGG ATC CGT GGC GTGATT TG-3′(SEQ ID No.9)，以及Pfu DNA聚合酶(Promega)进行PCR扩增，制备B1片段(-329到+298，cDNA的起始点为+1)，其中的引物3D3-F1用于将HinDIII切割位点导入DNA片段的5′-末端邻接区，引物BD3-MR用于以C取代CatB起始密码子ATG中的T。
使用引物3D3-F2(5′GTT AAG CTT GTC TTA TCT CCT CGT GAT CC-3′(SEQ ID No.10)，将Hind III切割位点导入DNA片段5′端邻接区域的引物)和BD3-MR经PCR扩增制备B2片段(-226到+298)。
将所得DNA片段用限制酶HindIII和BamHI处理，并使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将其并入已用HindIII和BamHI处理的载体Cat BΔ0-GUS/pBI121中GUS基因的上游区。将载体导入高感受态的用于转化的大肠杆菌DH5α(Toyobo co.，Ltd.)。自大肠杆菌中纯化载体，测定并证实其碱基序列。载体用限制酶HindIII和EcoRI处理以切出含有B1或B2片段的DNA片段，GUS基因和胭脂氨酸合成酶基因终止子(NOS-ter)。将该DNA片段并入已用HindIII和EcoRI处理的双元载体TN2(Fukuoka et al.，Plant CellReports 19：815-820(2000))。
( 实施例5：将基因导入植物)
用土壤杆菌属(EHA105)将pTN2导入水稻(品种：Nippponbare)，方法见Hiei等(Plant J.6：271-282(1994))和Toki(Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21(1997))。
将pTN2通过部分修饰下述方法的方法导入拟南芥属(品种：Cloumbia)：“Moderu-shokubutsu-no-Jikkeh-Purotokoru For Ine·Shiroinunazuna：Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu4；Genatsu-Shitsujyunho-niyoru-Keishitsu-tenkan[Experimental Protocol for Model plants For Rice andArabidopsis thaliana：Celluar Engineering，Special Issue，Plant CellularEngineering Series 4；Transformation by a vacuum infiltration method”(TakashiAraki)pp.109-113(Supervised by Koshimamoto and Kiyotaka Okada)”。
(实施例6：植物GUS组织染色方法)
通过部分修饰下述方法的方法观察GUS活性：“Shokubutsu-no-Saibo-wo-miru-jikken-purotokoru：Idenshihatsugen-kara-saibonaikouzou.kino-made；Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu62-3；Saibo-reberu-de-GUSkassei-wo-miru-hoho[Experimental Protocol forobserving Plant cells：From Gene Expression to Intracellular Structure.Function；Cellular Engineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 62-3；Method for Observing GUS activity at Cellular Level]，(Misa Takahashi andHiromichi Morikawa)，pp.71-79(supervised by Hiroho Fukuda，MikioNishimura，and Kenzo Nakamura)。
①制备X-Gluc溶液[100mM磷酸缓冲液(pH7.0)，1mM X-Gluc，0.3mM高铁氰化钾，0.3mM亚铁氰化钾，0.2％Triton-X100]。
②将500μl X-Gluc溶液分散于24孔滴定板的各孔中。
③将水稻和拟南芥的每一组织或切片置于孔中并在28℃处理16小时。
④除去X-Gluc溶液。加入70％乙醇以脱色。
⑤除去70％乙醇，将组织.切片浸入50％甘油溶液中。
⑥通过显微镜或立体显微镜观察组织·切片。
(结果)
不同的植物转化株之间器官特异性的程度有差异。然而，在导有B1∷GUS构建体(图1中B1)的第一代再分化水稻植株中，约有一半的植株基报道基因在根中表达强。对于转化的拟南芥属植株，报道基因在导有B1∷GUS构建体(图1中B1)的大部分拟南芥T2代中的根和茎端表达强。
工业应用
通过利用该启动子，就有可能在根中合成抗线虫或抗土壤病原体的抗性物质；在根中合成促进根发育的物质；产生基因重组植物，其中再分化植物体的选择性标记的表达限于幼株的根部，而在植物成熟时抑制表达等。而且，茎端的表达能力可用于开发在增殖活动旺盛的细胞中抑制基因表达的技术。
本发明CatB基因启动子区的部分碱基序列可用于在根和茎端的至少一个位置表达外源基因。因此，该启动子可用于开发特异于育种植物(例如水稻等)的根和茎端的至少一个位置的启动子，这是通过使用在根和茎端的至少一个位置合成的蛋白质或分泌到细胞外的物质进行基因操作而实现的。
例如，通过利用该启动子就有可能在根中合成抗线虫或抗土壤病原体的抗性物质；在根中合成促进根发育的物质；产生基因重组的植物，其中再分化植物体的选择性标记的表达限于根，以在植物成熟时抑制表达等。
                                 序列表<110>AR030<120>在根和苗端表达外源基因的启动子<130>AR030PCT<140><141><160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1364<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>1ctgcaggtca acggatctta tttttccatt ataatatata taataaataa atatatgttt 60acttttatta tagtacttta aaagataaat ctatatatgt tgttctagtt cctttaaact 120aaatattatt aaagttatta atggttaaag ttataaaagt ttgatatcaa actcgtccaa 180aatgtcgatt aatatcgaac cggagcgagt acagtattag tagcaagtca gccacatggg 240acatggccca catgcatgca cgtcgtatga acacaccgtg attctttgcc acttgcataa 300tattctagca ctgctatact acacgacgac tgacggcgac gtcagttcag tttagtttgc 360cgcatccatc gcgaaggcta ctctacccat cccatttttt tttaaaaaaa aatactataa 420atctaaatat cttacattag atttgtatat tttaaagcaa agagaataat atgtagatat 480aagtatgtac ctactcgctc gagcacaaga tcactgcaac aagcattgaa gatcgctcct 540agcaatggtc tcaacttacc atgtaaacta agagcaacta taatgttttt cttttattag 600gaatggttgc atcttatatt ttgagattga gaaaacacat atagaaatta tacaggattt 660agcatttggg atgccggccg gattcctgat ttcccagtct ctggctttct ttttaaacaa 720aaacgaaaaa agcagtgatc cgatcgatca cgatgagcga gctagtaagc tccaaaacaa 780aatagagtac gtacgtataa tcctagagtc cggataataa taatccgttt ggttcgcgtt 840aaaaaagtct tatctcctcg tgatcccttt ttttggatcg atccatgttc gtagtacgtg 900acaagcacgc gcaccaaccg aagcaggtac ctgtgtcgct gcctgtgggc cccacacacc 960ccaagacggc cattaataaa caaacacgac gtggacgaag agaagggagg ccggcaagaa 1020gcatactagc acgctacgaa accccccttc tcttcgtccc caaattgcac tacaaaaaag 1080gccgcccctt tcttctctcc tcgtccttat caccaccaat ccgatcctct tctcttctct 1140tctcttcttc cccacatcca gttcgattct catctctccc acaacaaatc acgccatgga 1200tccctacaag gtgccgcctt ttcctgattt tcttttcttc tagatcgatc gtcgatttgg 1260tttggtttgg tttcttgatg cgctcatccc aatctgactg actcactgga ttcctcctcc 1320ttgcagcatc ggccgtccag cgggagcaat tccaccttct ggac                  1364<210>2<211>4985<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2gtcgacctgc aggtcaacgg atcttatttt tccattataa tatatataat aaataaatat 60atgtttactt ttattatagt actttaaaag ataaatctat atatgttgtt ctagttcctt 120taaactaaat attattaaag ttattaatgg ttaaagttat aaaagtttga tatcaaactc 180gtccaaaatg tcgattaata tcgaaccgga gcgagtacag tattagtagc aagtcagcca 240catgggacat ggcccacatg catgcacgtc gtatgaacac accgtgattc tttgccactt 300gcataatatt ctagcactgc tatactacac gacgactgac ggcgacgtca gttcagttta 360gtttgccgca tccatcgcga aggctactct acccatccca ttttttttta aaaaaaaata 420ctataaatct aaatatctta cattagattt gtatatttta aagcaaagag aataatatgt 480agatataagt atgtacctac tcgctcgagc acaagatcac tgcaacaagc attgaagatc 540gctcctagca atggtctcaa cttaccatgt aaactaagag caactataat gtttttcttt 600tattaggaat ggttgcatct tatattttga gattgagaaa acacatatag aaattataca 660ggatttagca tttgggatgc cggccggatt cctgatttcc cagtctctgg ctttcttttt 720aaacaaaaac gaaaaaagca gtgatccgat cgatcacgat gagcgagcta gtaagctcca 780aaacaaaata gagtacgtac gtataatcct agagtccgga taataataat ccgtttggtt 840cgcgttaaaa aagtcttatc tcctcgtgat cccttttttt ggatcgatcc atgttcgtag 900tacgtgacaa gcacgcgcac caaccgaagc aggtacctgt gtcgctgcct gtgggcccca 960cacaccccaa gacggccatt aataaacaaa cacgacgtgg acgaagagaa gggaggccgg 1020caagaagcat actagcacgc tacgaaaccc cccttctctt cgtccccaaa ttgcactaca 1080aaaaaggccg cccctttctt ctctcctcgt ccttatcacc accaatccga tcctcttctc 1140ttctcttctc ttcttcccca catccagttc gattctcatc tctcccacaa caaatcacgc 1200catggatccc tacaaggtgc cgccttttcc tgattttctt ttcttctaga tcgatcgtcg 1260atttggtttg gtttggtttc ttgatgcgct catcccaatc tgactgactc actggattcc 1320tcctccttgc agcatcggcc gtccagcggg agcaattcca ccttctggac caccaactcc 1380ggcgcccccg tctggaacaa caactccgcc ctcaccgtcg gagagcgagg tactgagctg 1440ctccatcctc catcttcctc atctcttcct ccacgaatct atacttccta tcgatccatg 1500tgctttatgt ctgcttagag gcgtatttgg gcttgcttcc atcatgatcc aatgttaact 1560ttgagcgatc agatgcttaa taatttgtct gtgtctggta gcaacagaaa aggtccctgg 1620atctgtgtga attggactgt agcacgacgt gtgcgatctt gccttactat tgttccttta 1680gagctattca aagtttgcat ctttggtgtg ggggggtttt cagccttttg ctttgagtaa 1740catgtccttg tcactacctt gtgattcatc tgtgctgctt acacacaaag aggaagatct 1800ctagtttggt tgcactatgt tcttgttatt gctcggttac actccttcat caacgctaaa 1860agacgcagtc ttgatatttt tctctgtcgc tgtcaatctg tcataccatt aataaagaac 1920gtataaaaat tgaccttttc cccattcata gtagtgatta tctcacttgt cctcagttct 1980aaaacagcat tcttgttttt tgggggtttt tttaccatta tcggttcact ttacaaagta 2040atctgatgac gatcaaattt actggagtac cagagaagca caagtctatt tcatacatat 2100atccaacatg actcaagttt cgaaagtgac tggaagtcat gttccaaatg tcatggtcac 2160taaaagtacc aaactctgac aaagatgtat ttgcatctag aactaagtgc ttctatcatc 2220gatctgtgaa gttttctttc tagtgttttc cctttattta tactcagcaa ctcctgtatt 2280tttgcaatct gtaatcatgg ctgttttgtg gtttgacatg atgaattctt caatcgacag 2340gccctatcct ccttgaggac tatcatctga ttgaaaagct tgcacagttt gacagggagc 2400gtatccctga acgtgtcgtt catgcaaggg gagccagtgc caagggattt tttgaggtta 2460ctcatgatat ttctcacctc acatgtgctg attttctccg tgctcctggt gttcagaccc 2520cagttattgt tcggttctcc acagtcgtgc atgagcgtgg aagccctgag acattgaggg 2580aaccacgtgg ttttgctgtc aagttttaca ctagagaggt acttgctctt tcgcttcttt 2640ctttcatagg attgtaggag ggagacattc agtataatgt attcttcaag cataaggctg 2700tagaatcaaa tgtctagttg ttctcagttg gttaagtaga acatgaaaga ttggttgtcc 2760tttacctcca cactccatag gtccagtgca ttgcttaatc ttatatctac taaagcaaat 2820gagggtaatt tggtcttata tatctcaaaa gtctcacaca ttggacatat atctaaccag 2880tgtcacctac aactttgtct tactgtttat ttactgattt gcattcagtg ctgccatatt 2940ttgatatttt ctgagtcaat gcttttcagg gtaattttga tcttgttggg aacaatatgc 3000ctgtcttttt tatccgagat gggatgaaat tccctgacat ggtccatgct ttcaagccaa 3060gtccaaagac caatatgcag gagaactgga gaatagttga tttcttttca caccacccag 3120agagcctgca catgttctcc ttcctctttg acgatgtagg catcccactc aaccacaggc 3180acatggaggg ttttggtgtc aacacctaca ccctaatcaa taaggatgga aagcctcacc 3240ttgtcaaatt ccactggaag cctacctgtg gtgtcaaatg cctgttggat gatgaagctg 3300tgactgttgg cggcacctgc cacagccatg ccacgaagga cttgactgat tctattgcag 3360cagggaatta cccagagtgg aagctttaca tccagactat tgatcctgat catgaggaca 3420gatttgactt cgatcctctt gatgtcacca agacatggcc agaggatatc atccccctgc 3480agccagttgg acggatggtc ctgaacaaaa acattgataa cttctttgca gaaaatgaac 3540agcttgcttt ctgcccagcg ataattgtcc ctggaatcca ttactctgat gataagctgc 3600tccagacaag aattttctcc tatgctgata cccaaaggca ccgtcttggc ccaaactatt 3660tgatgcttcc tgtgaatgca ccaaaatgtg cataccacaa caaccaccac gatggctcca 3720tgaatttcat gcacagggat gaagaggtac tgtgtgtata tactttcaga gatacatctc 3780ctgcattcag ttgttgtgat gcatctttct gtttttgtcc attacatatt gtttcttcca 3840gtcaacacaa acagaatggg actatcattc agtttattgc atttacatct atttgccttg 3900tttttaggtt aactacttcc cttcaattca gtttattgca tttacatcta tttgccttgt 3960tttttaggtt aactacttcc cttcaaggtt tgatgctgca cgtcatgctg agaaggtccc 4020tattcctcct cgtgttctaa caggctgtcg ggaaaaggtg tgtaacttgg tccacttgaa 4080ctccttgcgc tgttaccttg tgagcatggt tttgtcccgc tacattagga gactatttgc 4140tgatttggaa tgcgatgaaa tatgtattat agatgtggta ccctggaaag tacaatgacc 4200acatgcattt gacacaatgt tttctgcctc tcttttttgt tggaaatgca gtgtgtcatt 4260gacaaggaga acaatttcca acaggctggt gagagatacc ggtcatttga ccctgccagg 4320tttgttcttg ttcaatttaa ttcgtgtgaa cacatcgaag agtttgagca acaacgctaa 4380ttaaactttt ctttttgtat gtaacacagg caagatcgtt ttctccagcg gtgggttgat 4440gctctctcag atcctcgtat tacacatgaa ctccgtggca tctggatctc ctactggtcg 4500caggtaacat aatttcttcg tgggtgcaaa gtgcttatca gttgtcagtg agagatcatg 4560tacaattgta ccttgtattg acacactgaa accatatatt tgtgtgttgt tgcagtgtga 4620tgcgtccctt gggcagaagc tggcttcacg tctcaacctg aaaccaaaca tgtagatcgg 4680ccaggaggaa tccagtggtg gtgctatgtt ggacagtcaa acatgaactg taatgtgtcg 4740accagccgta gtcgtgaata aaatgtgata cggtgatatg tatactggtg acgcaagttg 4800tgaaactgta tctggaatcc tgaaaatatg ccttgctgtg tcttgggaaa gagataataa 4860agactgatac agtgggtgct atatgtttga acttgtttat acatctgcca tctcttgttt 4920gcctttgtgt taagatggct ttagagactg gaacgaacaa ccagctgttt gcctttgtgc 4980ctttg                                                             4985<210>3<211>866<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>3tcgagcacaa gatcactgca acaagcattg aagatcgctc ctagcaatgg tctcaactta 60ccatgtaaac taagagcaac tataatgttt ttcttttatt aggaatggtt gcatcttata 120ttttgagatt gagaaaacac atatagaaat tatacaggat ttagcatttg ggatgccggc 180cggattcctg atttcccagt ctctggcttt ctttttaaac aaaaacgaaa aaagcagtga 240tccgatcgat cacgatgagc gagctagtaa gctccaaaac aaaatagagt acgtacgtat 300aatcctagag tccggataat aataatccgt ttggttcgcg ttaaaaaagt cttatctcct 360cgtgatccct ttttttggat cgatccatgt tcgtagtacg tgacaagcac gcgcaccaac 420cgaagcaggt acctgtgtcg ctgcctgtgg gccccacaca ccccaagacg gccattaata 480aacaaacacg acgtggacga agagaaggga ggccggcaag aagcatacta gcacgctacg 540aaacccccct tctcttcgtc cccaaattgc actacaaaaa aggccgcccc tttcttctct 600cctcgtcctt atcaccacca atccgatcct cttctcttct cttctcttct tccccacatc 660cagttcgatt ctcatctctc ccacaacaaa tcacgccatg gatccctaca aggtgccgcc 720ttttcctgat tttcttttct tctagatcga tcgtcgattt ggtttggttt ggtttcttga 780tgcgctcatc ccaatctgac tgactcactg gattcctcct ccttgcagca tcggccgtcc 840agcgggagca attccacctt ctggac                                      866<210>4<211>627<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>4aagctttcga tcacgatgag cgagctagta agctccaaaa caaaatagag tacgtacgta 60taatcctaga gtccggataa taataatccg tttggttcgc gttaaaaaag tcttatctcc 120tcgtgatccc tttttttgga tcgatccatg ttcgtagtac gtgacaagca cgcgcaccaa 180ccgaagcagg tacctgtgtc gctgcctgtg ggccccacac accccaagac ggccattaat 240aaacaaacac gacgtggacg aagagaaggg aggccggcaa gaagcatact agcacgctac 300gaaacccccc ttctcttcgt ccccaaattg cactacaaaa aaggccgccc ctttcttctc 360tcctcgtcct tatcaccacc aatccgatcc tcttctcttc tcttctcttc ttccccacat 420ccagttcgat tctcatctct cccacaacaa atcacgccac ggatccctac aaggtgccgc 480cttttcctga ttttcttttc ttctagatcg atcgtcgatt tggtttggtt tggtttcttg 540atgcgctcat cccaatctga ctgactcact ggattcctcc tccttgcagc atcggccgtc 600cagcgggagc aattccacct tctggac                                     627<210>5<211>524<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>5aagcttgtct tatctcctcg tgatcccttt ttttggatcg atccatgttc gtagtacgtg 60acaagcacgc gcaccaaccg aagcaggtac ctgtgtcgct gcctgtgggc cccacacacc 120ccaagacggc cattaataaa caaacacgac gtggacgaag agaagggagg ccggcaagaa 180gcatactagc acgctacgaa accccccttc tcttcgtccc caaattgcac tacaaaaaag 240gccgcccctt tcttctctcc tcgtccttat caccaccaat ccgatcctct tctcttctct 300tctcttcttc cccacatcca gttcgattct catctctccc acaacaaatc acgccacgga 360tccctacaag gtgccgcctt ttcctgattt tcttttcttc tagatcgatc gtcgatttgg 420tttggtttgg tttcttgatg cgctcatccc aatctgactg actcactgga ttcctcctcc 480ttgcagcatc ggccgtccag cgggagcaat tccaccttct ggac                  524<210>6<211>30<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>6ggtcgattct catctctccc acaacaaatc                                  30<210>7<211>30<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>7caatgtctca gggcttccac gctcatgcac                           30<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>8gtgaagcttt cgatcacgat gagcgag                              27<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>9gtagggatcc gtggcgtgat ttg                                  23<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>10gttaagcttg tcttatctcc tcgtgatcc                                   29<210>11<211>627<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>11atccgatcga tcacgatgag cgagctagta agctccaaaa caaaatagag tacgtacgta 60taatcctaga gtccggataa taataatccg tttggttcgc gttaaaaaag tcttatctcc 120tcgtgatccc tttttttgga tcgatccatg ttcgtagtac gtgacaagca cgcgcaccaa 180ccgaagcagg tacctgtgtc gctgcctgtg ggccccacac accccaagac ggccattaat 240aaacaaacac gacgtggacg aagagaaggg aggccggcaa gaagcatact agcacgctac 300gaaacccccc ttctcttcgt ccccaaattg cactacaaaa aaggccgccc ctttcttctc 360tcctcgtcct tatcaccacc aatccgatcc tcttctcttc tcttctcttc ttccccacat 420ccagttcgat tctcatctct cccacaacaa atcacgccat ggatccctac aaggtgccgc 480cttttcctga ttttcttttc ttctagatcg atcgtcgatt tggtttggtt tggtttcttg 540atgcgctcat cccaatctga ctgactcact ggattcctcc tccttgcagc atcggccgtc 600cagcgggagc aattccacct tctggac                                     627<210>12<211>103<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>12atccgatcga tcacgatgag cgagctagta agctccaaaa caaaatagag tacgtacgta 60taatcctaga gtccggataa taataatccg tttggttcgc gtt                   103

Claims (22)

1.一种启动子，包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
2.权利要求1中所述的启动子，其中所述启动子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ IDNO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
3.权利要求1中所述的启动子，其中所述启动子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ IDNO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
4.用于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的组合物，该组合物包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
5.权利要求4的组合物，其中所述启动子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
6.权利要求4的组合物，其中所述启动子包括如SEQ ID NO.12所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性。
7.权利要求4的组合物，其中所述的植物是单子叶植物或双子叶植物。
8.权利要求4的组合物，其中所述的植物是单子叶植物。
9.权利要求4的组合物，其中所述的植物是水稻，拟南芥属，玉米，小麦，大麦，番茄，黄瓜，茄子，马铃薯，莴苣，日本小萝卜，或胡萝卜。
10.权利要求4的组合物，其中目的基因编码选自下述组的至少一种多肽：赋予抗性的多肽，促进根发育的多肽，以及用于再分化植物体的选择标记。
11.权利要求4的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括根尖部分。
12.权利要求4的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括单子叶植物幼苗的分生组织区域。
13.权利要求4的组合物，其中根和茎端的至少一个位置包括茎端部分。
14.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物表达盒，该植物表达盒包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)所述目的基因。
15.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的质粒，该质粒包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因，
其中启动子与目的基因可操纵地连接。
16.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物细胞，该植物细胞包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
17.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物组织，该植物细胞包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
18.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的转基因植物，该转基因植物包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
19.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物种子，该植物种子包括：
1)一种包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列的启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；和
2)该目的基因。
20.在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法，该方法包括：
1)提供带有编码启动子的核酸的植物，其中该启动子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供带有编码所述目的基因的核酸的植物，和
3)将植物置于允许启动子进行操作的条件下。
21.由在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的方法得到的基因产物，该方法包括：
1)提供带有编码启动子的核酸的植物，其中该启动子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)提供带有编码所述目的基因的核酸的植物，和
3)将植物置于允许启动子进行操作的条件下。
22.适应于在植物的根和茎端的至少一个位置表达目的基因的植物的产生方法，该方法包括：
1)提供一种包含启动子的质粒，该启动子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10个连续核苷酸的序列，并且具有与SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的启动子活性；
2)用所述质粒转化植物细胞；并且
3)培养所转化的植物细胞。
CNA028031873A 2002-01-25 2002-01-25 在根和苗端表达外源基因的启动子 Pending CN1476477A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2002/000573 WO2003064649A1 (fr) 2002-01-25 2002-01-25 Promoteur exprimant un gene etranger dans une racine ou l'apex d'une pousse

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1476477A true CN1476477A (zh) 2004-02-18

Family

ID=27639247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028031873A Pending CN1476477A (zh) 2002-01-25 2002-01-25 在根和苗端表达外源基因的启动子

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7790872B2 (zh)
JP (1) JPWO2003004649A1 (zh)
KR (1) KR20030077526A (zh)
CN (1) CN1476477A (zh)
AU (1) AU2002226733A1 (zh)
CA (1) CA2425623A1 (zh)
WO (1) WO2003064649A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107815452A (zh) * 2017-12-06 2018-03-20 新疆农垦科学院 一种植物叶片特异性表达的启动子及其应用
CN110577925A (zh) * 2019-10-16 2019-12-17 中国农业科学院生物技术研究所 一种制备水稻根原生质体的组合物和方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016128519A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Bayer Cropscience Nv Shoot apex-preferential promoters and uses thereof
CN111108205B (zh) * 2017-09-11 2024-05-28 奥驰亚客户服务有限公司 用于生产烟杈减少或消除的烟草植物和制品的组合物和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2955644B2 (ja) 1995-09-26 1999-10-04 農林水産省農業生物資源研究所長 イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター
US6774282B1 (en) * 1999-03-08 2004-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize metallothionein gene and promoter
US6544783B1 (en) 2000-04-26 2003-04-08 J. Ranjan Perera Polynucleotide sequences from rice

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107815452A (zh) * 2017-12-06 2018-03-20 新疆农垦科学院 一种植物叶片特异性表达的启动子及其应用
CN110577925A (zh) * 2019-10-16 2019-12-17 中国农业科学院生物技术研究所 一种制备水稻根原生质体的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20060230470A1 (en) 2006-10-12
CA2425623A1 (en) 2003-07-25
JPWO2003004649A1 (ja) 2005-07-21
WO2003064649A1 (fr) 2003-08-07
US7790872B2 (en) 2010-09-07
AU2002226733A1 (en) 2003-09-02
KR20030077526A (ko) 2003-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1154740C (zh) 根皮层特异性基因启动子
CN1164869A (zh) 来源于环病毒的植物转录调节物
CN1494594A (zh) 营养生长特异性启动子及由此而得的基因重组植物
CN1796559A (zh) 利用水稻转录因子基因OsNACx提高植物抗旱耐盐能力
CN1283795C (zh) 获自水稻的胁迫诱导启动子
CN111154756B (zh) 植物花药花粉发育后期特异性表达启动子及其应用
CN106148390A (zh) Chy锌指蛋白转录激活辅因子及其应用
CN1185350C (zh) 包含稻花药特异基因的dna及其转化的转基因植物
CN1780915A (zh) 组织特异性启动子
CN111944816B (zh) 一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用
CN1840542A (zh) 水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用
CN1476477A (zh) 在根和苗端表达外源基因的启动子
CN1195063C (zh) 蛋白酶抑制剂融合蛋白
CN1807611A (zh) 紫花苜蓿半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用
EP1111051B1 (en) Promoter for guard cell-specific gene expression in plants
CN1795267A (zh) 胁迫－诱导的启动子及其使用方法
CN1257977C (zh) 利用水稻干旱诱导基因启动子leap改良植物抗旱性
CN1526817A (zh) 脱水素基因BcDh1及其启动子在培育耐旱植物中的应用
CN1486369A (zh) 棉花中一种花药特异性启动子(cofs)的分离和鉴定
CN1537944A (zh) 一种受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用
CN1131311C (zh) 一种植物维管束特异表达的Angrpl基因启动子及其应用
CN114621952B (zh) ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用
CN104988153A (zh) 一种植物根特异性启动子及其应用
CN1552854A (zh) 一种编码蛛丝蛋白的基因及其应用
CN1191354C (zh) 产生小穗数目增多的转基因水稻的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication