CN114621952B - ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用 - Google Patents
ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种响应低温胁迫的诱导型启动子ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W‑box及其应用。ShWRKY33启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者为与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有75％以上一致性且具有启动子功能的DNA分子。关键顺式调控元件W‑box，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明公开了上述启动子及关键顺式调控元件W‑box在培育抗寒番茄中的应用，以改良番茄品种的抗寒性能。因此，本发明为培育耐低温番茄新品种提供了理想启动子和调控靶点，具有较好的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程领域，具体涉及一种来源于野生番茄的低温诱导型启动子ShWRKY33启动子和关键顺式调控元件W-box及其应用，该启动子和W-box元件能够驱动目的基因在低温胁迫条件下在番茄中表达，从而提高番茄低温抗性。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum L.)属于茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopersicon)植物，是世界上极其重要的蔬菜作物之一。我国是世界三大番茄种植区域之一，番茄产量约占全球番茄产量的25％。然而，番茄是一种喜温性蔬菜，对低温胁迫极其敏感。在我国北方无加温系统的日光温室内，冬季及早春的低温逆境严重降低了番茄的产量与质量。低温胁迫已经成为限制番茄等设施作物生长发育的主要环境因素之一。如何提高番茄的低温抗性，已成为冬春季节设施番茄栽培的主要问题。此外，低温逆境不仅危害植物的生长发育，长期低温或极端低温甚至导致植物死亡。
多毛番茄(Solanum habrochaites L.)是茄科茄属的一个野生种，主要分布在厄瓜多尔到秘鲁的中部，纬度为13.5°，一般在海拔2000-2500m以上的地方生长。其具备一些栽培番茄所没有的抗病、抗虫、抗逆和品质特性。多毛番茄和普通栽培番茄是近缘物种，但其比栽培番茄具有更强的低温抗性。在栽培番茄遗传变异日趋狭窄的背景下，对野生番茄优异等位基因的研究和利用将是番茄研究领域努力的重要方向。
随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大量抗寒相关基因用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成型启动子CaMV(cauliflower mosaic virus)35S驱动下产生的。这种基因的组成型表达对植物的生长造成了一定的影响，普遍出现不同程度的生长延滞(retardation)现象，因为外源基因的过量表达往往会竞争植物在正常生长条件下需要的能量并且阻碍蛋白质或者RNA的合成。
植物基因调控主要是在转录水平上进行，受多种顺式调控元件和反式作用因子的相互协调。植物基因启动子是重要的顺式调控元件。它是位于结构基因5’上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，是转录调控的中心。诱导型启动子不同于组成型的启动子，平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号刺激下，转录活性能够显著地提高。培育抗逆作物新品种最好使用逆境诱导的植物启动子，使外源基因只在胁迫的情况下才大量表达，这样不仅会获得目的产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。
目前能应用于番茄转基因抗逆研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的相关逆境诱导启动子的发现、克隆、顺势调控元件分析仍然是今后研究的重点，将功能明确且高效的逆境诱导启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。目前研究表明，WRKY家族中逆境相关基因往往对多种逆境胁迫响应，这大部分是由于该类基因启动子上含有多种逆境胁迫相关的顺式调控元件。通过对比多毛番茄和栽培番茄同源WRKY基因在低温下的相对表达量，我们筛选到一对同源基因WRKY33，在栽培番茄中SlWRKY33低温下不被诱导表达，而在多毛番茄中低温下显著诱导ShWRKY33表达。因此通过对上述相关的WRKY家族基因启动子的研究可以得到多种与低温胁迫相关的关键DNA片段和顺式调控元件，对构建有效的低温诱导型启动子有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种受低温强烈诱导表达的番茄启动子ShWRKY33启动子和关键顺式调控元件W-box及其应用。本发明的ShWRKY33启动子和关键顺式调控元件W-box对通过启动目的基因在低温下的高表达，来提高转基因番茄对低温的耐受性，具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
响应低温胁迫的诱导型启动子ShWRKY33启动子：
a)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或者，
b)为与a)限定的核苷酸序列具有75％以上一致性，且具有启动子功能的DNA分子。
ShWRKY33启动子可从野生多毛番茄ShWRKY33基因启动子区域克隆得到。
本发明还提供了含有所述的ShWRKY33启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还提供了所述的ShWRKY33启动子在提高植物抗冷性中的应用。
本发明又提供了响应低温胁迫的关键顺式调控元件W-box，核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。
相应的，本发明提供了含有所述的关键顺式调控元件W-box的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还提供了所述的关键顺式调控元件W-box在提高植物抗冷性中的应用。
作为一个总的发明构思，本发明还提供了WRKY33基因在提高植物抗冷性中的应用，所述WRKY33基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明还提供了一种提高番茄低温抗性的方法，使用所述的诱导型启动子ShWRKY33启动子驱动WRKY33基因表达，WRKY33基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在烟草瞬时表达的启动子活性分析实验中，我们发现低温可以诱导ShWRKY33启动子及关键顺式调控元件W-box突变恢复的SlWRKY33启动子响应低温，而不会诱导SlWRKY33启动子响应低温。同时，通过构建不同启动子驱动的SlWRKY33过表达植株，发现ShWRKY33启动子和关键顺式调控元件W-box突变恢复的SlWRKY33启动子启动的番茄SlWRKY33过表达植株低温下能够显著诱导SlWRKY33基因表达，从而提高番茄的低温抗性。本发明还提供上述启动子及关键顺式调控元件W-box在培育抗寒番茄中的应用，以改良番茄品种的抗寒性能。因此，本发明为培育耐低温番茄新品种提供了理想启动子和调控靶点，具有较好的潜在应用价值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对野生多毛番茄和栽培番茄的WRKY33基因启动子进行研究，发现了受低温诱导的ShWRKY33启动子和WRKY33启动子的关键顺式调控元件W-box，为构建有效的低温诱导型启动子提供了基础。
附图说明
图1为SlWRKY33和ShWRKY33启动子全长的多序列比对结果。
图2为SlWRKY33和ShWRKY33启动子全长及ShWRKY33启动子5’缺失截短启动子烟草瞬时表达的低温诱导活性分析。其中，图2A为SlWRKY33和ShWRKY33启动子全长及ShWRKY33启动子5’缺失截短启动子与报告基因LUC融合的报告载体示意图；图2B为烟草瞬时表达的低温诱导下LUC活性分析。
图3为SlWRKY33和ShWRKY33启动子全长及关键顺式调控元件W-box突变恢复的mSlWRKY33启动子烟草瞬时表达的低温诱导活性分析。其中，图3A为SlWRKY33和ShWRKY33启动子全长及关键顺式调控元件W-box突变恢复的mSlWRKY33启动子与报告基因LUC融合的报告载体示意图；图3B为烟草瞬时表达的低温诱导下LUC活性分析。
图4为本发明实施例3中不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因过表达阳性株系在蛋白水平上的检测。WT为未转基因的野生型番茄Ailsa Craig；pSl::SlW33为SlWRKY33-1879启动的番茄SlWRKY33过表达植株；pSh::SlW33为ShWRKY33-1919启动的番茄SlWRKY33过表达植株；mpSl::SlW33为mSlWRKY33-1879启动的番茄SlWRKY33过表达植株。
图5为本发明实施例3中，番茄野生型、不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因过表达株系低温诱导下SlWRKY33基因的相对表达量。
图6为本发明实施例3中在常温与低温条件下，番茄野生型、不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因过表达株系在低温处理后的表型。
图7为本发明实施例3中在常温与低温条件下，番茄野生型、不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因过表达株系在低温处理后的相对电导率。
图8为本发明实施例3中在常温与低温条件下，番茄野生型、不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因过表达株系在低温处理后的PSII最大光化学效率(Fv/Fm)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明的启动子的分离与鉴定
1.SlWRKY33及ShWRKY33启动子全长序列的获得及驱动LUC基因表达的植物表达载体的构建
根据SGN(https://solgenomics.net)提供的番茄全基因组序列，依据番茄SlWRKY33基因的上游序列设计扩增引物，正向引物在转录起始位点上游1879bp位置且含有HindIII酶切位点：
Sl33F-1879:5’-gtcgacggtatcgataagcttGACCACACATGCTCACGACTTATT-3’(HindIII)；反向引物设计在SlWRKY33基因转录起始位点且含有BamHI酶切位点：
Sl33R-1879:5’-cgctctagaactagtggatccTTAAAATTCAAACTTGTTGAAATATAATTTG-3’(BamHI)。
根据多毛番茄全基因组序列预测的ShWRKY33基因序列，推测出ShWRKY33的启动子序列，在ShWRKY33基因转录起始位点上游1919bp位置且含有HindIII酶切位点：
Sh33F-1919:5’-gtcgacggtatcgataagcttGACCACACATGCTCACGACTTAA-3’(HindIII)；反向引物设计在ShWRKY33基因转录起始位点且含有BamHI酶切位点：
Sh33R-1919:5’-cgctctagaactagtggatccTTAAAATTCAAGATTGTTGAAATATAATTTG-3’(BamHI)。
取培养30天的栽培番茄AC和多毛番茄LA1777叶片组织50mg，采用TPS法提取基因组DNA，分别作为扩增SlWRKY33和ShWRKY33启动子的模板。
启动子扩增体系如下(20μl体系)：
PCR程序：98℃变性2min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，68℃延伸25sec(根据实际扩增产物长度调整)，40个循环；最后68℃延伸5min。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，结果表明PCR获得约2000bp的条带，将其回收纯化，连接到pGreenII 0800-LUC载体(用HindIII和BamHI双酶切)，连接转化E.coli菌株DH5α，提取质粒得到重组载体，对获得的重组质粒进行测序验证，结果表明上述PCR获得的片段分别具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，将含有序列1的核苷酸序列的SlWRKY33启动子命名为SlWRKY33-1879，含有序列2的核苷酸序列的ShWRKY33启动子命名为ShWRKY33-1919，并分别将含有SlWRKY33-1879和ShWRKY33-1919的重组载体命名为SlWRKY33-P1879和ShWRKY33-P1919。
利用PlantCare网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对上述SlWRKY33基因启动子SlWRKY33-1879序列和ShWRKY33基因启动子ShWRKY33-1919序列进行分析，发现两个启动子中都存在着MYB转录因子结合位点、MYC转录因子结合位点、WRKY转录因子结合位点W-box以及ABRE(ABA responsive element)等逆境诱导相关元件。利用DNAMAN软件对SlWRKY33-1879和ShWRKY33-1919进行序列比对，比对结果见附图1。
2.ShWRKY33启动子5’缺失序列的获得及驱动LUC基因表达的植物表达载体的构建
为了对ShWRKY33-1919进行功能分析，以ShWRKY33-P1919为模板，分别在ShWRKY33基因上游-1000、-700、-570、-470、-400bp处设计引物(引物加HindIII位点)；引物序列如下所述：
Sh33F-1000:5’-gtcgacggtatcgataagcttTAATACAAACAAGAAGATTTGAATTTTAATATT-3’(HindIII)；
Sh33F-700:5’-gtcgacggtatcgataagcttTAAGGTCTAACACAAAGGATCATCTCTT-3’(HindIII)；
Sh33F-570:5’-gtcgacggtatcgataagcttCTTTCGAGCTATATTAAATTATATAAATTTAATATT-3’(HindIII)；
Sh33F-470:5’-gtcgacggtatcgataagcttCATGTAAAAAACAAAATATATCTAATCAAAATT-3’(HindIII)；
Sh33F-400:5’-gtcgacggtatcgataagcttAGTAAACGATATGCATTCTCTCTTCATT-3’(HindIII)。
以上述引物为正向引物，以Sh33R-1919为反向引物进行PCR扩增，结果表明Sh33F-1000与Sh33R-1919扩增得到约1000bp的片段，Sh33F-700与Sh33R-1919扩增得到约700bp的片段，Sh33F-570与Sh33R-1919扩增得到约600bp的片段，Sh33F-470与Sh33R-1919扩增得到约500bp的片段，Sh33F-400与Sh33R-1919扩增得到约400bp的片段。将上述PCR获得的片段，分别连接到pGreenII 0800-LUC载体(用HindIII和BamHI双酶切)，连接转化E.coli菌株DH5α，提取质粒得到重组载体，对获得的重组质粒进行测序验证，结果表明引物Sh33F-1000与Sh33R-1919扩增得到的片段具有自序列表中序列2的5’端的第920-1919位(序列表中序列3)的核苷酸序列，将其命名为ShWRKY33-1000，将上述得到的含有ShWRKY33-1000的重组载体命名为ShWRKY33-P1000；引物Sh33F-700与Sh33R-1919扩增得到的片段具有自序列表中序列2的5’端的第1220-1919位(序列表中序列4)的核苷酸序列，将其命名为ShWRKY33-700，将上述得到的含有ShWRKY33-700的重组载体命名为ShWRKY33-P700；引物Sh33F-570与Sh33R-1919扩增得到的片段具有自序列表中序列2的5’端的第1350-1919位(序列表中序列5)的核苷酸序列，将其命名为ShWRKY33-570，将上述得到的含有ShWRKY33-570的重组载体命名为ShWRKY33-P570；引物Sh33F-470与Sh33R-1919扩增得到的片段具有自序列表中序列2的5’端的第1450-1919位(序列表中序列6)的核苷酸序列，将其命名为ShWRKY33-470，将上述得到的含有ShWRKY33-470的重组载体命名为ShWRKY33-P470；引物Sh33F-400与Sh33R-1919扩增得到的片段具有自序列表中序列2的5’端的第1520-1919位(序列表中序列7)的核苷酸序列，将其命名为ShWRKY33-400，将上述得到的含有ShWRKY33-400的重组载体命名为ShWRKY33-P400。
实施例2
启动子低温诱导活性分析
1.农杆菌介导的烟草瞬时表达
将SlWRKY33-P1879、ShWRKY33-P1919、ShWRKY33-P1000、ShWRKY33-P700、ShWRKY33-P570、ShWRKY33-P470以及ShWRKY33-P400电击转化转入农杆菌GV3101(pSoup)感受态中。分别挑取含有SlWRKY33-P1879、ShWRKY33-P1919、ShWRKY33-P1000、ShWRKY33-P700、ShWRKY33-P570、ShWRKY33-P470、ShWRKY33-P400单菌落，接种于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养24h。然后按照体积比1:100转接至30ml含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养约12h，至OD600为0.8～1.0。12000rpm离心7～10min，收集菌体。菌体重悬于含有乙酰丁香酮的MES侵染液中，并调整菌液浓度(OD600大约为0.8)，28℃静置活化3h作为待用渗滤液。
选取生长发育健壮且长势一致的4～5片叶的本氏烟草进行瞬时表达。选取下部两片完全展开叶进行渗滤，并提前用记号笔标记。具体渗滤过程为：用1ml一次性注射器吸取活化完成的渗滤液，轻轻压注射器，用手指在叶片正面支撑，使渗滤液轻轻渗入叶片背面，可能需要多次操作，直到整个叶面湿润为止。以空载体pGreenII 0800-LUC作对照。
2.低温胁迫处理及LUC荧光分析
接种48h后，将部分上述瞬时表达的本氏烟草置于4℃，6h后，取样，采用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，E1910)进行LUC/REN荧光定量检测。以未经处理的正常25℃条件下培养的上述瞬时表达的本氏烟草为对照。
结果分析：ShWRKY33启动子全长序列ShWRKY33-1919以及5’缺失序列ShWRKY33-1000和ShWRKY33-700都受低温诱导，即在低温诱导下能增强LUC基因表达。而SlWRKY33启动子全长序列SlWRKY33-1879及ShWRKY33-570、ShWRKY33-470和ShWRKY33-400均不受低温诱导，即在低温下LUC基因表达无显著上调(附图2)。这说明多毛番茄ShWRKY33启动子序列的-700bp到-570bp之间的DNA序列是响应低温诱导的关键DNA片段，通过序列比对(附图1)，发现其中存在关键顺式调控元件W-box，可以在低温下诱导下游基因的表达。
实施例3
SlWRKY33启动子关键顺式调控元件W-box的功能鉴定
1.SlWRKY33启动子全长序列(关键W-box位点突变恢复)的LUC基因表达植物载体的构建
首先在W-box突变位点处设计引物：
mF:5’-TGACTAATCTTTTGAGCTATATTAAATTAAATAGATTTA-3’
mR:5’-GCTCAAAAGATTAGTCAAATTGATTCTTTTAAAGTGAATCG-3’
分别以Sl33F-1879为正向引物、mR为反向引物以及mF为正向引物、Sl33R-1879为反向引物，AC的基因组DNA为模板进行PCR扩增。将上述PCR获得的片段，通过多片段同源重组的方法连接到pGreenII0800-LUC载体(用HindIII和BamHI双酶切)，连接转化E.coli菌株DH5α，提取质粒得到重组载体，对获得的重组质粒进行测序验证，结果表明扩增得到的片段具有自序列表中序列8的核苷酸序列，将其命名为mSlWRKY33-1879，将上述得到的含有mSlWRKY33-1879的重组载体命名为mSlWRKY33-P1879。
2.启动子低温诱导活性分析
方法同实施例2。
结果表明：SlWRKY33启动子全长序列SlWRKY33-1879本身不受低温诱导，而通过点突变，使得SlWRKY33启动子关键顺式调控元件W-box突变恢复，得到的mSlWRKY33-1879恢复了低温诱导活性，达到与ShWRKY33启动子全长序列ShWRKY33-1919相似的低温诱导表达水平，即在低温诱导下能显著增强LUC基因的表达(附图3)。这说明该W-box元件是诱导ShWRKY33启动子低温表达的关键顺式调控元件，通过突变恢复SlWRKY33启动子中的该W-box元件，可以使得突变后的mSlWRKY33-1879恢复低温诱导活性。
3.不同启动子驱动的SlWRKY33基因过表达载体的构建
切除商品化的植物表达载体pFGC1008-3HA自带的CaMV35S启动子，分别连入SlWRKY33-1879、ShWRKY33-1919和mSlWRKY33-1879替换自带的CaMV35S启动子，得到表达载体pFGC1008-SlWRKY33-1879-3HA、pFGC1008-ShWRKY33-1919-3HA和pFGC1008-mSlWRKY33-1879-3HA。
(a)从野生型AC番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，分别以如下所述序列为正向引物(含AscI限制性酶切位点)：
pSl33::Sl33F:5’-aagtttgaattttaaggcgcgccATGGCTTCTTCAGGTGGAAATATG-3’(AscI)；
pSh33::Sl33F:5’-aatcttgaattttaaggcgcgccATGGCTTCTTCAGGTGGAAATATG-3’(AscI)；
mpSl33::Sl33F:5’-ttacaattaccatggggcgcgccATGGCTTCTTCAGGTGGAAATATG-3’(AscI)；
均以如下所述序列为反向引物(含KpnI限制性酶切位点)：
Sl33R:5’-aacatcgtatgggtaggtaccGTTAAGGAAAGAGCTGAAGAATAAATCA-3’(KpnI)；
对SlWRKY33基因进行PCR扩增，得到去除终止子的番茄SlWRKY33基因的CDS全长1587bp；将人为改造的植物转化载体pFGC1008-SlWRKY33-1879-3HA、pFGC1008-ShWRKY33-1919-3HA和pFGC1008-mSlWRKY33-1879-3HA，用AscI和KpnI限制性内切酶进行酶切使其线性化，然后进行片段与载体的同源重组，构建不同启动子驱动的番茄SlWRKY33基因的过表达载体，分别命名为pFGC1008-SlWRKY33-1879::SlWRKY33-3HA、pFGC1008-ShWRKY33-1919::SlWRKY33-3HA和pFGC1008-mSlWRKY33-1879::SlWRKY33-3HA。
4.不同启动子驱动的SlWRKY33基因过表达植株的构建与检测
将上述三个过表达载体分别转化到农杆菌GV3101，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗。
利用Western Blot在蛋白水平检测番茄不同启动子驱动的SlWRKY33基因过表达阳性植株。结果见附图4。
5.不同启动子驱动的SlWRKY33基因过表达植株的低温抗性检测
将五叶一心的野生型番茄幼苗和实施例3中所得的过表达株系在人工培养箱内进行25℃和4℃处理，低温处理6h，取相同叶位叶片，提取RNA，反转录为cDNA，利用qRT-PCR技术检测低温下，SlWRKY33的诱导表达水平。低温处理7天后，将低温胁迫处理组与相同条件下未进行低温处理的对照组进行比较，进行表型拍摄、相对电导率测定和PSII最大光化学效率(Fv/Fm)测定。
植株相对电导率测定方法为：取番茄新鲜叶片0.3g，去除叶片表面污垢，去除主叶脉后剪成1cm宽的细条，随后经过ddH2O清洗3次，放置在盛有25mL ddH2O的50mL离心管中。在28℃、200rpm的摇床内震荡2h，用电导仪检测水溶液的电导率，记为EC1。将样品放置在95℃的水浴锅中水浴加热15min，经过30min室温静置后，用电导仪检测水溶液的电导率，记为EC2。相对电导率(REL)的计算方法参考公式：REL(％)＝EC1/EC2*100。
PSII最大光化学效率(Fv/Fm)测定方法为：将植株置于暗环境适应30min后，使用叶绿素荧光成像仪(IMAG-PAM；Heinz Walz，Germany)照射检测光(<0.5μmol m-2s-1)，测得最小荧光Fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m-2s-1)，测得最大荧光Fm。
荧光参数计算方法：PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)＝(Fm-Fo)/Fm。
结果显示，ShWRKY33-1919和mSlWRKY33-1879启动的番茄SlWRKY33过表达植株低温下能够显著诱导SlWRKY33基因表达(附图5)，从而提高番茄的低温抗性(附图6)，使得低温下的电导率显著低于野生型WT和SlWRKY33-1879启动的SlWRKY33过表达植株(附图7)。此外，ShWRKY33-1919和mSlWRKY33-1879启动的番茄SlWRKY33过表达植株的Fv/Fm(附图8)也显著高于野生型番茄(WT)和SlWRKY33-1879启动的SlWRKY33过表达植株。由此可见，ShWRKY33-1919启动子和关键顺式调控元件W-box可显著诱导番茄低温下SlWRKY33基因的表达，从而提高番茄的低温抗性。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1879
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 1
gaccacacat gctcacgact tattatataa ttaaccaaca tatatttcaa cttgttcata 60
atatatatat agtcaagcca aaataaaagg gggcaaagag gatatatgca atataaaatg 120
agcttgatgt atttatttat ttatatttcc ataagcacaa acttactcca gtctcatctt 180
ttataagata acaaaattaa atttaagaaa atagctaaaa gttatattat attagctatt 240
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ttgattattt gaagtattag ctcataaaaa gtataacagc ataacgagtt tattccaaac 420
tagttgaggt caattattta aactttttat atttagagaa ttgccatata ataatttgtt 480
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ggctaaaaaa ttagttcctt ttgattctga tttatgagat acccttcttt taaagtttat 1080
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cccactccat aaggtctaac acaaaggatc atctcttata tatatatata tatatatata 1260
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atcttttgag ctatattaaa ttaaatagat ttaatatttt aaattttaaa tattctataa 1380
taaaaaaatt acaatcgtat tcattctgtt tgactctcga aaagcaagtc gatgatattt 1440
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aaaaaaagat ttctaaatat tccacggtca aaagtacctt ttagcttcct agaaaatgcc 1740
taaaacacca aaatttttat aactacaaat accacaaacc ccattttttt cttttataaa 1800
atctaagtac tcatcttttt tttttcctct taatatattt tttttgttca aattatattt 1860
caacaagttt gaattttaa 1879
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatttattct tcagctcttt ccttaactga 1590
Claims (7)
1.响应低温胁迫的诱导型启动子ShWRKY33启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
2.含有如权利要求1所述的响应低温胁迫的诱导型启动子ShWRKY33启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。
3.如权利要求1所述的响应低温胁迫的诱导型启动子ShWRKY33启动子在提高番茄抗冷性中的应用。
4.响应低温胁迫的关键顺式调控元件W-box，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.含有如权利要求4所述的关键顺式调控元件W-box的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，所述转基因细胞系不属于动物或植物品种。
6.如权利要求4所述的关键顺式调控元件W-box在提高番茄抗冷性中的应用。
7.一种提高番茄低温抗性的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的诱导型启动子ShWRKY33启动子驱动WRKY33基因表达，WRKY33基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
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|---|---|---|---|
| CN202210097172.XA CN114621952B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210097172.XA CN114621952B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114621952A CN114621952A (zh) | 2022-06-14 |
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Family
ID=81899091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210097172.XA Active CN114621952B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | ShWRKY33启动子、关键顺式调控元件W-box及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN105543274A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-05-04 | 浙江省农业科学院 | 番茄SlWRKY81基因的用途 |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| US20040078852A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-04-22 | Thomashow Michael F. | Transcription factors to improve plant stress tolerance |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210097172.XA patent/CN114621952B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543274A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-05-04 | 浙江省农业科学院 | 番茄SlWRKY81基因的用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Characterization of WRKY transcription factors in Solanum lycopersicum reveals collinearity and their expression patterns under cold treatment;Chen Lin等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;第464卷;摘要、3结果、4讨论 * |
| PREDICTED: Solanum lycopersicum WRKY transcription factor 33B (LOC101268787), mRNA;GenBank;《GenBank》;第1-2页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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