CN113512561B - 一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用，属于植物基因工程技术领域。草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY‑P1‑MCS或pSVBVSY‑P4‑MCS；pSVBVSY‑P1‑MCS的序列如SEQ ID NO.1所示，pSVBVSY‑P4‑MCS的序列如SEQ ID NO.2所示。其构建方法如下：(1)草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建：(2)多克隆位点片段的构建：(3)草莓镶脉病毒载体的构建，具体来说，将带有Pml I和BamH I限制性内切酶识别位点的基因序列通过同源重组的方式插入到草莓镶脉病毒侵染性克隆的P1和P2之间或P4和P5制备之间而来。本发明构建的载体通过农杆菌浸润方法真空抽滤接种并稳定高效侵染森林草莓，同时还能在森林草莓上高效表达外源蛋白。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用。
背景技术
草莓镶脉病毒(SVBV)是环状双链DNA(ds-DNA)病毒，分类上属于花椰菜花叶病毒科(Cauli-moviridae)花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)美国最早报道了SVBV全基因组序列，全长约7.8kb，包含7个ORF。SVBV可通过蚜虫介体和嫁接传播，是严重危害草莓生产的病毒之一。森林草莓(Fragaria vesca)是SVBV的敏感指示植物，受病毒侵染后表现叶脉黄化、不连续黄化镶边典型症状。SVBV单独侵染栽培草莓(F.ananassa)无明显症状，但与草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus，SMoV)、草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus，SCV)等复合侵染时，栽培草莓出现叶片失绿、小叶畸形症状，草莓品质变劣、产量降低。用人工构建的植物病毒侵染性克隆接种寄主植物，可以克服介体传毒和嫁接传毒操作繁琐的弊端。一般将植物病毒的全长基因组插入双元植物表达载体，转化农杆菌，浸润或注射接种寄主植物，接种方法简便易行。目前，已成功构建多种植物病毒的侵染性克隆，并将其广泛应用于植物病毒生物学特性和致病性研究。
但草莓作为难利用转基因技术研究其基因功能的物种，可考虑利用植物病毒载体开展研究。目前，可应用于草莓的植物病毒载体很少，应用于森林草莓的病毒载体还未见报道。前人研究发现烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)载体可在栽培草莓(F.ananassa)叶片超表达外源GFP蛋白，验证发现，TRV-GFP表达载体也可应用于森林草莓，但TRV-GFP表达载体在森林草莓上的侵染率较低，同时对外源GFP蛋白的表达量也不高。据报道，苹果潜隐球形病毒(apple latent spherical virus，ALSV)载体可在栽培草莓上超表达外源AtFT基因，促进栽培草莓提前开花，但ALSV只能应用于栽培草莓组培苗，对土壤栽培的栽培草莓苗侵染率为0％，因此，TRV和ALSV载体均难以满足对森林草莓基因的研究。本发明构建的SVBV病毒载体可高效侵染森林草莓，并且可在森林草莓叶片大量表达外源GFP蛋白，为森林草莓基因功能研究提供一种简便快捷的工具。
发明内容
1、要解决的问题
植物病毒载体是研究草莓基因功能的一种简便快捷的工具，但目前应用于草莓基因功能研究的病毒载体很少，本发明利用草莓病毒病即草莓镶脉病毒来构建高效侵染森林草莓的病毒载体，并且该载体可在草莓叶片表达外源蛋白，为草莓基因功能研究提供有效工具。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种草莓镶脉病毒载体，所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P1-MCS或pSVBVSY-P4-MCS；
所述的pSVBVSY-P1-MCS的序列如SEQ ID NO.1所示，
所述的pSVBVsY-P4-MCS的序列如SEQ ID NO.2所示。
一种如上述所述的草莓镶脉病毒载体的构建方法中，
包括以下步骤：
(1)草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建：
准备pCB301质粒，利用限制性内切酶Sal I/Sma I双酶切上述pCB301质粒，将草莓镶脉病毒全长基因组序列SEQ ID NO.3经连接酶连入双酶切后的pCB301质粒，得到草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY；
(2)多克隆位点片段的构建：
以步骤(1)中构建的草莓镶脉病毒侵染性克隆pCB-SVBVSY为模板，利用正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.5扩增得到片段P1L-MCS，同时利用正向引物SEQ IDNO.6和反向引物SEQ ID NO.7扩增得到片段P1R-MCS，接着以片段P1L-MCS与片段P1R-MCS为模板，利用正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ D NO.7进行扩增，得到多克隆位点构建片段P1-MCS；
或者，
以步骤(1)中构建的草莓镶脉病毒侵染性克隆pCB-SVBVSY为模板，利用正向引物SEQ ID NO.8和反向引物SEQ ID NO.9扩增得到片段P4L-MCS，同时利用正向引物SEQ IDNO.10和反向引物SEQ ID NO.11扩增得到片段P4R-MCS，接着以片段P4L-MCS与片段P4R-MCS为模板，利用正向引物SEQ ID NO.8和反向引物SEQ ID NO.11进行扩增，得到多克隆位点构建片段P4-MCS；
(3)草莓镶脉病毒载体的构建：
通过同源重组的方法将片段P1-MCS连入步骤(1)中构建的并经限制性内切酶EconI/Dra III双酶切线性化的草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY，得到草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P1-MCS；
或者，
通过同源重组的方法将片段P4-MCS连入步骤(1)中构建的并经限制性内切酶DraIII/Bsp1407双酶切的草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY，得到草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P4-MCS。
上述所述的草莓镶脉病毒载体的构建方法中，
步骤(1)中双酶切的反应体系如下：
步骤(1)中双酶切的反应程序如下：
混匀后，37℃下水浴20min。
上述所述的草莓镶脉病毒载体的构建方法中，
步骤(2)中扩增的反应体系如下：
步骤(2)中扩增的反应程序如下：
(A)98℃，预变性，3min；
(B)98℃，变性，10s；68℃；退火和延伸1min；重复32个循环；
(C)72℃，5min；
(D)25℃，2min。
上述所述的草莓镶脉病毒载体的构建方法中，
步骤(3)中同源重组的反应体系如下：
步骤(3)中同源重组的反应程序如下：
混匀后，37℃水浴30min。
上述所述的草莓镶脉病毒载体的构建方法中，
步骤(3)中双酶切的反应体系如下：
或者，
步骤(3)中双酶切的反应程序如下：
混匀后，37℃下水浴20min。
一种如上述所述的草莓镶脉病毒载体在外源蛋白表达中的应用。
上述所述的草莓镶脉病毒载体在外源蛋白表达中的应用中，
所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P1-MCS；
利用正向引物SEQ ID NO.12和反向引物SEQ ID NO.13扩增得到片段P1GFP，通过同源重组的方法将片段P1GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P1-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P1-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤森林草莓，表达外源GFP蛋白。
上述所述的草莓镶脉病毒载体在外源蛋白表达中的应用中，
所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P4-MCS；
利用正向引物SEQ ID NO.14和反向引物SEQ ID NO.15扩增得到片段P4GFP，通过同源重组的方法将片段P4GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P4-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P4-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤接种森林草莓，表达外源GFP蛋白。
上述所述的草莓镶脉病毒载体在外源蛋白表达中的应用中，
所述的真空抽滤接种的方法为：配置接种工作液，选取三叶期草莓幼苗，用水冲去草莓叶片和根上的泥土，用针在草莓叶片上划出伤口，在接种液中加入体积分数为0.1％的表面活性剂Silwet L-77，将草莓叶片放入接种工作液中，真空抽滤20秒，放入清水中清洗，擦干草莓叶片上的水分，重新栽入土中培养；
其中接种工作液配置方法为：1M MgCl2 3ml、0.1M MES 30ml、2mM乙酰丁香酮15ml和dH2O 300ml，悬浮含草莓镶脉病毒瞬时超表达载体质粒的菌体，调OD值＝1.0，黑暗条件放置3h。
需要提醒的是，Pml I和BamH I识别序列分别为CACGTG和GGATCC。
需要提醒的是，所述的pSVBVSY-P1-MCS中，Pml I和BamH I核苷酸序列插入位点为SEQ ID NO.3中第1062位核苷酸至第1076位核苷酸序列；
所述的pSVBVSY-P4-MCS中，Pml I和BamH I核苷酸序列插入位点为SEQ D NO.3中第3414位核苷酸至第3428位核苷酸序列。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明构建得到能通过农杆菌介导真空抽滤接种并稳定高效侵染森林草莓的草莓镶脉病毒载体；
(2)本发明构建的草莓镶脉病毒载体可以作为表达载体使用，在森林草莓叶片能够高效表达外源蛋白；
(3)本发明构建的草莓镶脉病毒载体可作为病毒毒源保存和使用，用来研究草莓镶脉病毒基因与寄主植物森林草莓基因相互作用。
附图说明
图1为SVBVSY侵染性克隆接种森林草莓的症状表型图；其中1：未接种的森林草莓；2：接种pBIN-SVBVSY的森林草莓；3二接种pSVBVSY的森林草莓。
图2为RT-PCR检测SVBVSYP4基因图；其中M：DNA分子量标准；1，2：未接种的森林草莓；3，4：接种pBIN-SVBVSY的森林草莓；5，6：接种pSVBVSY的森林草莓；7：质粒pSVBVSY；8：阴性对照。
图3为pSVBVSY(Δp2)-MCS构建示意图。
图4为pSVBVSY(Δp2)-MCS接种森林草莓的症状表型图；其中1：接种pCB301的森林草莓；2：接种pSVBVSY的森林草莓；3：接种pSVBVSY(Δp2)-MCS的森林草莓。
图5为RT-PCR检测SVBVSYP4基因图；其中M：DNA分子量标准；1，2：接种pCB301的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY的森林草莓；5，6：接种pSVBVsY(Δp2)-MCS的森林草莓；7：质粒pSVBVSY；8：阴性对照。
图6为pSVBVSY(mp2)-MCS构建示意图。
图7为pSVBVSY(mp2)-MCS接种森林草莓的症状表型图；其中1：接种pCB301的森林草莓；2：接种pSVBVSY的森林草莓；3：接种pSVBVSY(mp2)-MCS的森林草莓。
图8为RT-PCR检测SVBVSYP4基因图；其中M：DNA分子量标准；1，2：接种pCB301的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY的森林草莓；5，6：接种pSVBVSY(mp2)-MCS的森林草莓；7：质粒pSVBVSY；8：阴性对照。
图9为qPCR检测SVBVSYP4基因积累水平图。
图10为pSVBVSY-P1-MCS构建示意图。
图11为pSVBVSY-P1-MCS接种森林草莓的症状表型图；其中1：接种pCB301的森林草莓；2：接种pSVBVsY的森林草莓；3：接种pSVBVsY-P1-MCS的森林草莓。
图12为RT-PCR检测SVBVSYP4基因图；其中M：DNA分子量标准；1，2：接种pCB301的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY的森林草莓；5，6：接种pSVBVSY-P1-MCS的森林草莓；7：质粒pSVBVSY；8：阴性对照。
图13为qPCR检测SVBVSYP4基因表达水平图。
图14为pSVBVSY-P4-MCS构建示意图。
图15为pSVBVSY-P4-MCS接种森林草莓的症状表型图；其中1：接种pCB301的森林草莓；2：接种pSVBVSY的森林草莓；3：接种pSVBVSY-P4-MCS的森林草莓。
图16为RT-PCR检测SVBVSYP4基因图；其中M：DNA分子量标准；1，2：接种pCB301的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY的森林草莓；5，6：接种pSVBVSY-P4-MCS的森林草莓；7：质粒pSVBVSY；8：阴性对照。
图17为qPCR检测SVBVsYP4基因积累水平图。
图18为GFP的荧光观察图；其中1：接种pSVBVSY-P1-MCS的森林草莓；2：接种pSVBVSY-P1-GFP的森林草莓。
图19为Western blot检测GFP蛋白图；其中1，2：接种pSVBVSY-P1-MCS的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY-P1-GFP的森林草莓。
图20为GFP的荧光观察图；其中1：接种pSVBVSY-P4-MCS的森林草莓；2：接种pSVBVSY-P4-GFP的森林草莓。
图21为Western blot检测GFP蛋白图；其中1，2：接种pSVBVSY-P4-MCS的森林草莓；3，4：接种pSVBVSY-P4-GFP的森林草莓。
图22为SVBV与TRV表达载体接种森林草莓GFP的荧光观察图；其中1：未接种的森林草莓；2：接种TRV-GFP的森林草莓；3：接种pSVBVSY-P1-GFP的森林草莓；4：接种pSVBVSY-P4-GFP的森林草莓。
图23为Western blot检测GFP蛋白图；其中1，2：未接种的森林草莓样本；3，4：接种TRV-GFP的森林草莓；5，6：接种pSVBVSY-P1-GFP的森林草莓；7，8：接种pSVBVSY-P4-GFP的森林草莓样本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
植物病毒载体是由植物病毒侵染性克隆构建而来，因此，植物病毒侵染性克隆的优劣直接影响植物病毒载体的优劣，其中最重要的是病毒的发病率，由发病率高的植物病毒侵染性克隆构建而来的植物病毒载体的发病率一般也较高。同时，植物病毒载体要方便后续基因的构建，特别是质粒酶切、菌株转化、重组连接等构建步骤，所以本发明对草莓镶脉病毒侵染性克隆进行优化构建。
草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY的优化构建
准备pCB301质粒(如SEQ ID NO.21所示)，利用限制性内切酶Sal I/Sma I双酶切上述pCB301质粒，将草莓镶脉病毒全长基因组序列(如SEQ ID NO.3所示)经连接酶连入双酶切后的pCB301质粒，得到草莓镶脉病毒侵染性克隆载体pSVBVSY。草莓镶脉病毒全长基因组构建如前人报道，Feng M F， Zhang H P，Pan Y，Hu Y H，Chen J，Zuo D P，JiangT.Complete nucleotide sequence ofstrawberry vein banding virus Chineseisolateand infectivity of itsfull-lengthDNA clone[J].Virology Journal.201613：164.
具体优化构建时，选择pBIN-PLUS载体(如SEQ ID NO.22所示)作为比对载体，其大小约为12kb，构建的侵染性克隆pBIN-SVBVSY约为27kb，由于重组载体过大，pBIN-SVBVSY接种森林草莓的发病率非常低，且症状不明显。因此，利用限制性内切酶Sal I/Sma I双酶切pBIN-SVBVSY质粒和二元载体pCB301质粒，连接酶连接两个目的片段，成功将12kb的pBIN-PLUS更换为5kb的pCB301，重新构建获得侵染性克隆pCB-SVBVSY，pCB-SVBVSY接种森林草莓产生的症状更严重，且发病率更高。需要提醒的是，pCB-SVBVSY在本文中简写为pSVBVSY。
需要注意的是，双酶切的反应体系如下：
步骤(1)中双酶切的反应程序如下：
混匀后，37℃下水浴20min。
接着，进行症状表型观察及病毒检测，pSVBVSY接种森林草莓产生的浅绿色镶脉症状比pBIN-SVBVSY更明显(如图1所示)。其中具体的接种方法如下：配置接种工作液，选取三叶期草莓幼苗，用水冲去草莓叶片和根上的泥土，用针在草莓叶片上划出伤口，在接种液中加入体积分数为0.1％的表面活性剂Silwet L-77，将草莓叶片放入接种工作液中，真空抽滤20秒，放入清水中清洗，擦干草莓叶片上的水分，重新栽入土中培养；其中接种工作液配置方法为：1M MgCl2 3m1、0.1M MES 30ml、2mM乙酰丁香酮15ml和dH2O 252m1，悬浮含草莓镶脉病毒侵染性克隆质粒的菌体，调OD值＝1.0，黑暗条件放置3h。利用SVBVP4基因特异性引物扩增(利用正向引物SEQ ID NO.16和反向引物SEQ ID NO.17)，RT-PCR检测发现，pBIN-SVBVSY和pSVBVSY接种的森林草莓样本均可检测出约1400bp的特异性条带，而未接种的森林草莓样本不能检测出条带(如图2所示)。
此外，发病率的数据如表1所示，侵染性克隆pBIN-SVBVSY接种森林草莓的平均发病率为29.4％，而侵染性克隆pSVBVSY接种森林草莓的平均发病率为71.4％，pSVBVSY接种森林草莓的发病率显著高于pBIN-SVBVSY。
表1 pBIN-SVBVSY和pSVBVSY发病率对比
本发明还利用pCAM2300作为对比载体，其大小约8kb，但构建而来的侵染性克隆pCAM-SVBVSY发病率显著降低。本发明还利用pCAM0380作为对比载体，其大小约6kb，但pCAM0380与全长的SVBV连接困难，转化农杆菌时效率低。
实施例2
多克隆位点片段的优化构建
多克隆位点MCS插入病毒侵染性克隆不同位置，对病毒的侵染和复制均有影响，常见MCS插入病毒侵染性克隆的方式有三种，第一种是以MCS替换病毒编码的特定基因；第二种是将MCS插入病毒运动蛋白基因(Movement protein，MP)下游，本发明中P1基因编码SVBV的运动蛋白；第三种是将MCS插入病毒外壳蛋白基因(Coat protein，CP)下游，本发明中P4基因编码SVBV的外壳蛋白。因此，本研究分别构建了这三种类型MCS插入方式的病毒载体。需要提醒的是，P1基因序列如SEQ ID NO.24所示，P4基因序列如SEQ ID NO.25所示。
具体的优化方案如下：
以构建的草莓镶脉病毒侵染性克隆pCB-SVBVSY为模板，利用正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.5扩增得到片段P1L-MCS，同时利用正向引物SEQ ID NO.6和反向引物SEQ ID NO.7扩增得到片段P1R-MCS，接着以片段P1L-MCS与片段P1R-MCS为模板，利用正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.7进行扩增，得到多克隆位点构建片段P1-MCS；
或者，
以构建的草莓镶脉病毒侵染性克隆pCB-SVBVSY为模板，利用正向引物SEQ ID NO.8和反向引物SEQ ID NO.9扩增得到片段P4L-MCS，同时利用正向引物SEQ ID NO.10和反向引物SEQ ID NO.11扩增得到片段P4R-MCS，接着以片段P4L-MCS与片段P4R-MCS为模板，利用正向引物SEQ ID NO.8和反向引物SEQ ID NO.11进行扩增，得到多克隆位点构建片段P4-MCS。
为了更好说明，作了如下的比对测试：
方案一：MCS替换SVBVP2基因
SVBV P2基因编码蚜传毒蛋白，而病毒载体通过真空抽滤接种森林草莓，对蚜传毒蛋白要求不大。其他病毒组分均编码病毒复制和侵染相关关键蛋白，这些关键蛋白缺失突变后病毒载体无法侵染。因此，用MCS替换P2基因，具体构建方法如下：以pSVBVSY质粒为模板，利用引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)、(SEQ D NO.18、SEQ D NO.7)，高保真酶PCR分别扩增获得两段均含Pml I和BamH I限制性内切酶识别位点基因序列的片段P1MCS和P3MCS，再以P1MCS和P3MCS为模板，利用引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7)扩增，获得P2完全缺失型多克隆位点构建片段Δp2-MCS。通过同源重组的方法将片段Δp2-MCS连入经Econ I/DraIII双酶切线性化的质粒pSVBVSY，获得草莓镶脉病毒载体pSVBVSY(Δp2)-MCS(如图3所示)。
接着，进行接种、症状表型观察和病毒检测，重组病毒载体pSVBVSY(Δp2)-MCS接种森林草莓，35天后无症状(如图4所示)。利用SVBV P4基因特异性引物(SEQ D NO.16、SEQ IDNO.17)扩增，RT-PCR检测发现，pSVBVSY接种的森林草莓样本可扩增出约1400bp的特异性条带，而pSVBVSY(Δp2)-MCS和pCB301接种森林草莓样本不能扩增出条带(如图5所示)，说明pSVBVSY(Δp2)-MCS不能侵染森林草莓，此种构建方式不可取。
方案二：MCS替换P2基因中间区域
改良重组病毒载体pSVBVSY(Δp2)-MCS的构建方式，保留P2基因5’端和3’端各60bp，将P2基因中间区域置换为MCS，构建方法如下：以pSVBVSY质粒为模板，利用引物(SEQID NO.4、SEQ ID NO.19)和(SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.7)扩增，高保真酶PCR分别扩增获得两段均含Pml I和BamH I限制性内切酶识别位点基因序列的片段P1M和P3M，再以P1M和P3M为模板，利用引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7)扩增，获得P2部分缺失型多克隆位点构建片段mp2-MCS。通过同源重组的方法将片段mp2-MCS连入经Econ I/Dra III双酶切线性化的质粒pSVBVSY，获得重组病毒载体pSVBVSY(mp2)-MCS(如图6所示)；
接着，进行接种、症状表型观察和病毒检测，重组病毒载体pSVBVSY(mp2)-MCS接种森林草莓，35天后可产生浅绿色镶脉症状(如图7所示)。利用SVBVP4基因特异性引物(SEQID NO.16、SEQ ID NO.17)扩增，RT-PCR检测发现，pSVBVSY(mp2)-MCS和pSVBVSY接种的森林草莓样本均可扩增出约1400bp的特异性条带，而接种pCB301的森林草莓样本不能扩增出条带(如图8所示)，说明pSVBVSY(mp2)-MCS可侵染森林草莓。但病毒积累量检测发现，重组病毒载体pSVBVsY(mp2)-MCS接种森林草莓的P4 mRNA积累水平显著低于pSVBVSY接种森林草莓，说明pSVBVsY(mp2)-MCS病毒复制量下降(如图9所示)，病毒载体复制量下降会影响后续外源蛋白的表达，此种构建方式不可取。
方案三：MCS插入病毒运动蛋白P1基因下游
SVBVP1基因编码病毒的MP蛋白，将MCS插入SVBV编码的P1和P2基因之间(通过同源重组的方法将片段P1-MCS连入构建的并经限制性内切酶Econ I/Dra III双酶切线性化的草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY，得到草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P1-MCS)，获得重组病毒载体pSVBVSY-P1-MCS(如图10所示)，所述的pSVBVSY-P1-MCS的序列如SEQ ID NO.1所示。
接着，进行接种、症状表型观察和病毒检测，重组病毒载体pSVBVSY-P1-MCS接种森林草莓，35天后可产生浅绿色镶脉症状(如图11所示)。利用SVBVP4基因特异性引物(SEQ IDNO.16、SEQ D NO.17)扩增，RT-PCR检测发现，pSVBVSY-P1-MCS和pSVBVSY接种的森林草莓样本均可扩增出1400bp的特异性条带，而接种pCB301的森林草莓样本不能扩增出条带(如图12所示)，此外，病毒积累量检测发现，pSVBVSY-P1-MCS与pSVBVSY接种的森林草莓病毒P4mRNA积累量无显著差异(如图13所示)，说明pSVBVSY-P1-MCS与pSVBVSY接种森林草莓病毒复制量基本一致。此构建方法可用。
方案四：MCS插入病毒外壳蛋白P4基因下游
SVBV P4基因编码病毒的CP蛋白，将MCS插入SVBV编码的P4和P5基因之间(通过同源重组的方法将片段P4-MCS连入构建的并经限制性内切酶Dra III/Bsp1407双酶切的草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY，得到草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P4-MCS)，获得重组病毒载体pSVBVSY-P4-MCS(如图14所示)，所述的pSVBVSY-P4-MCS的序列如SEQ ID NO.2所示。
接着，进行接种、症状表型观察和病毒检测，重组病毒载体pSVBVSY-P4-MCS接种森林草莓，35天后可产生浅绿色镶脉症状(如图15所示)。利用SVBVP4基因特异性引物(SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17)扩增，RT-PCR检测发现，pSVBVSY-P4-MCS和pSVBVSY接种的森林草莓样本均可扩增出约1400bp的特异性条带，接种pCB301的森林草莓样本不能扩增出条带(如图16所示)，说明pSVBVSY-P4-MCS可侵染森林草莓。此外，病毒积累量检测发现，pSVBVsY-P4-MCS与pSVBVsY接种的森林草莓病毒P4 mRNA积累水平无显著差异(如图17所示)，说明pSVBVSY-P4-MCS与pSVBVSY接种森林草莓病毒复制量基本一致，此构建方法可用。
需要提醒的是，方案三与方案四中扩增的反应体系如下：
步骤(2)中扩增的反应程序如下：
(A)98℃，预变性，3min；
(B)98℃，变性，10s；68℃；退火和延伸1min；重复32个循环；
(C)72℃，5min；
(D)25℃，2min；
其中同源重组的反应体系如下：
需要提醒的是，同源重组的反应程序如下：
混匀后，37℃水浴30min；
需要提醒的是，双酶切的反应体系如下：
或者，
双酶切的反应程序如下：
混匀后，37℃下水浴20min。
实施例3
SVBV病毒载体在表达外源蛋白中的应用
将GFP基因(如SEQ ID NO.23所示)分别插入重组病毒载体pSVBVSY-P1-MCS和pSVBVSY-P4-MCS，获得表达载体pSVBVSY-P1-GFP和pSVBVSY-P4-GFP，与TRV-GFP表达载体相比，本研究构建的两个SVBV表达载体携带的GFP在森林草莓叶片的表达量更高。
具体的构建方法如下：
所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P1-MCS；
利用正向引物SEQ ID NO.12和反向引物SEQ ID NO.13扩增得到片段P1GFP，通过同源重组的方法将片段P1GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P1-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P1-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤森林草莓，表达外源GFP蛋白。
所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P4-MCS；
利用正向引物SEQ ID NO.14和反向引物SEQ ID NO.15扩增得到片段P4GFP，通过同源重组的方法将片段P4GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P4-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P4-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤接种森林草莓，表达外源GFP蛋白。
并进行如下的测试：
(1)pSVBVSY-P1-GFP接种森林草莓GFP蛋白的表达
pSVBVSY-P1-GFP接种森林草莓，15天后观察发现，森林草莓叶脉和叶柄产生强烈的绿色荧光，而pSVBVsY-P1-MCS接种森林草莓叶片未观察到绿色荧光(如图18所示)。Westernblot检测发现，pSVBVSY-P1-GFP接种的森林草莓可检测出GFP蛋白特异性条带，而pSVBVSY-P1-MCS接种森林草莓样本不能检测出条带(如图19所示)。说明pSVBVSY-P1-GFP可在森林草莓叶片超表达外源GFP蛋白。
(2)pSVBVSY-P4-GFP接种森林草莓GFP蛋白的表达
pSVBVSY-P4-GFP接种森林草莓，15天后观察发现，森林草莓叶脉和叶柄产生强烈的绿色荧光，而pSVBVSY-P4-MCS接种森林草莓未观察到绿色荧光(如图20所示)。Western blot检测发现，pSVBVSY-P4-GFP接种的森林草莓样本可检测出GFP蛋白特异性条带，而pSVBVSY-P4-MCS接种森林草莓样本不能检测出条带(如图21所示)。说明pSVBVSY-P4-GFP也可在森林草莓叶片超表达外源GFP蛋白。
(3)SVBV表达载体与TRV表达载体的比较
A-荧光对比
2种SVBV表达载体在森林草莓叶片产生的绿色荧光强度均高于TRV表达载体(如图22表示)。
(2)GFP蛋白表达水平对比
pSVBVSY-P4-GFP和pSVBVSY-P1-GFP在森林草莓叶片GFP的蛋白表达水平均高于TRV-GFP(如图23所示)。
(3)发病率
从表2可以看出，pSVBVSY-P4-GFP接种森林草莓的发病率最高，达74.3％，pSVBVSY-P1-GFP接种森林草莓的发病率为60.6％，而TRV-GFP接种森林草莓的发病率仅为31.4％，2种SVBV表达载体接种发病率均显著高于TRV表达载体。
表 2SVBVSY和TRV表达载体接种森林草莓发病率对比
草莓镶脉病毒是草莓生产上最常见的病毒，侵染性高且难以脱毒，侵染栽培草莓时无症状，生产上难以察觉。栽培草莓一般通过匍匐茎育苗，SVBV可由匍匐茎传播，在草莓体内积累，引起品种退化，严重影响草莓生产。当草莓镶脉病毒侵染模式植物森林草莓后，可产生镶脉症状。因此，本发明构建并优化获得草莓镶脉病毒侵染性克隆pSVBVSY，与其他草莓镶脉病毒侵染性克隆相比，pSVBVSY质粒长度适中，质粒线性化和农杆菌转化均易操作，且pSVBVSY诱导的镶脉症状更严重，发病率更高。pBIN-SVBVSY接种后产生的症状减轻以及发病率的显著下降，可能是由于质粒长度过大，影响农杆菌活性，降低了pBIN-SVBVSY对对植物的侵染，同时也抑制了SVBV自身的复制，最终导致病毒侵染性克隆侵染性下降。
接着，本发明将SVBV构建为病毒载体，草莓镶脉病毒的P2基因编码一个蚜虫传毒相关蛋白。目前我们主要采用真空抽滤的方法接种森林草莓，因此前期我们尝试以多克隆位点(MCS)替换或者突变草莓镶脉病毒的P2基因，构建完成后接种森林草莓，结果发现，P2基因缺失后严重影响草莓镶脉病毒在森林草莓上的侵染和复制，猜想草莓镶脉病毒P2编码的蛋白不仅与蚜虫传毒相关还可能影响病毒的复制以及侵染。因此我们改变了构建方法，保留完整的P2基因。将多克隆位点插入SVBV编码的移动蛋白P1基因或者外壳蛋白P4基因下游，成功构建获得病毒载体pSVBVSY-P1-MCS和pSVBVSY-P4-MCS，进行接种、症状表型观察和病毒检测发现，pSVBVSY-P1-MCS和pSVBVSY-P4-MCS的接种发病率和病毒积累量均较高，可应用于后续外源蛋白的表达。对比两种病毒载体的发病率发现，pSVBVSY-P4-MCS的发病率比pSVBVSY-P1-MCS稍高，可能是由于草莓镶脉病毒特殊的移动方式造成的，将多克隆位点插入外壳蛋白P4基因后对病毒的移动影响较小，因此pSVBVSY-P4-MCS对森林草莓的侵染更加高效。
接着将SVBV病毒载体运用于外源蛋白表达，获得超表达载体pSVBVSY-P1-GFP和pSVBVSY-P4-GFP，蛋白检测发现，pSVBVSY-P1-GFP和pSVBVSY-P4-GFP蛋白表达量和侵染率均高于载体TRV-GFP。SVBV对森林草莓的侵染性更高，森林草莓更适合SVBV的复制和移动。SVBV病毒载体为研究草莓乃至其他蔷薇科植物功能基因提供了一个简便快捷的工具。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用
<141> 2021-07-26
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7879
<212> DNA
<213> 草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus)
<400> 1
tggtatcaga gcctgctact ctcaccagta ggagatcctc agagaccacc tcttcaacaa 60
catcacagaa tgtctgaaga agagatcaga atggaccaac cacaggaagg ccaagacgag 120
tacatcttcg aagaagaagg tacatatgca catgacgttg caatagactc ttctctctta 180
ggacagatag agaaaaagga tcttgaactt tctacagaag aagtgttcaa atcccctagc 240
ctatggaaga aattcctcaa agctagaaaa aatatatgtg ttgcttgtgt tagcactagg 300
gaatacccca tagaaataac ccaagccaac ggacttactg agattccttt cttcaaccga 360
gaagaaatcg agagtaagaa aagggtgtta aaacccgaag atcgtaaaaa gatagatttt 420
atccatatag gatctattag gattatgatc aaaagcacct ttaggaccgg gatagacgct 480
cctataagtg tagccctcct tgaccggaga atgacaaccg cgagagacgc agtcttcggt 540
ggcatgaaag gtaatctttc ctacgggaaa cttatcttta catgtaatcc taagatagga 600
gtcagcctta gagatcctag gattgacaaa atcttaacat tagctcactt tttcgagaga 660
gaaagcctaa tgcacctagg gaaccacccc tataccatat cctacaaact aggttatgta 720
ctgtcaaact ctcaccatag tttagagttt agaccaaaag aacccatctg catagacgac 780
ctgtttagtg cagtaggtag aatatctcag gccccagtcc aagagataag tcctttagaa 840
aactattgga ccatgcatct gggtaacacc agtagaagaa tgctaggaga aagacctagg 900
atgattgtca ttgaggacga tgaagaacag acccctcatg acagacaatt acaagaaaga 960
gcattagcta gatcccaatc taggatgcta ggtttaagac ccacagagga tcttagaacc 1020
actagtcgca ggattaacag cctagcacac caattataaa tcacgtgacg ggatccatgg 1080
cgtacaaaga ccaaccccat atttattaca agaagcaata cctagctctc taccatcaaa 1140
acgtagaaag aggtagcccc gagtatttct ttaccggagg aaaaggaatt gaaggatgtt 1200
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<211> 7879
<212> DNA
<213> 草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus)
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gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 24
<211> 990
<212> DNA
<213> 草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus)
<400> 24
atgtctgaag aagagatcag aatggaccaa ccacaggaag gccaagacga gtacatcttc 60
gaagaagaag gtacatatgc acatgacgtt gcaatagact cttctctctt aggacagata 120
gagaaaaagg atcttgaact ttctacagaa gaagtgttca aatcccctag cctatggaag 180
aaattcctca aagctagaaa aaatatatgt gttgcttgtg ttagcactag ggaatacccc 240
atagaaataa cccaagccaa cggacttact gagattcctt tcttcaaccg agaagaaatc 300
gagagtaaga aaagggtgtt aaaacccgaa gatcgtaaaa agatagattt tatccatata 360
ggatctatta ggattatgat caaaagcacc tttaggaccg ggatagacgc tcctataagt 420
gtagccctcc ttgaccggag aatgacaacc gcgagagacg cagtcttcgg tggcatgaaa 480
ggtaatcttt cctacgggaa acttatcttt acatgtaatc ctaagatagg agtcagcctt 540
agagatccta ggattgacaa aatcttaaca ttagctcact ttttcgagag agaaagccta 600
atgcacctag ggaaccaccc ctataccata tcctacaaac taggttatgt actgtcaaac 660
tctcaccata gtttagagtt tagaccaaaa gaacccatct gcatagacga cctgtttagt 720
gcagtaggta gaatatctca ggccccagtc caagagataa gtcctttaga aaactattgg 780
accatgcatc tgggtaacac cagtagaaga atgctaggag aaagacctag gatgattgtc 840
attgaggacg atgaagaaca gacccctcat gacagacaat tacaagaaag agcattagct 900
agatcccaat ctaggatgct aggtttaaga cccacagagg atcttagaac cactagtcgc 960
aggattaaca gcctagcaca ccaattataa 990
<210> 25
<211> 1416
<212> DNA
<213> 草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus)
<400> 25
atgtcttctc gcagagaaag actcgaacaa ctgttcgaag aagatcatcc agaaatggat 60
acaataatac aatatctgtc tttacttgat gatgaacttg ataattgtca ggaagaaaag 120
ttacaggtac ttgtagcaaa agaaatgatt agctacagca gcagcagtga agatgaagct 180
gcaaatgtca aagctaacat taaggaagaa gacgaagaca cctatcgtcc gaaccgaaag 240
cgaagaggaa caagttcctc tcagccaaat tatacaaggt atgatattcc ttcagaatac 300
attccaaata aaaagacagg tctaacaaac accaaaagtt tggatctgga ttgcgcaagc 360
aaccgaagac aactcattga agaatgggac aatgagatga gattaatcat taaaacagag 420
aaggctctta caaatgattt tgatcttatc cttactctcg caaagagtaa aacagttggc 480
aatgccaaac aattgttgga atcacttcac actgatgcct tcaaacaagc ttcttcaaca 540
ggagaagaat ttttgacaac tctaacaaat tcgttttata ctatatttgt tggaactaac 600
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aatcttctga agttacctat agaagaatgg cccaaatata ttgaagaata tattaggaaa 780
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ggatctttag gatatgccca caatctgata aagagttaca tggaaaagaa gtgtaagtct 900
ttaaagataa aaaaggaaat acgtagaaat atgtgttgtc ctaagttttc ttcaccggaa 960
acacaatatg gttgtaaacc cattagccat aaaaaagcta agaaaaagaa gtacaagcag 1020
tactacaaaa gaaagtatag acttaggaaa cctaaaaggt ggactaactc tagaagaaaa 1080
tattctggta gaaagctttt tcgcaggaaa agaaaccaga aagaagagac ggctcagcca 1140
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aatgagatcg gacattttgc aaaagattgc agaaataaaa ctgcaaatca caataaggta 1260
ctcgaggaac tcaagacctt acaactcgaa ccagtctttg acacaagcag actggaagaa 1320
gaagaaatgt tctgggaaat catctcagaa acagactcag agtcagaatc agaatcgtca 1380
tcagatgaat cagacgactc aacagatctg gaatga 1416
Claims (4)
1.一种草莓镶脉病毒载体在森林草莓中表达外源蛋白的应用，其特征在于，所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P1-MCS或pSVBVSY-P4-MCS；所述的pSVBVSY-P1-MCS的序列如SEQID NO.1所示，所述的pSVBVSY-P4-MCS的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P1-MCS；利用正向引物SEQ ID NO.12和反向引物SEQ ID NO.13扩增得到片段P1GFP，通过同源重组的方法将片段P1GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P1-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P1-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤森林草莓，表达外源GFP蛋白。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY-P4-MCS；
利用正向引物SEQ ID NO.14和反向引物SEQ ID NO.15扩增得到片段P4GFP，通过同源重组的方法将片段P4GFP连入经Pml I/BamH I双酶切线性化的草莓镶脉病毒载体pSVBVSY-P4-MCS，获得草莓镶脉病毒瞬时超表达载体pSVBVSY-P4-GFP，然后转化农杆菌，再通过农杆菌浸润方法真空抽滤接种森林草莓，表达外源GFP蛋白。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：
所述的真空抽滤的方法为：配置接种工作液，选取三叶期森林草莓幼苗，用水冲去叶片和根上的泥土，用针在叶片上划出伤口，在接种液中加入体积分数为0.1%的表面活性剂Silwet L-77，将叶片放入接种工作液中，真空抽滤20秒，放入清水中清洗，擦干叶片上的水分，重新栽入土中培养；
其中接种工作液配置方法为：1 M MgCl2 3 ml、0.1 M MES 30 ml、2 mM乙酰丁香酮15ml和dH2O 300 ml，悬浮含草莓镶脉病毒瞬时超表达载体质粒的菌体，调OD值=1.0，黑暗条件放置3h。
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