CN103146704B - 马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明从克隆马铃薯pinⅡ基因启动子入手，通过对马铃薯pinⅡ基因启动子结构和序列的分析，验证了马铃薯pinⅡ基因启动子的功能。将本发明的启动子构建成GUS融合表达载体，转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有强启动子活性，为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。

Description

马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用。

背景技术

随着生命科学、基因组学、生物信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，转基因作物种植面积逐年增加。转基因作物中目的基因的表达强弱，很大程度上影响着转基因作物的应用。影响基因表达的因素有很多，主要有以下五方面：核酸的结构、转录强弱、转录后修饰、翻译效率和翻译后修饰，其中转录强弱起着重要作用。调控基因转录强弱的是启动子，因此开发强启动子对转基因作物的培育具有重要意义。

植物基因工程中常用的启动子按其作用方式和功能可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的。此类启动子的代表性启动子有烟草花叶病毒CaMV35S启动子、玉米泛素基因Ubiquitin启动子和水稻肌动蛋白基因Actin启动子。诱导型启动子在正常情况下不能启动基因的表达，但受某些物理、化学、生物信号的刺激后，此类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如拟南芥逆境诱导启动子rd29A。在组织特异性启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官和组织，并往往表现发育调节的特性，如烟草花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29。

抗病虫基因越来越多的应用于农作物，使作物产量得到了大幅度的提高。为了提高这些抗病虫基因在转基因作物中的表达，多是使用异源组成型强启动子调控表达，如CaMV35S。由于CaMV35S启动子来源于病毒，从生物安全角度考虑，其在一定程度上影响了转基因作物的推广。随着转基因技术的发展，多基因转化成为植物基因工程研究的新热点，亟待开发更多有效的启动子。因此直接从植物克隆高效表达的启动子具有重要的应用价值。

马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ（PINⅡ）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要存在于马铃薯、西红柿等茄科植物中。该蛋白编码基因表达具有多样性：在储藏器官如马铃薯块茎、西红柿果实中是组成型表达，而在叶片中是诱导表达，可响应多种理化诱导信号，如机械损伤、虫害、热刺激、电刺激、茉莉酸、乙烯、脱落酸、蔗糖、系统素等。马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的mRNA在损伤处理3-4小时后开始积累，9小时时达到峰值，然后逐渐下降；马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ蛋白在损伤处理4小时后即可检测到，并逐渐增加，可在最高值保持数天。马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ蛋白编码基因不仅在损伤部位诱导表达，而且可以在损伤部位的远端诱导表达。基于马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的表达特性，克隆研究该基因启动子具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高效启动活性的马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的马铃薯pinⅡ基因启动子，其核苷酸序列为：i）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或ii）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。

本发明还提供含有上述启动子的表达盒。

本发明还提供含有上述启动子的载体，所述载体为植物表达载体，例如植物双元表达载体等。

本发明还提供含有上述表达盒或载体的宿主细胞。

本发明还提供含有上述启动子的转化植物细胞。

本发明还提供马铃薯pinⅡ基因启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因。

本发明进一步提供马铃薯pinⅡ基因启动子在制备转基因植物中的应用。例如，可以将目的基因可操作地连接到马铃薯pinⅡ基因启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，将获得的重组表达载体通过比如，农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式转化植物，获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病、抗逆等基因，培育出抗虫、抗病、抗逆植物，提高植物抗虫、抗病和/或抗逆活性。本发明的启动子可用于制备本领域公知的转基因植物，用于控制外源或内源基因的表达，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，如烟草、拟南芥等。

本发明从克隆马铃薯pinⅡ基因启动子入手，通过对马铃薯pinⅡ基因启动子结构和序列的分析，验证了马铃薯pinⅡ基因启动子的功能。将本发明的启动子构建成GUS融合表达载体，转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有强启动子活性，为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件，也为下一步植物遗传改良和产业化研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中马铃薯pinⅡ启动子PCR扩增结果。

图2为本发明实施例2中载体pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS的构建流程示意图。

图3为本发明实施例4中转基因烟草幼苗染色分析结果。

图4为本发明实施例5中转基因烟草叶片和转基因拟南芥叶片GUS酶活定量分析结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1马铃薯pinⅡ基因启动子的克隆

根据登录号X04118在GenBank中查询马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因核酸序列。根据此核酸序列设计引物扩增马铃薯pinⅡ启动子片段。设计的引物为：正向引物5'-AACTGCAGCCCAATTCAAAGAACTTG-3'（SEQ ID No.2），5'端引入PstI酶切位点，反向引物5'–CGCGGATCCTTAATTAGTACTGCCTCT-3'（SEQ ID No.3），5'端引入BamHI酶切位点。以马铃薯基因组DNA为模板，PCR扩增pinⅡ启动子序列，得到928bp的PCR产物（图1）。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物连接到pGEM-T easy vector载体（Promega公司）上，并利用此载体上的T7和SP6引物对扩增片段进行测序，测序结果显示克隆正确，序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS表达载体的构建

用HindIII和EcoRI双酶切质粒pBI221（上海北诺生物科技有限公司），回收35S-GUS-NOS片段，连接到用HindIII和EcoRI双酶切的pCAMBIA1300（上海北诺生物科技有限公司）上，构建质粒pCAMBIA1300-221。将含有pinⅡ启动子片段的T载体用PstI和BamHI双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收928bp的片段。同时用Pst1和BamH1双酶切pCAMBIA1300-221载体，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收11kb片段。将回收的启动子片段和载体片段用T4DNA连接酶（Promega公司）连接，使马铃薯pinⅡ启动子取代pCAMBIA1300-221载体上驱动GUS基因表达的CaMV35S启动子，将该载体命名为pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS。载体构建流程示意图如图2所示。

实施例3pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS表达载体转化烟草和拟南芥

1.1pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS表达载体转化烟草

取200μL农杆菌LBA4404感受态细胞，加入lμg实施例2构建的质粒DNA，以pCAMBIA1300-221为阳性对照。液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，冰浴2分钟，然后加入l ml YEB培养基，28℃120rpm振荡培养4小时；4000rpm离心2分钟，弃上清，加入0.l ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

将含有植物表达载体的农杆菌菌液按1：100的体积比接种于含有100μg/mL卡那霉素、125μg/mL链霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8。4000rpm，室温离心10分钟，用MS盐溶液(pH5.8)重新悬浮菌体，使用时用MS盐溶液(pH5.8)稀释至OD600为0.2。

无菌烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.5cm×0.5cm的小块，在农杆菌菌液中浸泡10分钟；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转接入上铺一层滤纸的含有30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉的MS基本培养基上，24℃暗培养三天。然后将植物材料转移到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+50mg/L潮霉素+250μg/mL塞孢霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉)中。2周后用分化培养基继代一次。待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基中（MS+50mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉）。2周后小芽生根，即可驯化移栽，提取DNA进行PCR鉴定。获得转pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS和pCAMBIA1300-221载体的烟草各20余株。

1.2pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS表达载体转化拟南芥

取200μL农杆菌GV3101感受态细胞，加入lμg实施例2构建的质粒DNA，以pCAMBIA1300-221为阳性对照。液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，冰浴2分钟，然后加入l ml YEB培养基，28℃120rpm振荡培养4小时；4000rpm离心2分钟，弃上清，加入0.l ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

将200μL鉴定阳性的农杆菌菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上。28℃培养40小时，用涂布器刮取菌层至一小烧杯中，用40ml YEB液体培养基悬浮。4000rpm离心10分钟，弃上清。然后用YEB液体培养基重悬，稀释OD600为0.8-1.0，用花序浸染法转化拟南芥。将收取的T0代转基因植株的种子铺于含20mg/L潮霉素、30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉的MS培养基上，存活下来的苗为转基因阳性苗，提取DNA进行PCR鉴定。获得转pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS和pCAMBIA1300-221载体的拟南芥各20余株。

实施例4转基因烟草的GUS组织化学染色

转基因烟草T1代种子灭菌后铺在含有30mg/L潮霉素、30g/L蔗糖和8g/L琼脂粉的MS培养基上萌发筛选，去掉非转基因植株。两周后将成活幼苗浸入GUS染色液（0.5mg/mL X-Gluc、75mM磷酸钠缓冲液，pH7.0、50μM铁氰化钾、50μM亚铁氰化钾、10mMNa·EDTA、20%甲醇、0.1%Trition X-100）中,37℃保温过夜。然后用70%乙醇脱色，直至脱去所有叶绿素。染色结果表明：与对照CaMV35S启动子相比，本发明的马铃薯pinⅡ基因启动子能更强地驱动GUS基因的表达。图3为分别转pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS和pCAMBIA1300-221载体烟草的GUS组织化学染色结果。

实施例5转基因烟草和拟南芥的GUS酶活测定

取转基因烟草6周的幼嫩叶片和转基因拟南芥4周的幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，加入GUS蛋白提取缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液，pH7.0、10mM Na·EDTA、0.1%Triton X-100、10mMβ-巯基乙醇）混匀。4℃13000rpm离心10分钟，取上清用于GUS酶活分析。GUS酶活高低用GUS蛋白粗提液催化底物4-甲基伞形酮-β-D-葡糖醛酸苷（4-MUG）生成产物四甲基伞形酮(4-MU)的量进行测定。用多功能酶标仪Varioskan Flash（Thermo公司）测定荧光值，用Bio-Rad生产的酶标仪Model680以考马斯亮蓝法测定GUS蛋白粗提液中总蛋白含量。测定结果显示：与对照CaMV35S启动子相比，本发明的马铃薯pinⅡ基因启动子具有更强的活性（图4）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.含有马铃薯pinⅡ基因启动子的载体，其特征在于，其为表达载体pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS，构建方法如下：

用HindIII和EcoRI双酶切质粒pBI221，回收35S-GUS-NOS片段，连接到用HindIII和EcoRI双酶切的pCAMBIA1300上，构建质粒pCAMBIA1300-221；将含有马铃薯pinⅡ基因启动子片段的T载体用PstI和BamHI双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收928bp的片段；同时用Pst1和BamH1双酶切pCAMBIA1300-221载体，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，回收11kb片段；将回收的启动子片段和载体片段用T4DNA连接酶连接，使马铃薯pinⅡ基因启动子取代pCAMBIA1300-221载体上驱动GUS基因表达的CaMV35S启动子，将该载体命名为pCAMBIA1300-pinⅡ-GUS；

其中，马铃薯pinⅡ基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。