CN105543274A - 番茄SlWRKY81基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄<i>SlWRKY81</i>基因的用途，该基因的碱基序列为SEQ？TD？NO：1所示，该基因用于培育耐旱性调节的植物，所述的培育耐旱性调节植物包括培育具有气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物，所述的培育耐旱性调节植物包括培育气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物。本发明通过有效地培养步骤，可以调节植物抗旱性。

Description

番茄SlWRKY81基因的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及番茄SlWRKY81基因的用途。

背景技术

进入21世纪以来，现代农业发展已经成为世界农业发展的主流，据统计，2011年中国蔬菜产值达到1.26万亿元，首次超过粮食总产值，成为中国产值最大的农产品；近年，全球环境不断恶化，各地蔬菜生产经常受到干旱等自然灾害的影响，严重制约了植物的生长发育，极大的影响了我国各类蔬菜产品的生产和供应。

番茄（Solanumlycopersicum），是我国乃至世界范围内栽培最广，消费最多的蔬菜作物之一，以其丰富的维生素和营养成分深受广大消费者喜爱，作为茄科的重要代表植物以及世界最重要的食用蔬菜品种之一，番茄的基因组测序的完成为从基因组水平上分析其逆境响应特征，在现有品种上进一步改良农艺性状奠定了基础。

WRKY转录因子（WRKY）是高等植物中最大的转录因子蛋白家族之一，是植物应答生物/非生物逆境胁迫的调控元件，能够识别特定的W-box元件（TTGACC/T），调节下游靶标基因的表达，进而实现植物对外界不利环境的响应。当植物细胞受到如高温、盐害和干旱等逆境后，植物体内的各种信号途径被激活，并传递到相应WRKY转录因子，进而实现对胁迫应对靶标基因表达的转录调控（激活/抑制）；植物WRKY是一个复杂的基因家族，在拟南芥中有75个，水稻中有103个，番茄有81个。根据它们的结构主要可分为I、II（IIa，IIb，IIc，IId，IIe）和III三类。

目前对WRKY的研究主要集中在其对各种病菌的响应调控上，拟南芥的AtWRKY33能被灰霉病菌诱导，该基因缺失后，使植株对灰霉病的抗性显著下降。关于番茄SlWRKY的研究中发现，番茄SlWRKY70和SlWRKY72在线虫抗性基因Mi-1介导的根结线虫抗性中发挥作用；番茄SlWRKY在许多其它胁迫，尤其是非生物胁迫中的作用报道尚少，因此深入研究SlWRKY的功能，对研发相应的抗性品种具有一定的理论指导意义。

发明内容

本发明是为了解决现有部分植物抗旱性不适合种植地气候环境的问题，提供一种番茄SlWRKY81基因的用途，采用番茄SlWRKY81基因，通过有效地培养步骤，来作为调节植物抗旱性的工具。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：番茄SlWRKY81基因的用途，该基因的碱基序列为SEQTDNO：1所示，该基因用于培育耐旱性调节的植物。本方案提出了碱基序列如SEQTDNO：1所示的番茄SlWRKY81基因编码蛋白在调控植物气孔运动和耐旱性中的作用，具体表现为该基因可影响植物气孔开闭以及调节植物干旱抗性增强或降低；番茄SlWRKY81基因在植物中的表达量越低，在干旱胁迫下该植物叶片气孔关闭越快，对干旱耐受性越大；番茄SlWRKY81基因在植物中的表达量越高，在干旱胁迫下该植物叶片内气孔关闭越慢，干旱抗性越差。

作为优选，所述的培育耐旱性调节植物包括培育具有气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向目标植物中导入番茄SlWRKY81基因进行抑制表达，得到SlWRKY81基因沉默转基因植株；2）将SlWRKY81基因沉默转基因植株与未处理的目标植物相比，得到气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植株。在目的植物中，对SlWRKY81基因进行抑制表达，可为任何可降低目的植物中所述SlWRKY81基因的表达的方法。

作为优选，所述的抑制表达通过病毒诱导的方式实现。

作为优选，所述的培育耐旱性调节植物包括培育气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向模式植物中导入番茄SlWRKY81基因进行过表达，得到SlWRKY81基因过表达的转基因植株；2）将SlWRKY81基因过表达的转基因植株与未处理的模式植物相比，得到具有气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植株。

作为优选，所述的过表达通过病毒诱导或者通过含有番茄SlWRKY81基因的重组表达载体导入模式植物中，所述的重组表达载体包括pFGC5941、pCAMBIA1300、pBI121。重组表达载体可用已有的pFGC5941、pCAMBIA1300和pBI121等或其它衍生植物表达载体，使用植物表达载体构建重组载体时，可以使用组成型、组织特异型或诱导型启动子。

作为优选，所述的转基因植株进行干旱胁迫处理，观察植株气孔状态和抗旱表型进行筛选。气孔状态和运动的观察方法，可采用LI6400XT光合仪测定气孔导度或者CLSM激光共聚焦显微镜观察气孔的方法。

经本发明研究发现，干旱可以诱导番茄叶片气孔的关闭，SlWRKY81基因过表达阻碍了干旱条件下气孔的关闭，而SlWRKY81基因沉默能显著增强番茄气孔对干旱的敏感性，因此干旱胁迫下，沉默番茄SlWRKY81表达能够通过诱导气孔关闭，从而增强植株抗旱性。

作为优选，所述的目标植物为番茄。

作为优选，所述的模式植物为拟南芥。

因此，本发明具有如下有益效果：通过有效地培养步骤，可以调节植物抗旱性。

附图说明

图1是本发明SlWRKY81基因沉默植株在干旱条件下SlWRKY81基因的表达。

图2是本发明干旱胁迫条件下SlWRKY81沉默番茄植株表型的照片，其中TRV:TRV为对照植株，TRV:SlWRKY81为基因沉默植株。

图3是本发明不同SlWRKY81基因过表达植株中SlWRKY81基因的表达。

图4是本发明干旱胁迫条件下SlWRKY81过表达拟南芥植株表型的照片，其中Col-0为对照植株，35S:SlWRKY81-L1和35S:SlWRKY81-L1为基因过表达植株的两个不同株系。

图5是本发明干旱胁迫条件下SlWRKY81沉默番茄植株气孔导度变化，其中TRV:TRV为对照植株，TRV:SlWRKY81为基因沉默植株。

图6是本发明干旱胁迫条件下SlWRKY81沉默番茄植株气孔长宽比变化的示意图，其中TRV:TRV为对照植株，TRV:SlWRKY81为基因沉默植株。

图7是本发明干旱胁迫条件下SlWRKY81沉默番茄植株气孔长宽比变化的照片，其中TRV:TRV为对照植株，TRV:SlWRKY81为基因沉默植株。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的描述。

实施例1，如图1、图2、图5、图6、图7所示，番茄SlWRKY81基因的用途，该基因的碱基序列为SEQTDNO：1所示，该基因用于培育耐旱性调节的植物；培育耐旱性调节植物包括培育具有气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向目标植物中导入番茄SlWRKY81基因进行抑制表达，得到SlWRKY81基因沉默转基因植株；2）将SlWRKY81基因沉默转基因植株与未处理的目标植物相比，得到气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植株；抑制表达通过病毒诱导的方式实现；目标植物为番茄。

病毒诱导包括如下几个步骤：1）构建含番茄SlWRKY81基因沉默载体的根癌农杆菌工程菌A；2）将所述根癌农杆菌工程菌A浸染目标植物子叶，制备得到SlWRKY81基因沉默植株；3）将所述SlWRKY81基因沉默植株进行干旱胁迫处理，观察植株气孔运动和耐旱表型。

侵染液配制：10mM氯化镁、10mMMES，pH=5.7，用时加150μM/L乙酰丁香酮。

侵染方法如下：

（1）将含有目的基因的农杆菌GV3101（根癌农杆菌工程菌A）划平板，36-48h出现单菌落；

（2）挑取单菌落于含有3mLYEB培养基的10mL管中摇菌，在28℃条件下200rpm摇菌36h；

（3）按1:100的比例将步骤（2）的菌液加入含有卡那霉素、利福平、庆大霉素3种抗生素的50mLYEB培养基中扩大培至OD₆₀₀=0.8-1.0（约12h）；

（4）4℃，4000g，离心10min，弃上清；

（5）预冷灭菌水20mL洗涤，4000g，4℃，10min离心，弃上清；

（6）重复步骤（5）一次；

（7）预冷侵染液溶解沉淀至OD₆₀₀=1.2；

（8）室温放置3h，pTRV1：pTRV2-HsfA1a=1:1混合侵染，pTRV1：pTRV2=1:1混合侵染作为对照；

（9）番茄幼苗两片子叶展平时，以注射法进行侵染。

侵染后的番茄置于22/19°C，16h/8h光周期，200μmolm^–2s^–1光强的人工气候室培养，得到番茄SlWRKY81基因沉默植株，同时制备pTRV空载体转染番茄植株以备对照，五叶一心时开始干旱处理。

干旱胁迫处理的步骤为：当SlWRKY81基因沉默植株及其空白对照，例如番茄，当番茄长至五叶一心时实验组和对照组同时浇水至饱和，之后对照组植株正常浇水，直至实验结束；实验组之后每隔1天ZigWSN记录仪测量一次相对土壤含水量（VWC）并根据失水量补充水分使沉默植株与pTRV空白对照之间相对土壤体积含水量（VWC）保持一致，直至处理结束，实验组整个干旱胁迫过程中控制相对土壤含水量从60%缓慢降低至5%左右，干旱胁迫时间为20天；番茄SlWRKY81基因沉默植株和对照干旱胁迫0、4、8、12天，采用光合仪（LI6400XT）测定气孔导度，CLSM观察气孔。实验结果见图5，图6。

由附图可知，SlWRKY81沉默植株其表达量仅为pTRV的20%左右，而其同源基因的表达与TRV:TRV相比无差异，表明沉默植株为SlWRKY81单基因沉默；干旱处理20天后，TRV:TRV植株严重委焉，而沉默植株TRV:SlWRKY81仅轻度委焉，说明沉默SlWRKY81后明显增强了番茄植株耐旱性。

实施例2，如图3、图4所示，番茄SlWRKY81基因的用途，该基因的碱基序列为SEQTDNO：1所示，该基因用于培育耐旱性调节的植物；培育耐旱性调节植物包括培育气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向模式植物中导入番茄SlWRKY81基因进行过表达，得到SlWRKY81基因过表达的转基因植株；2）将SlWRKY81基因过表达的转基因植株与未处理的模式植物相比，得到具有气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植株；过表达通过病毒诱导的方式实现；模式植物为拟南芥。

病毒诱导包括如下几个步骤：1）构建含番茄SlWRKY81基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌B；2）将所述根癌农杆菌工程菌B介导转化模式植物，制备得到SlWRKY81基因转基因植株；3）将所述SlWRKY81基因转基因植株进行干旱胁迫处理，观察植株气孔运动和耐旱表型。

构建SlWRKY81基因过表达拟南芥植株的步骤包括：

（1）农杆菌的培养

从转化后的平板上挑取单菌落接种至2ml的LB液体培养基中（含终浓度为50μg/mL^-1的Kan和Rif）中，28℃振荡培养过夜，分别进行PCR和酶切鉴定。

（2）拟南芥种植

取Columbia-0生态型的拟南芥种子，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于置于22/19°C，16h/8h光周期，200μmolm^–2s^–1光强的人工气候室培养；一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中，当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化，转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。

（3）抽滤法转化拟南芥及阳性苗筛选

1、接种含有表达载体的农杆菌克隆与5mlLB培养基(含终浓度为50μg/mL^-1的Kan和Rif)中，28℃，2000rpm，振荡过夜；

2、以1:100比例转接到100mlLB培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=1.2-1.6；

3、4000rpm，离心15min，收集菌体；

4、重悬于渗透缓冲液(5%蔗糖+终浓度0.02-0.03%SilwettL-77，振荡混匀)，调节OD600=0.8-1.0；

5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养；

6、约30日后收获种子；

7、用水将转基因种子置于培养基上，等到出现第一片真叶时，喷施Basta进行抗性筛选；

10、两周后，经Basta抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物黄化死亡死亡；

11、经过两代分离纯化，得到SlWRKY81基因的过表达拟南芥纯和植株。

干旱胁迫处理的步骤为：当SlWRKY81过表达转基因植株及其空白对照，例如未转基因的野生型拟南芥Columbia-0（Col-0），长至6周大小时，浇水至饱和，之后每隔2天测量一次各自的相对土壤含水量并根据失水量补充水分使SlWRKY81基因过表达植株与其空白对照之间土壤相对含水量保持一致，直至处理结束；干旱胁迫过程中控制土壤相对含水量从60%逐步降低至5%，处理时间12天；SlWRKY81基因过表达植株以野生型拟南芥Col-0为空白对照；干旱胁迫处理结束后，观察SlWRKY81基因过表达拟南芥植株及其空白对照的各项性能差别。

由附图可知，qRT-PCR结果表明，SlWRKY81过表达植株的两个株系（L1和L2）中SlWRKY81基因表达量显著高于对照；SlWRKY81过表达拟南芥株系35S:SlWRKY81-L1和35S:SlWRKY81-L2和野生型Col-0对照干旱处理后，35S:SlWRKY81-L1和35S:SlWRKY81-L2严重委焉，Col-0中度委焉，且在浇水后恢复明显，说明过表达SlWRKY81后显著降低了拟南芥植株耐旱性。

SEQUENCELISTING

<110>浙江省农业科学院

<120>番茄SlWRKY81基因的用途

<130>无

<140>

<160>1

<210>1

<211>1232

<212>DNA

<213>Solanumlycopersicum

<400>1

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Claims (8)

1.番茄SlWRKY81基因的用途，该基因的碱基序列为SEQTDNO：1所示，其特征在于，该基因用于培育耐旱性调节的植物。

2.根据权利要求1所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的培育耐旱性调节植物包括培育具有气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向目标植物中导入番茄SlWRKY81基因进行抑制表达，得到SlWRKY81基因沉默转基因植株；2）将SlWRKY81基因沉默转基因植株与未处理的目标植物相比，得到气孔对干旱敏感和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植株。

3.根据权利要求2所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的抑制表达通过病毒诱导的方式实现。

4.根据权利要求1所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的培育耐旱性调节植物包括培育气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物，包括如下步骤：1）向模式植物中导入番茄SlWRKY81基因进行过表达，得到SlWRKY81基因过表达的转基因植株；2）将SlWRKY81基因过表达的转基因植株与未处理的模式植物相比，得到具有气孔对干旱不敏感和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的过表达通过病毒诱导或者通过含有番茄SlWRKY81基因的重组表达载体导入模式植物中，所述的重组表达载体包括pFGC5941、pCAMBIA1300、pBI121。

6.根据权利要求2或4所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的转基因植株进行干旱胁迫处理，观察植株气孔状态和抗旱表型进行筛选。

7.根据权利要求2所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的目标植物为番茄。

8.根据权利要求4所述的番茄SlWRKY81基因的用途，其特征是，所述的模式植物为拟南芥。