CN109402167A - 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法 - Google Patents

一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109402167A
CN109402167A CN201811496734.8A CN201811496734A CN109402167A CN 109402167 A CN109402167 A CN 109402167A CN 201811496734 A CN201811496734 A CN 201811496734A CN 109402167 A CN109402167 A CN 109402167A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hypocotyl
chinese pine
gene
transient expression
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811496734.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马晶晶
钮世辉
李悦
李伟
刘双委
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN201811496734.8A priority Critical patent/CN109402167A/zh
Publication of CN109402167A publication Critical patent/CN109402167A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种在油松下胚轴中实现基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：1)油松下胚轴的预处理；2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养和处理；3)将下胚轴组织浸泡于导入了35S:Gus基因序列的农杆菌侵染溶液；4)超声波处理组织实现基因转入；5)下胚轴组织侵染后的继续培养。本发明建立的基因瞬时表达方法能够较高效地实现基因在油松下胚轴中表达，操作简单且结果可靠，可为油松基因功能验证和调控关系研究提供技术支持。

Description

一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体地说，涉及一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法。
背景技术
近年来，植物分子生物学研究不断深入，越来越多基因的功能被解析，各种作用机制也被深入探索，其中，由农杆菌介导的基因异源表达实验应用十分广泛。在传统农杆菌转染植物使得基因稳定表达的实验中，外源T-DNA整合到被转染植物的基因组中，并在第十到十四天表达量升高，并且这种表达量增高跟整合了T-DNA的植物细胞的增殖相关。然而，通过稳定的基因表达，转基因植物的产生需要大批量实验材料的繁殖且十分耗时。另外，由插入位置或其他因素引起的可变转基因表达也增大了数据分析的复杂性。
基因瞬时表达可以有效地研究基因表达的蛋白质在组织中的定位、功能以及病原体和宿主或非宿主之间的相互作用。瞬时表达后，目标基因的表型可以在几个小时或者几天内观察到，十分高效。一般在2-4天内表达量达到高峰随后会由于转化的细胞代谢而下降。
基因瞬时表达可以通过很多种方法实现：原生质体电击(分离原生质体不易)、基因枪(需要表达量特别高且不同实验室和样本差异很大)、农杆菌介导的结合、病毒载体介导的插入(会被植物样本免疫且插入片段大小有限制)和显微注射(基因沉默率很高)。而农杆菌介导的基因瞬时表达没有其他方式的限制，并且农杆菌会感染无数个组织的细胞，这使得转化效率得到极大的提高。
近年来，包括烟草、拟南芥、小麦、水稻等在内的许多被子植物的器官或组织，包括叶子、花、针、树皮、茎或根，都成功地通过农杆菌介导的进行基因转化。基因瞬时表达在被子植物中的广泛应用表明在植物中进行由农杆菌介导的瞬时转变是被科学研究人员所接受的。然而，在诸如油松等裸子植物组织中，还未对瞬时表达进行深入研究与应用。
油松作为我国特有的乡土树种，其耐干旱、耐瘠薄的特点也使其成为北方主要的造林和用材树种。目前，在油松传统育种和种质选优方面已经开展了许多研究，但其功能基因鉴定、遗传机制解析等方面还亟待深入研究。
发明内容
有鉴于此，本发明针对提供了一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：
1)油松下胚轴的预处理；
2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养；
3)制备侵染溶液；
4)将1)中得到的下胚轴组织浸没于3)中得到的包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中，使用的农杆菌转入了35S:Gus基因；
5)用超声波处理4)中的溶液，将Gus基因转入下胚轴细胞；
6)下胚轴组织侵染后再培养，实现Gus基因的瞬时过量表达。
可选地，步骤1)中油松下胚轴的预处理具体为选取种子进行萌发1周，将子叶还未完全展开时的油松幼苗6-10株捆成一捆，垂直横切成1-2cm的片段，并用无菌水冲洗2-3次。
可选地，步骤2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养具体为：将目标基因构建到含有35S启动子的植物双元表达载体PBI121上，将重组质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞，在含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB固体培养基中培养2天后，挑取阳性单克隆菌株，PCR检验后移入含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB培养基中，28℃，200rpm过夜培养后，扩大培养体系到400ml，培养至OD600＝1.0-1.2，然后在室温5000g，10分钟离心待用。
可选地，步骤3)制备侵染溶液具体为：
3.1)渗透液的制备：10mM MES，100μM乙酰丁香酮，10mM MgCl2，0.005％Tween20，并将pH调成5.6；
3.2)侵染溶液的制备：在离心后的农杆菌中加入3.1)中得到的渗透液，悬浮后再离心清洗2次，然后再重新悬浮到渗透液中，OD600＝1，在室温中放置3小时，得到侵染溶液，待用。
可选地，步骤4)和5)中将含有Gus基因的农杆菌渗入下胚轴组织的过程需要50分钟。
可选地，步骤6)中下胚轴组织侵染后再培养，实现Gus基因的瞬时过量表达具体为将侵染后的下胚轴组织用无菌水冲洗1次，放到有2层湿润滤纸的培养皿中，在黑暗中放置16小时，然后转入23℃，相对湿度80-85％，16小时光照，8小时黑暗条件继续培养2-4天后进行Gus染色检测。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明通过农杆菌介导超声波辅助的侵染方式使基因在油松下胚轴组织中过量表达，可以用于基因功能研究和调控机制探索。
2)本发明建立的基因瞬时表达方法适用于油松下胚轴组织，操作简单、转化效率可达80％以上，且转化部位为下胚轴两端2-3mm，方便取样进行后期实验，可为油松基因功能验证和调控关系研究提供技术支持。
3)本发明以农杆菌介导，辅助超声波实现基因在油松下胚轴组织中高效瞬时表达，这种方法将进一步应用于其他裸子植物。另外，这种方法也将实现编码基因与绿色荧光蛋白融合到植物组织，这将方便探索蛋白质亚细胞定位和基因之间的相互作用等。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明目标基因构建到含有35S启动子的植物双元表达载体PBI121上的示意图；
图2是本发明Gus基因在油松下胚轴瞬时表达后经Gus染色的组织外观，其中，A、B、C、D、E、F均为经Gus染色的油松下胚轴；
图3是本发明Gus基因在油松下胚轴瞬时表达后的显微结构，
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法：
1)油松下胚轴的预处理：
选取种子萌发后1周，子叶还未完全展开时的油松幼苗6-10株捆成一捆，垂直横切成1-2cm的片段，并用无菌水冲洗2-3次。
2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养：
将目标基因构建到含有35S启动子的植物双元表达载体PBI121上，将重组质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞(载体结构示意图如图1所示)，在含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB固体培养基中培养2天后，挑取阳性单克隆菌株，PCR检验后移入含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB培养基中，28℃，200rpm过夜培养后，扩大培养体系到400ml，培养至OD600＝1.0-1.2，然后在室温5000g，10分钟离心待用。
3)制备侵染溶液：
在离心后的农杆菌中加入渗透液(10mM MES，100μM乙酰丁香酮，10mM MgCl2，0.005％Tween 20，pH＝5.6)，悬浮后再离心清洗2次，然后再重新悬浮到渗透液中(OD600＝1)，在室温中放置3小时，得到侵染溶液，待用。
其中，MES是一种酸性的缓冲溶液，能够提供一个瞬时表达的稳定环境维持渗透压和pH的稳定。“弱碱及其共轭酸”所组成，当溶液中加入少量酸性物质时，缓冲对中的碱性组分子与之反应中和，当溶液中加入少量碱性物质时，缓冲对中的酸性组分与之反应中和，即同离子效应。乙酰丁香酮可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合。所以最好让其有一定的诱导时间再转化，效果要好，而不是加完直接使用。所以本发明配制好的渗透液要静置3小时后再进行转化。若静置时间不足会导致农杆菌未完全活化而降低转化效率，若静置时间过长，农杆菌在弱酸性环境时间过长导致部分失活使转化效率降低。酸性条件下更有利于乙酰丁香酮发挥作用，所以要控制渗透液的pH值为5.6，这样即保障了乙酰丁香酮发挥作用又不容易损伤植物组织。pH过低容易损伤下胚轴两端组织使基因无法表达，而pH过高关键试剂乙酰丁香酮不能发挥作用，使转化效率降低。
为了实现目标基因转入，本发明在室温下，用频率为100Hz的超声波处理侵染液20分钟，让含有目标基因的侵染液能够进入下胚轴组织。若超声波处理时间过长会使植物组织细胞过于松散，后续培养时容易发生腐烂现象，若超声波处理时间过短，含有目标基因的侵染液不能很好地渗透进下胚轴组织使得转化效率降低。
4)将目标基因转入下胚轴组织：
将处理后的下胚轴组织浸没于包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中，每10分钟摇晃一次，一共浸泡30分钟。
5)超声波处理实现目标基因转入：
在室温下，用频率为100Hz的超声波处理侵染液20分钟，让含有目标基因的侵染液能够进入下胚轴组织。
6)下胚轴组织侵染后再培养，实现Gus基因(如SEQ ID NO.1所示)的瞬时过量表达：
将侵染后的下胚轴组织用无菌水冲洗1次，放到有2层湿润滤纸的培养皿中，在黑暗中放置16小时，然后转入23℃，相对湿度80-85％，16小时光照，8小时黑暗条件继续培养2-4天后进行Gus染色检测。
本发明建立的基因瞬时表达方法适用于油松下胚轴组织，操作简单、转化效率可达80％以上，且转化部位为下胚轴两端2-3mm，方便取样进行后期实验，可为油松基因功能验证和调控关系研究提供技术支持。
如图2所示，下胚轴上下两端均有着色，着色部位清晰可辨，表明Gus基因在油松下胚轴两端成功转录并翻译了表达蛋白且转化效率可观，这也说明本发明能够实现基因在油松下胚轴的瞬时表达且基因的转化和表达效果较理想；如图3所示，可见染色部位着色深，且着色部位清晰，染色效果理想。图2和图3说明本发明利用Gus报告基因作为示范例能够使Gus基因在油松下胚轴瞬时表达且效果理想。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 985
<212> DNA
<213> β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase)
<400> 1
cgtgccgtgg cgcggaatcc tctgttgctg agccagagag gcttaccggt ttccaggaga 60
gcaggatccg tcaggtacag gagtttctcc gtgcgcgctg tcgccggcaa cgagaccaac 120
gccgtctcca ggttggagca tctgctcaac ctcgatgtct ccccctacac agacaagatc 180
atcgcagagt acatctggat tggcggatca gggattgacg tacgcagcaa agcaaggacg 240
atctccaaac ctgtggagca cccctccgag ctcccgaagt ggaactacga tggatcgagc 300
actggacaag ctcccggaga agacagcgaa gtcatcctct acccgcaagc aattttcaaa 360
gatcctttcc gaggggggaa ccacatcctg gttatgtgcg actcgtacca accaaacgga 420
gagcccatcc ccaccaataa gcgccacagg gccgctcaga tcttcagtga tcctaaggtt 480
gcagctgaag tcccatggtt tggtattgag caagagtaca ccttgcttca gccaaatgtg 540
aagtggcctc ttggctggcc tgttggaggt taccctggac ctcagggacc ctactattgc 600
tcagctggtg ccgacaagtc ctttgggcgc gatatttccg acgcccatta caaggcttgc 660
ctgtatgctg ggattaacat aagtggggtg aatgctgaag ttatgcccgg tcagtgggag 720
tatcaagtgg gcccaagcgt tggaattgat gggggggatc atatctgggt ctcgagatac 780
atcctggaga gaatcaccga gcaggctggc gtcgtgcttt cgcttgaccc taaaccgatt 840
gagggcgact ggaatggtgc tgggtgccac actaactaca gcacgaagtc gatgagagag 900
gatggaggat ttgaggtcat caagaaggct atcgtcaacc tctcacttcg ccacagggag 960
cacatcagcg catatggaga gggaa 985
<210> 2
<211> 14758
<212> DNA
<213> 植物双元表达载体(PBI121)
<400> 2
tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtactt caccagctcc 60
gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct tggcaatcac gcgcaccccc 120
cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc gggcggacca cgcccatcat 180
gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc agcagggcga ggatcgtggc 240
atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag agtttcagca ggccgcccag 300
gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc 360
cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc 420
cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg 480
gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc 540
ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata 600
agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct acttcaccta tcctgcccgg 660
ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata 720
tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata atgaccccga agcagggtta 780
tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 840
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 900
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 960
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1020
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1080
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1140
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag agaggccgag cgcggccgtg 1200
aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc gggctgctac gggcgtctga 1260
cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct gctgtagtga gtgggttgcg 1320
ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt ccttcaacgt tcctgacaac 1380
gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt ccctgctcga acgctgcgtc 1440
cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac agcggcgaga gcggagcctg 1500
ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg gcctgctcct caagcacggc 1560
cccaacagtg aagtagctga ttgtcatcag cgcattgacg gcgtccccgg ccgaaaaacc 1620
cgcctcgcag aggaagcgaa gctgcgcgtc ggccgtttcc atctgcggtg cgcccggtcg 1680
cgtgccggca tggatgcgcg cgccatcgcg gtaggcgagc agcgcctgcc tgaagctgcg 1740
ggcattcccg atcagaaatg agcgccagtc gtcgtcggct ctcggcaccg aatgcgtatg 1800
attctccgcc agcatggctt cggccagtgc gtcgagcagc gcccgcttgt tcctgaagtg 1860
ccagtaaagc gccggctgct gaacccccaa ccgttccgcc agtttgcgtg tcgtcagacc 1920
gtctacgccg acctcgttca acaggtccag ggcggcacgg atcactgtat tcggctgcaa 1980
ctttgtcatg cttgacactt tatcactgat aaacataata tgtccaccaa cttatcagtg 2040
ataaagaatc cgcgcgttca atcggaccag cggaggctgg tccggaggcc agacgtgaaa 2100
cccaacatac ccctgatcgt aattctgagc actgtcgcgc tcgacgctgt cggcatcggc 2160
ctgattatgc cggtgctgcc gggcctcctg cgcgatctgg ttcactcgaa cgacgtcacc 2220
gcccactatg gcattctgct ggcgctgtat gcgttggtgc aatttgcctg cgcacctgtg 2280
ctgggcgcgc tgtcggatcg tttcgggcgg cggccaatct tgctcgtctc gctggccggc 2340
gccagatctg gggaaccctg tggttggcat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct 2400
tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct taggtttacc 2460
cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga 2520
tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc gggacaagcc 2580
gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga gccactcagc cgcgggtttc 2640
tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta ttgcgcgttc aaaagtcgcc 2700
taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat gctccactga cgttccataa 2760
attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc aatccaaata atctgcaccg 2820
gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 2880
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2940
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 3000
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 3060
ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 3120
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 3180
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3240
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 3300
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 3360
aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 3420
atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 3480
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 3540
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 3600
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 3660
ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 3720
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 3780
catgctggag ttcttcgccc acgggatctc tgcggaacag gcggtcgaag gtgccgatat 3840
cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc ctgagcgaca atatgatcgg 3900
gcccggcgtc cacatcaacg gcgtcggcgg cgactgccca ggcaagaccg agatgcaccg 3960
cgatatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggatgatccc 4020
cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4080
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4140
catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 4200
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4260
tatgttacta gatcgggcct cctgtcaatg ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg 4320
gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggc tctgagggag 4380
gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta 4440
ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca 4500
aacttgattc tgtcgctact gattacggtg ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt 4560
ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg 4620
ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt 4680
ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt ttgtctttgg cccaatacgc aaaccgcctc 4740
tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 4800
cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 4860
tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 4920
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc cccagattag 4980
ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 5040
tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc ttcccaagaa 5100
ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 5160
atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc 5220
aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 5280
ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 5340
catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 5400
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 5460
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 5520
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 5580
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 5640
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 5700
ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 5760
agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga 5820
ggatccccgg gtggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc 5880
aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattgatcag 5940
cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac 6000
gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa 6060
gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact 6120
cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg 6180
ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt 6240
tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa 6300
aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc 6360
agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat 6420
gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc 6480
agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg 6540
actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg 6600
tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg 6660
tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc 6720
tttggtcgtc atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg 6780
cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct 6840
tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact 6900
gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa 6960
gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt 7020
aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac 7080
gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg 7140
cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac 7200
accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat 7260
gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg 7320
caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg 7380
ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg 7440
tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc 7500
gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact 7560
cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac 7620
ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca 7680
tcgtcggcta cagcctcggg aattgctacc gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat 7740
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata 7800
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat 7860
gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa 7920
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg 7980
ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 8040
ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 8100
ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcgc ccgctccttt cgctttcttc 8160
ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 8220
ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat 8280
ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc 8340
acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc 8400
tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa caggattttc 8460
gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 8520
agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccacccca gtacattaaa 8580
aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc 8640
ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat 8700
acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact 8760
ttgctcatgt taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg tttgaaacac 8820
ggatgatctc gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt gctgcctgtg 8880
atcaaatatc atctccctcg cagagatccg aattatcagc cttcttattc atttctcgct 8940
taaccgtgac aggctgtcga tcttgagaac tatgccgaca taataggaaa tcgctggata 9000
aagccgctga ggaagctgag tggcgctatt tctttagaag tgaacgttga cgatatcaac 9060
tcccctatcc attgctcacc gaatggtaca ggtcggggac ccgaagttcc gactgtcggc 9120
ctgatgcatc cccggctgat cgaccccaga tctggggctg agaaagccca gtaaggaaac 9180
aactgtaggt tcgagtcgcg agatcccccg gaaccaaagg aagtaggtta aacccgctcc 9240
gatcaggccg agccacgcca ggccgagaac attggttcct gtaggcatcg ggattggcgg 9300
atcaaacact aaagctactg gaacgagcag aagtcctccg gccgccagtt gccaggcggt 9360
aaaggtgagc agaggcacgg gaggttgcca cttgcgggtc agcacggttc cgaacgccat 9420
ggaaaccgcc cccgccaggc ccgctgcgac gccgacagga tctagcgctg cgtttggtgt 9480
caacaccaac agcgccacgc ccgcagttcc gcaaatagcc cccaggaccg ccatcaatcg 9540
tatcgggcta cctagcagag cggcagagat gaacacgacc atcagcggct gcacagcgcc 9600
taccgtcgcc gcgaccccgc ccggcaggcg gtagaccgaa ataaacaaca agctccagaa 9660
tagcgaaata ttaagtgcgc cgaggatgaa gatgcgcatc caccagattc ccgttggaat 9720
ctgtcggacg atcatcacga gcaataaacc cgccggcaac gcccgcagca gcataccggc 9780
gacccctcgg cctcgctgtt cgggctccac gaaaacgccg gacagatgcg ccttgtgagc 9840
gtccttgggg ccgtcctcct gtttgaagac cgacagccca atgatctcgc cgtcgatgta 9900
ggcgccgaat gccacggcat ctcgcaaccg ttcagcgaac gcctccatgg gctttttctc 9960
ctcgtgctcg taaacggacc cgaacatctc tggagctttc ttcagggccg acaatcggat 10020
ctcgcggaaa tcctgcacgt cggccgctcc aagccgtcga atctgagcct taatcacaat 10080
tgtcaatttt aatcctctgt ttatcggcag ttcgtagagc gcgccgtgcg tcccgagcga 10140
tactgagcga agcaagtgcg tcgagcagtg cccgcttgtt cctgaaatgc cagtaaagcg 10200
ctggctgctg aacccccagc cggaactgac cccacaaggc cctagcgttt gcaatgcacc 10260
aggtcatcat tgacccaggc gtgttccacc aggccgctgc ctcgcaactc ttcgcaggct 10320
tcgccgacct gctcgcgcca cttcttcacg cgggtggaat ccgatccgca catgaggcgg 10380
aaggtttcca gcttgagcgg gtacggctcc cggtgcgagc tgaaatagtc gaacatccgt 10440
cgggccgtcg gcgacagctt gcggtacttc tcccatatga atttcgtgta gtggtcgcca 10500
gcaaacagca cgacgatttc ctcgtcgatc aggacctggc aacgggacgt tttcttgcca 10560
cggtccagga cgcggaagcg gtgcagcagc gacaccgatt ccaggtgccc aacgcggtcg 10620
gacgtgaagc ccatcgccgt cgcctgtagg cgcgacaggc attcctcggc cttcgtgtaa 10680
taccggccat tgatcgacca gcccaggtcc tggcaaagct cgtagaacgt gaaggtgatc 10740
ggctcgccga taggggtgcg cttcgcgtac tccaacacct gctgccacac cagttcgtca 10800
tcgtcggccc gcagctcgac gccggtgtag gtgatcttca cgtccttgtt gacgtggaaa 10860
atgaccttgt tttgcagcgc ctcgcgcggg attttcttgt tgcgcgtggt gaacagggca 10920
gagcgggccg tgtcgtttgg catcgctcgc atcgtgtccg gccacggcgc aatatcgaac 10980
aaggaaagct gcatttcctt gatctgctgc ttcgtgtgtt tcagcaacgc ggcctgcttg 11040
gcctcgctga cctgttttgc caggtcctcg ccggcggttt ttcgcttctt ggtcgtcata 11100
gttcctcgcg tgtcgatggt catcgacttc gccaaacctg ccgcctcctg ttcgagacga 11160
cgcgaacgct ccacggcggc cgatggcgcg ggcagggcag ggggagccag ttgcacgctg 11220
tcgcgctcga tcttggccgt agcttgctgg accatcgagc cgacggactg gaaggtttcg 11280
cggggcgcac gcatgacggt gcggcttgcg atggtttcgg catcctcggc ggaaaacccc 11340
gcgtcgatca gttcttgcct gtatgccttc cggtcaaacg tccgattcat tcaccctcct 11400
tgcgggattg ccccgactca cgccggggca atgtgccctt attcctgatt tgacccgcct 11460
ggtgccttgg tgtccagata atccacctta tcggcaatga agtcggtccc gtagaccgtc 11520
tggccgtcct tctcgtactt ggtattccga atcttgccct gcacgaatac cagcgacccc 11580
ttgcccaaat acttgccgtg ggcctcggcc tgagagccaa aacacttgat gcggaagaag 11640
tcggtgcgct cctgcttgtc gccggcatcg ttgcgccaca tctaggtact aaaacaattc 11700
atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa 11760
aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc 11820
aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt 11880
gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc 11940
ttcgggcttt tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc 12000
ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc 12060
ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa 12120
gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata 12180
ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg 12240
ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc 12300
cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata 12360
taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc 12420
ttttacgcag cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc 12480
catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat 12540
aacaagacga actccaattc actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca 12600
gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg 12660
aaaccacaat tatgggtgat gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga 12720
ggtgctccag tggcttctgt gtctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg 12780
gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat cagcgctatc tctgctctca ctgccgtaaa 12840
acatggcaac tgcagttcac ttacaccgct tctcaacccg gtacgcacca gaaaatcatt 12900
gatatggcca tgaatggcgt tggatgccgg gcaacagccc gcattatggg cgttggcctc 12960
aacacgattt tacgtcactt aaaaaactca ggccgcagtc ggtaacctcg cgcatacagc 13020
cgggcagtga cgtcatcgtc tgcgcggaaa tggacgaaca gtggggctat gtcggggcta 13080
aatcgcgcca gcgctggctg ttttacgcgt atgacagtct ccggaagacg gttgttgcgc 13140
acgtattcgg tgaacgcact atggcgacgc tggggcgtct tatgagcctg ctgtcaccct 13200
ttgacgtggt gatatggatg acggatggct ggccgctgta tgaatcccgc ctgaagggaa 13260
agctgcacgt aatcagcaag cgatatacgc agcgaattga gcggcataac ctgaatctga 13320
ggcagcacct ggcacggctg ggacggaagt cgctgtcgtt ctcaaaatcg gtggagctgc 13380
atgacaaagt catcgggcat tatctgaaca taaaacacta tcaataagtt ggagtcatta 13440
cccaattatg atagaattta caagctataa ggttattgtc ctgggtttca agcattagtc 13500
catgcaagtt tttatgcttt gcccattcta tagatatatt gataagcgcg ctgcctatgc 13560
cttgccccct gaaatcctta catacggcga tatcttctat ataaaagata tattatctta 13620
tcagtattgt caatatattc aaggcaatct gcctcctcat cctcttcatc ctcttcgtct 13680
tggtagcttt ttaaatatgg cgcttcatag agtaattctg taaaggtcca attctcgttt 13740
tcatacctcg gtataatctt acctatcacc tcaaatggtt cgctgggttt atcgcacccc 13800
cgaacacgag cacggcaccc gcgaccacta tgccaagaat gcccaaggta aaaattgccg 13860
gccccgccat gaagtccgtg aatgccccga cggccgaagt gaagggcagg ccgccaccca 13920
ggccgccgcc ctcactgccc ggcacctggt cgctgaatgt cgatgccagc acctgcggca 13980
cgtcaatgct tccgggcgtc gcgctcgggc tgatcgccca tcccgttact gccccgatcc 14040
cggcaatggc aaggactgcc agcgctgcca tttttggggt gaggccgttc gcggccgagg 14100
ggcgcagccc ctggggggat gggaggcccg cgttagcggg ccgggagggt tcgagaaggg 14160
ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg cgcagccctg gttaaaaaca 14220
aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag gttagcggtg gccgaaaaac 14280
gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg acagcccctc aaatgtcaat 14340
aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg tcaaggatcg cgcccctcat 14400
ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg cacttatccc caggcttgtc 14460
cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt cgccgatttg cgaggctggc 14520
cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat ctgtcaacgc cgcgccgggt 14580
gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt cagtgagggc caagttttcc 14640
gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac acggcttcga cggcgtttct 14700
ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg cgagggcaac cagcccgg 14758

Claims (6)

1.一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)油松下胚轴的预处理；
2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养；
3)制备侵染溶液；
4)将1)中得到的下胚轴组织浸没于3)中得到的包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中，使用的农杆菌转入了35S:Gus基因；
5)用超声波处理4)中的溶液，将Gus基因转入下胚轴细胞；
6)下胚轴组织侵染后再培养，实现Gus基因的瞬时过量表达。
2.根据权利要求1所述的在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤1)中油松下胚轴的预处理具体为选取种子进行萌发1周，将子叶还未完全展开时的油松幼苗6-10株捆成一捆，垂直横切成1-2cm的片段，并用无菌水冲洗2-3次。
3.根据权利要求1所述的在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤2)油松下胚轴组织预侵染的农杆菌菌液培养具体为：将目标基因构建到含有35S启动子的植物双元表达载体PBI121上，将重组质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞，在含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB固体培养基中培养2天后，挑取阳性单克隆菌株，PCR检验后移入含有50mg/ml卡那霉素和利福平的YEB培养基中，28℃，200rpm过夜培养后，扩大培养体系到400ml，培养至OD600＝1.0-1.2，然后在室温5000g，10分钟离心待用。
4.根据权利要求1所述的在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤3)制备侵染溶液具体为：
3.1)渗透液的制备：10mM MES，100μM乙酰丁香酮，10mM MgCl2，0.005％Tween 20，并将pH调成5.6；
3.2)侵染溶液的制备：在离心后的农杆菌中加入3.1)中得到的渗透液，悬浮后再离心清洗2次，然后再重新悬浮到渗透液中，OD600＝1，在室温中放置3小时，得到侵染溶液，待用。
5.根据权利要求1所述的在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤4)和5)中将含有Gus基因的农杆菌渗入下胚轴组织的过程需要50分钟。
6.根据权利要求1所述的在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤6)中下胚轴组织侵染后再培养，实现Gus基因的瞬时过量表达具体为将侵染后的下胚轴组织用无菌水冲洗1次，放到有2层湿润滤纸的培养皿中，在黑暗中放置16小时，然后转入23℃，相对湿度80-85％，16小时光照，8小时黑暗条件继续培养2-4天后进行Gus染色检测。
CN201811496734.8A 2018-12-07 2018-12-07 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法 Pending CN109402167A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811496734.8A CN109402167A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811496734.8A CN109402167A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109402167A true CN109402167A (zh) 2019-03-01

Family

ID=65457783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811496734.8A Pending CN109402167A (zh) 2018-12-07 2018-12-07 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109402167A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111424051A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 仲恺农业工程学院 诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146704A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 中国农业科学院作物科学研究所 马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用
CN103305541A (zh) * 2013-06-19 2013-09-18 西南大学 一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用
CN103409423A (zh) * 2012-12-11 2013-11-27 湛江师范学院 一种构建植物病原诱导型人工启动子的方法
WO2016116032A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences A method for precise modification of plant via transient gene expression
CN106916848A (zh) * 2017-04-11 2017-07-04 浙江大学 一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法
CN107674881A (zh) * 2016-08-02 2018-02-09 武汉臻智生物科技有限公司 紫杉二烯过表达载体及其应用
CN107858372A (zh) * 2017-10-31 2018-03-30 河南大学 一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法
CN108588120A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 华中农业大学 一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409423A (zh) * 2012-12-11 2013-11-27 湛江师范学院 一种构建植物病原诱导型人工启动子的方法
CN103146704A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 中国农业科学院作物科学研究所 马铃薯pinⅡ基因启动子及其应用
CN103305541A (zh) * 2013-06-19 2013-09-18 西南大学 一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用
WO2016116032A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology,Chinese Academy Of Sciences A method for precise modification of plant via transient gene expression
CN107674881A (zh) * 2016-08-02 2018-02-09 武汉臻智生物科技有限公司 紫杉二烯过表达载体及其应用
CN106916848A (zh) * 2017-04-11 2017-07-04 浙江大学 一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法
CN107858372A (zh) * 2017-10-31 2018-03-30 河南大学 一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法
CN108588120A (zh) * 2018-04-24 2018-09-28 华中农业大学 一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU S等: "An efficient system for Agrobacterium-mediated transient transformation in Pinus tabuliformis", 《PLANT METHODS》 *
NANJAREDDY K等: "Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: tools for rapid gene expression analysis", 《BMC BIOTECHNOL》 *
TANG W等: "Regeneration of transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens", 《PLANTA》 *
李薇等: "带有GFP标签的油松苯丙氨酸解氨酶基因表达载体的构建", 《西北林学院学报》 *
杜鹃等: "超声波辅助农杆菌介导转化大豆gus基因在不同外植体中的瞬时表达", 《上海交通大学学报（农业科学版）》 *
陈仲等: "毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及其瞬时表达分析", 《植物生理学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111424051A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 仲恺农业工程学院 诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法
CN111424051B (zh) * 2020-03-31 2022-07-12 仲恺农业工程学院 诱导幼苗局部组织膨大建立瞬时表达系统的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110305218A (zh) 拟南芥转录因子at3g46080基因的应用
US6369296B1 (en) Recombinant plant viral vectors
CN108486148A (zh) 含烟草pds基因片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变型质粒载体及其应用
JP2001505406A (ja) ナンキンマメ褪縁条斑カリモウイルス（ＰＣｌＳＶ）の全長転写のためのプロモーター（ＦＬｔ）
CN101952446A (zh) 蛋白表达系统
US6610907B1 (en) Cotton leaf curl virus (CLCuV) promoter and its use
Capone et al. Upstream non-coding region which confers polar expression to Ri plasmid root inducing gene rol B
Liu et al. A tobamovirus expression vector for agroinfection of legumes and Nicotiana
CN109652427A (zh) 一种草莓FaABCC1转运蛋白基因及其应用
CZ301610B6 (cs) Zpusob transformace rostlin
CN109402167A (zh) 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法
CN106011141B (zh) 岷江百合诱导型启动子及其应用
US20110191894A1 (en) Methods and compositions relating to conrolled induction of plant senescence
CN112795570B (zh) 拟南芥转录因子at5g59820基因在培育抗病性转基因植物中的应用
CN104250647B (zh) 一种干旱诱导型启动子及其应用
CN113308488B (zh) 一种真核重组质粒及其应用
Özcan et al. Selectable marker genes engineered for specific expression in target cells for plant transformation
Firek et al. A wound-induced promoter driving npt-II expression limited to dedifferentiated cells at wound sites is sufficient to allow selection of transgenic shoots
CN101260399A (zh) 抗柑橘溃疡病pthA-nls基因及其构建方法与应用
CN113512561B (zh) 一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用
CN115521936B (zh) 一种烟草打顶后延迟其侧枝生长的方法和材料
CN101544976B (zh) 双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体
CN104450696B (zh) 一种双重组位点的双向启动植物表达载体系统
CN109251928B (zh) 一种特异表达下游基因的启动子pGh3622T、表达载体和应用
CN109593777A (zh) 一种验证增强子的载体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190301