CN102399779B

CN102399779B - 一种玉米wip1基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN102399779B
Application number: CN201110329378.2A
Authority: CN
Inventors: 王国英; 刘允军; 张生学; 练云
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-10-26
Also published as: CN102399779A

Abstract

本发明涉及一种玉米wip1基因启动子及其应用，该启动子为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的DNA片段或SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，由1)衍生的具有启动基因表达的DNA功能片段。转化烟草和拟南芥试验结果表明，本发明的启动子可以启动GUS基因的表达，具备启动子活性，可应用于玉米、水稻等作物的遗传改良和产业化研究。

Description

一种玉米wip1基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种玉米wip1基因启动子及其应用。

背景技术

植物启动子控制植物基因的表达。外源基因在转基因植物中的表达强度也取决于外源基因前面的启动子强度。启动子可分为组成型、诱导型和组织特异启动子。组成型启动子可以使基因在植物中的所有部位和不同发育阶段都表达。目前应用最为广泛的此类启动子包括：来自烟草花叶病毒的355启动子、玉米泛素基因的Ubiquitin启动子、水稻肌动蛋白基因的Actin启动子。组织特异启动子使目的基因仅在植物特定的器官或组织表达，如玉米Zm13启动子使目的基因仅在花粉中表达(Hanson DD et al.，1989)。诱导型启动子在信号刺激下而具有转录活性。RD29A启动子能够驱动目的基因在干旱等胁迫条件下的表达，广泛应用于抗逆植物基因工程(Yamaguchi-Shinozaki，K.&Shinozaki，K.，1993).随着抗病虫基因越来越多的应用于农作物，使得作物产量得到了大幅度的提高。为了提高这些抗病虫基因在转基因作物中的表达，多是使用异源组成型启动子调控表达，比如CaMV35S，因此直接从禾谷类作物克隆高效表达的启动子具有重要的应用价值。

目前自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂又可分为Kunitz、Bowman-Birk、PI-I和PI-II四个家族。Bowman-Birk族的独特分子特征是其分子中有两个独立的结合位点。玉米的一个基因wip1(wound-induced protein)是从玉米胚芽鞘cDNA的差显库里筛选得到的一个基因，受伤诱导表达，同各种Bowman-Birk族蛋白有30％的同源性(Rohrmeier T and Lehle L，1993)。该基因在创伤诱导15min时开始表达，60min表达达到顶峰，不受3，5-D，ABA，BAP，IAA和methyl jasmonate胁迫诱导，在胚芽鞘中试验，发现受伤之后，信号从受伤处向上传递(Eckelkamp C etal.，1993)。

目前在植物基因工程中所用的、能较强地启动基因转录的启动子主要局限于花椰菜花叶病毒35S启动子、水稻actin启动子和玉米ubiquitin启动子。进行多基因转化时使用相同的启动子容易产生基因沉默。需要发掘更多的具有强活性的启动子，以进行植物遗传操作。而发掘植物源性的启动子，特别是亲缘关系较近的启动子，在植物体内启动基因表达直至产生基因产物就显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有高效启动活性的玉米wip1基因启动子Zmpwip1及其应用。

本发明启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，序列全长1442bp。根据植物顺式调控元件数据库(PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含有多个TATA box、W box和GCC box。

本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非应答元件或作用元件，替换一个或几个碱基。本领域技术人员还可以根据SEQ ID No.1的序列获得启动基因表达的DNA功能片段。因此，本发明所述的启动子还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，如将SEQ IDNo.1所示的序列的5’端缺失掉约200bp，而衍生的具有控制基因表达的DNA功能片段。

本领域技术人员可以理解的是，本发明的启动子还包括由SEQID No.1产生的具有相同功能的DNA片段。所述的具有相同功能的DNA片段核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的同源性至少大于90％、甚至95％、甚至98％的衍生的具有启动子基本元件，能启动基因表达的DNA片段。

在本发明的一个实施方案中，将SEQ ID No.1所示的序列分别进行5’端的115bp、211bp或511bp的缺失，而获得具有启动子功能的衍生出的启动子。

本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建表达载体。此外还可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述表达载体或表达盒的表达载体或重组载体。

本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病等基因，培育出抗虫、抗病植物，提高植物抗虫和/或抗病活性。本发明的启动子可用于制备本领域公知的转基因植物，用于控制外源或内源基因的表达，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，优选的植物为单子叶植物，更优选为玉米、水稻、小麦、高粱等单子叶植物，最优选为玉米。

将本发明的各个启动子构建成GUS融合表达载体，并转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性的测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有启动子活性。

附图说明

图1为玉米wip1启动子的PCR扩增。

图2为含玉米wip1启动子表达载体构建图。

图3为ZmWip1启动子缺失片段示意图。

图4为生长4周的转基因拟南芥叶片GUS染色分析结果。

图5为生长4周的转基因拟南芥中的GUS活性的定量分析结果。

图6为生长4周的转基因烟草GUS染色分析结果

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1玉米wip1启动子克隆及序列分析

将GenBank登录的Zmwip1基因的序列(登录号：X71396)在maizesequence网站上进行比对分析，得到包含此基因序列的Bac序列AC206573。根据此Bac序列设计引物扩增Zmwip1的启动子序列。设计引物为：正向引物5′ATCTGCAGGGCTCCGTTCTACTTGACT 3′(SEQ ID No.3)，5′端引入PstI酶切位点，反向引物5′TGGATCCGGTCTCGGACGAGCTGTTCTT3′(SEQ ID No.4)，5′端引入BamH1酶切位点。通过PCR扩增从玉米自交系综31的基因组DNA上扩增Zmwip1基因的启动子序列，得到1737bp PCR产物(图1)，测序后的序列如SEQ ID No.2所示。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

将扩增得到的PCR产物连接到Promega公司生产的pGEM-Teasy vector载体上，并利用此载体上的T7和SP6引物对基因进行测序，测序结果显示克隆正确。

实施例2wip启动子片段缺失及载体构建

1、引物设计

根据扩增得到的长度为1737bp的Zmwip1基因的上游序列，设计不同引物扩增得到不同长度的启动子片段。其中下游引物5′TGGATCCTTCCTCGTGATCATTTCCG 3′(SEQ ID No.5)和上游引物5′GCTGCAGCCTTACATAGTGGTTGGT 3′(SEQ ID No.6)扩增1442bp启动子序列，和上游引物5′GCTGCAGGGCGTCCATTTGTATCTC 3′(SEQ ID No.7)扩增1327bp启动子序列，和上游引物5′GCTGCAGTTTGTTTTGGATTATAATCTCTTC 3′(SEQ ID No.8)扩增1231bp 启动子序列，和上游引物5′GCTGCAGCGCGTCGCCGTCTCTTACTGT 3′(SEQ ID No.9)扩增931bp启动子序列。将扩增得到的PCR产物连接到Promega公司生产的pGEM-T easy vector载体上，并利用此载体上的T7和SP6引物对基因进行测序。

2、PCR反应程序和条件

PCR反应体系：

PCR反应程序：

3、载体连接

用HindIII和EcoRI酶切质粒pBI121收35S-GUS-NOS片段，连接到用HindIII和EcoRI酶切的pCAMBIA1300上，构建质粒pCAMBIA1300-121。wip启动子序列5’端含有Pst1酶切位点，3’端含有BamH1酶切位点。将含有这些启动子片段的T载体用PstI和BamHI进行酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，分别回收1737、1442、1327、1231、931bp的片段。同样用Pst1和BamH1酶切pCAMBIA1300-121载体，电泳并回收11kb片段。将回收的启动子片段和载体片段分别用T4DNA连接酶连接，使玉米wip1启动子取代该载体上的CaMV35S启动子，命名这些载体为p1300-1737-GUS、p1300-1442-GUS、p1300-1327-GUS、p1300-1231-GUS、p1300-931-GUS。载体构建策略见图2，启动子片段缺失示意图见图3。

实施例3转基因烟草和拟南芥的获得

1、表达载体转化烟草

取200μl农杆菌LBA4404感受态细胞，加入1μg实施例2构建的各个质粒DNA，以pCAMBIA1300-121为阳性对照。液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30秒，弃上清，加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/ml卡那霉素和125μg/ml链霉素的YEB平板上，28℃培养约48小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。

将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100μg/ml卡那霉素和125μg/ml链霉素)中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。4000rpm，室温离心10分钟，用MS盐溶液(PH7.0)重新悬浮菌体，使用时采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。

无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，在农杆菌菌液中浸泡10分钟；用滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28℃暗培养三天后。将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10mg/L潮霉素+250μg/ml塞孢霉素)。待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基中(MS基本培养基+10mg/l潮霉素)。

2、表达载体转化拟南芥

农杆菌在固体YEB平板上培养2-3天后，用涂布器刮取菌层至一小烧瓶中，用30ml YEB液体重悬。重悬后的菌液OD值为2.0左右。

另外准备120ml含有0.03％Silwet L-77的浓度为5％的蔗糖溶液。将以上两种溶液混合得到每次转化所用的转化液。将装着拟南芥的小花托倾斜，使拟南芥植株的花序能够完全浸泡在农杆菌转化液中30秒。将植株套入一个塑料PE手套中，然后将花托平放，并在苗子上盖一个盖子，使苗子避光水平放置16-24小时后置于光下正常培养。将收取的T₀代转基因植株的种子铺于含10mg/l潮霉素的MS培养基上，存活下来的苗为转基因阳性苗，提取DNA进行PCR鉴定。

拟南芥和烟草每个载体至少获得10个以上的独立转化事件，通过GUS组织化学染色表明，与阳性对照含有35s启动子的质粒相同，本发明的构建的含有wip1的启动子的各个5’端缺失片段的质粒也都能在烟草或拟南芥体内有效表达出GUS蛋白，表明这些个启动子均具有活性，而全长的1737bp的启动子不具有启动子活性。图4所示为含有wip1的各个启动子片段的拟南芥的GUS组织化学染色结果。图6所示为1231bp和1737bp的wip1启动子片段的烟草GUS组织化学染色结果。

3、转基因拟南芥的GUS活性分析

将T₁代拟南芥叶片在液氮中研磨成粉末，加入提取缓冲液(10mM EDTA，0.1％SDS，50mM磷酸钠，0.1％Triton X-100，10mM β-巯基乙醇，25μg/ml PMSF，pH 8.0)混匀，15000rpm离心10分钟，取上清用于GUS酶活分析。上清与底物MUG反应，用荧光分光光度计测定反应物的荧光强度，通过公式计算出酶活力。结果显示，wip1启动子的各个5’端缺失片段均可以检测到GUS蛋白，且1442bp的片段启动活性最强。(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种玉米wip1基因启动子，其为：SEQ ID No.1所示的核苷酸组成的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，其为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列5’端缺失115bp、211bp或511bp所衍生的DNA片段。

3.含有权利要求1或2所述启动子的表达盒。

4.含有权利要求1或2所述启动子的植物表达载体。

5.权利要求1或2所述的启动子在制备转基因植物中的应用。