CN113073145B

CN113073145B - 一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法

Info

Publication number: CN113073145B
Application number: CN202110323539.0A
Authority: CN
Inventors: 刘伟; 樊新萍; 史华平; 李捷; 尚勇进
Original assignee: Shanxi Juxinweiye Agricultural Technology Development Co ltd; Pomology Institute Shanxi Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanxi Juxinweiye Agricultural Technology Development Co ltd; Pomology Institute Shanxi Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113073145A

Abstract

一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，目的是具有准确高效特点，可进行高通量精准检测；本发明用基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针(Dual‑Labeled LockedNucleic Acid Probe)的实时荧光定量核酸酶链式反应(qPCR)，以脱氧核糖核酸(DNA)和互补脱氧核糖核酸(cDNA)的混合物为模板，用多对病毒特异引物通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被主要病毒感染。

Description

一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法

技术领域

本发明涉及农业种苗繁育和种植生产领域，具体涉及草莓种苗繁育和种植生产过程中的病毒检测。

背景技术

据不完全统计，我国草莓栽培面积已达250万亩，居世界首位。每年生产上需要优质草莓生产用商品苗200亿株以上，经济价值可达160亿元。我国每年需原种一代苗10亿株以上，经济价值可达30亿元，每年需原种苗5000万株以上。草莓种苗的繁育一般采用营养繁殖方法，通过母株生发匍匐茎产生子株而扩大数量，在生产过程中由于无可避免的虫害，植株会感染和积累病毒，从而影响种苗的质量，种苗的质量是影响生产和效益的主要因素，无病毒种苗的制备则成为整个草莓产业的关键因素。目前一般采用热处理后微茎尖组织培养的方法脱除病毒制成原原种苗，然后扩繁形成原种苗，之后进一步扩繁形成生产种。这种方法也称为三级育苗体系。在此过程中需要病毒检测，一方面需要保证病毒脱除效果，另一方面也需要监测在次一级的种苗扩繁过程中病毒复染情况。检测方法主要有以下几种：1、接种指示植物：该方法比较传统，需要有指示植物，检测周期长，时间成本高；2、酶联免疫法：该方法需要有相应的抗体蛋白，往往存在难以购买或制备的问题；3、PCR法：是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,可以将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法。该方法通过扩增病毒的特有核酸片段判定病毒的有无，具有快速的特点，是目前比较常用的方法。4、qPCR法：quantitative PCR,也称实时定量PCR，用基于荧光染料或荧光探针的qPCR检测，其原理是荧光染料嵌入DNA的双链中产生荧光，或探针水解后释放荧光。荧光信号随PCR扩增产物的增加而增加，通过实时监测荧光信号的强弱来判断目标片段的有无和多少。前者非特异的扩增会产生假阳性，后者因为荧光探针的特异性增强了准确性。目前世界上发现感染草莓的病毒有二十多种，在我国主要有四种较为普遍并产生危害，包括草莓镶脉病毒、草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒和草莓轻型黄边病毒。其中皱缩病毒能单独引起叶片皱缩，从而在形态学上比较容易直观识别，其它三种病毒为潜隐性病毒，即单独感染没有明显症状，从形态学上较难识别，但仍然显著影响植株的长势和产量。由于种植条件和管理水平也能显著影响植株的长势和产量，在生产过程中无论是判定原因还是确保种苗的无病毒特性，检测这三种潜隐性病毒都十分必要。我国目前一般采用PCR的方法通过DNA扩增，然后通过电泳显示目标条带来判定病毒的有无。该法需要三次PCR反应针对不同的病毒，存在假阳性和假阴性的可能性。在草莓原种苗制备过程中或草莓种植生产过程中，一般情况下，只需要或者最主要的是判定是否被病毒感染，即可决定取舍。本专利所述的快速检测三种主要草莓病毒的方法，是荧光标记探针而非荧光染料,且探针的序列包含于三种病毒各自的扩增产物的目标序列中，不但极大提高了检测的准确度和灵敏度，也提高了检测效率。PCR扩增时在加入三对引物的同时加入这个特异性的共有荧光探针，该探针为双端标记的八聚体锁核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团6-FAM和一个淬灭荧光基团BHQ-1。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。PCR反应体系中，当标记有荧光基团的罗氏通用探针与模板DNA混合后，随着反应的进行，逐步完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应（PCR）原理，与模板DNA互补配对的罗氏通用探针被聚合酶解离，荧光基团游离释放到反应体系中，在特定波长光激发下发出特定荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，相应的荧光也随之增强。通过实时检测随PCR扩增而发生变化的荧光信号强度，与正负对照相比较，判断出模板中目标序列的有无及计算出其相对含量，或得到反应的Ct值，同时通过已知模板浓度的标准品作对照，即可计算出待测标本目的基因片段的拷贝数。

发明内容

本发明目的是为克服上述已有技术的不足，提供一种具有准确高效特点、可进行高通量精准检测的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法。

本发明是用基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针（Dual-Labeled LockedNucleic Acid Probe）的实时荧光定量PCR（qPCR），以DNA和cDNA的混合物为模板，用多对病毒特异引物通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被主要病毒感染。

所述的主要病毒是指东亚特别是中国在草莓种植和生产的三种主要草莓病毒，即镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）、斑驳病毒（Strawberry mottle virus）和轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）；通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被一种或两种或三种感染；三种病毒各自的特异引物如下:

用于探测镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的引物

Fv：gggctcttgtagcaccgata，Rv： cagttcggcttcttttctgg，针对如下目标序列扩增71 bp片段（加粗黑体71 nt）aatatatgatagttgggctcttgtagcaccgataaaacaaaactatcatcac caggccttttccaccagaaaagaagccgaactggcccttcaaacatac；

用于探测斑驳病毒（Strawberry mottle virus）的引物Fm：aagattgccgatatggtctca，Rm：ttctaacgatggcgttttca，针对如下目标序列扩增61 bp目标片段（加粗黑体61 nt）acaccaagagtcttaatgatgaagattgccgatatggtctcaaatttggctggtgatggtcgtgaaaacgccatcgttagaagaaatttgatgaagatgg；

用于探测轻型黄边病毒的引物Fy：gagcctgatgtcgctcaagt，Ry：taggtacgggggtcctatcc，针对如下目标序列扩增64 bp片段（加粗黑体64 nt）ccatacaaaatattgggttgagcctgatgtcgctcaagtgtatgctggtgatgattctgcccaggataggacccccgtacctaggcccagcttcaacaag。

所述基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针的实时荧光定量PCR是qPCR反应体系中的探针为经过荧光标记的锁核酸八聚体，具体是5’-6-FAM-locked C-locked A-lockedT-locked C-locked A-locked C-locked C-locked A-BHQ-1-3’,该探针序列或其反向互补序列（reverse compliment sequence）以上述DNA序列的下划线标示。

用草莓幼叶为材料，提取植物材料及其上所附着的所有微生物包括病毒的总DNA和RNA，并对RNA进行反转录合成cDNA，用DNA和cDNA的混合物为模板进行qPCR；或提取RNA时不使用DNA水解酶（比如DNase I）去除残留的DNA，对RNA进行反转录合成cDNA后，溶液中含有DNA和cDNA，以此为模板进行qPCR；模板的质量用常规方法确证，比如测试Actin基因的DNA 和cDNA；由于镶脉病毒是DNA病毒，可以直接用其DNA为模板，而斑驳病毒和轻型黄边病毒是RNA病毒，需要其cDNA为模板；为同一PCR反应提供了宏基因组DNA和cDNA模板，并同时加入三种病毒的三对特异引物，这样可以一次性探测三种病毒；由于三对引物的扩增产物较短，长度全部在60-80个核苷酸，扩增反应相对灵敏；同时由于在PCR反应体系中加入了荧光FAM标记的八聚体锁核酸探针，极大地增强了核酸扩增产物的特异性；qPCR的扩增反应用热激活TagDNA聚合酶，此酶在摄氏90度以上被激活，避免低温下可能引起的非特异扩增从而导致的假阳性。

可以使用商用的热激活Tag酶qPCR预混液，其中包括了热激活TagDNA聚合酶、dNTP、镁离子等，一般以二倍的浓度预配，可以直接使用，比如Roche 公司生产的2XFastStart TagMan Probe Mast er，或天根生物科技有限公司生产的2X HotStart TagMasterMix。50uL的反应混合物的配置，DNA和cDNA模板量为10 pg-10 ng，根据所检测材料样本的数量可以配置总量然后以10uL分装入用于qPCR的排管或板管中进行扩增反应。例如，配置总量为50 uL的反应混合物需要加入25 uL 二倍的热激活Tag酶qPCR预混液，1.25µL本专利所述的浓度为10 µm的探针，本专利所述的六种浓度全为10 µm的引物各1 µL，DNA和cDNA模板1-5 µL，加PCR级的纯水至50 µL，然后混匀并以10uL分装于qPCR的排管或板管中进行扩增反应。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。

合成八聚体探针用的锁核甘酸，是一类寡核苷酸衍生物，不同于常规核甘酸，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构，增强了其与互补的双链的热稳定性，从而增加探针的融解温度（Tm值）,也增强了其抗3’脱氧核苷酸酶降解的稳定性。

用草莓幼叶为材料，提取植物及其材料上所附着的所有微生物包括病毒的总DNA和RNA，并对RNA进行反转录合成cDNA，用稀释后的DNA和cDNA的混合物为模板进行qPCR；或提取RNA时不使用DNA水解酶（比如DNase I）去除残留的DNA，对RNA进行反转录合成cDNA后，溶液中含有DNA和cDNA，以此为模板进行qPCR。用这三种病毒各自的特异引物和由此产生的三种扩增产物共有的特异探针，进行qPCR，不但增强了这三种病毒检测的特异性，而且可以一次性判定所检测的材料是否被这三种病毒中的一种或两种或三种感染。如果需要知道被哪种病毒感染，则在反应混合物中加入特定病毒的引物分别进行qPCR，根据扩增反应结果即可判定。如果需要判定植物样本有无被某特定病毒感染，则在反应混合物中加入该特定病毒的引物进行qPCR，根据扩增反应结果即可判定。

本发明方法适用于中亚特别是中国草莓种苗制备和生产过程中的病毒检测，包括检验病毒脱除效果、检测主要病毒复感程度、判定是否感染主要病毒。本发明方法的性能及优点是准确和高效，可以进行高通量精准检测。

具体实施方式

实施例1

取已确证的携带病毒或无病毒的草莓植株的幼叶片为试验材料，用天根生物科技有限公司（TIANGEN BIOTECH CO. LTD）的DNAsecure 新型植物基因组DNA提取试剂盒（DNAsecure Plant Kit）提取DNA，用该公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）提取RNA，用该公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（FastQuant RT Kit with gDNase）合成cDNA，皆按说明书进行操作。用DNA和cDNA的混合物作为模板，模板量为50uL的qPCR反应溶液中含有1 ng DNA和1 ng cDNA。例如配置总量为50 µL的反应混合物，加入25 µL Roche 公司的2X FastStart TagMan Probe Master，1.25µL本专利所述的浓度为10 µm的探针，本专利所述的六种浓度全为10 µm的引物各1 µL，加PCR级的纯水至15.75 µL，然后混匀并以8 µL分装于qPCR的排管或板管中，加每个样本的DNA和cDNA模板各1 µL，进行扩增反应。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。

结果显示含有病毒的阳性模板在35个循环以前出现阳性扩增产物，无病毒的阴性模板无扩增产物。

实施例2

取已确证的分别携带所述的病毒或无病毒的草莓植株的幼叶片为试验材料，用天根生物科技有限公司（TIANGEN BIOTECH CO. LTD）的RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）提取RNA，在提取过程中不加入DNaseI，因此提取的RNA中混有DNA。用该公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（FastQuant RT Kitwith gDNase）合成cDNA，按说明书进行操作，最后的溶液中含有cDNA 和DNA。用此混合物作为模板，模板量为50 µL的qPCR反应溶液中添加2 µL所述混合物。例如配置总量为50 µL的反应混合物，加入25 µL Roche 公司的2X FastStart TagMan Probe Master，1.25 µL本专利所述的浓度为10 µm的探针，本专利所述的六种浓度全为10 µm的引物各1 µL，加PCR级的纯水至15.75 µL，然后混匀并以8 µL分装于qPCR的排管或板管中，加每个样本的DNA和cDNA模板2 µL，进行扩增反应。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。

实施例3

取山西巨鑫伟业农业科技开发有限公司园区草莓红颜品种45株的幼叶片为试验样本。用天根生物科技有限公司（TIANGEN BIOTECH CO. LTD）的DNAsecure 新型植物基因组DNA提取试剂盒（DNAsecure Plant Kit）提取DNA，用该公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）提取RNA，用该公司的FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（FastQuant RT Kit with gDNase）合成cDNA，皆按说明书进行操作。用DNA和cDNA的混合物作为模板，模板量为50uL的qPCR反应溶液中含有1 ng DNA和1 ngcDNA。配置总量为500 µL的反应混合物，加入250 µL Roche 公司的2X FastStart TagManProbe Master，12.5 µL本专利所述的浓度为10 µm的探针，本专利所述的六种浓度全为10µm的引物各10 µL，加PCR级的纯水至157.5 µL，然后混匀并以8 µL分装于qPCR的排管或板管中进行扩增反应，加样本DNA和cDNA模板各1 µL，每个样本两个平行。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。

qPCR结果显示的阳性和阴性的样本用广泛使用的常规PCR进行验证，qPCR结果为阳性的模板在PCR扩增出了相应的产物，qPCR结果为阴性的模板在PCR反应中没有扩增出相应的产物。

实施例4

取山西巨鑫伟业农业科技开发有限公司园区不同的草莓品种45株的匍匐茎尖进行培养，生成试管苗后取叶片为检测样本。用天根生物科技有限公司（TIANGEN BIOTECHCO. LTD）的DNAsecure 新型植物基因组DNA提取试剂盒（DNAsecure Plant Kit）提取DNA，用该公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant PlusKit）提取RNA，用该公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（FastQuant RT Kit withgDNase）合成cDNA，皆按说明书进行操作。用DNA和cDNA的混合物作为模板，模板量为50uL的qPCR反应溶液中含有1 ng DNA和1 ng cDNA。配置总量为500 µL的反应混合物，加入250 µLRoche 公司的2X FastStart TagMan Probe Master，12.5 µL本专利所述的浓度为10 µm的探针，本专利所述的六种浓度全为10 µm的引物各10 µL，加PCR级的纯水至157.5 µL，然后混匀并以8 µL分装于qPCR的排管或板管中进行扩增反应，加样本DNA和cDNA模板各1 µL，每个样本两个平行。qPCR的反应程序为：95度15分钟-（60度30秒-95度15秒）X 45循环。

qPCR结果显示阳性的样本弃用，阴性的样本留用并作为原种苗进行扩繁，后期的生长和生产显示出长势强和高产，符合无病毒苗应有的特性。

实施例1中，首先分别提取样本DNA和RNA，然后用RNA为模板逆转录为cDNA，在qPCR反应中加入DNA和cDNA为模板，显示本专利所述方法的可靠性。实施例2中，提取RNA过程中不完全去除DNA，逆转录后形成的cDNA中含有DNA，以此为qPCR中的模板，显示本专利所述方法的可靠性。实施例3中，本专利方法使用较大量样本与传统方法对比，显示本专利所述方法的可靠性。实施例4显示本专利所述方法在实际生产中的应用效果。

序列表

序列:

序列号 (ID): 1

长度: 20

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..20

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry vein banding virus

残基:

gggctcttgt agcaccgata 20

序列号 (ID): 2

长度: 20

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..20

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry vein banding virus

残基:

cagttcggct tcttttctgg 20

序列号 (ID): 3

长度: 21

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..21

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mottle virus

残基:

aagattgccg atatggtctc a 21

序列号 (ID): 4

长度: 20

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..20

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mottle virus

残基:

ttctaacgat ggcgttttca 20

序列号 (ID): 5

长度: 20

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..20

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mild yellow edge virus

残基:

gagcctgatg tcgctcaagt 20

序列号 (ID): 6

长度: 20

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..20

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mild yellow edge virus

残基:

taggtacggg ggtcctatcc 20

序列号 (ID): 7

长度: 100

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..100

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry vein banding virus

残基:

aatatatgat agttgggctc ttgtagcacc gataaaacaa aactatcatc accaggcctt 60

ttccaccaga aaagaagccg aactggccct tcaaacatac 100

序列号 (ID): 8

长度: 100

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..100

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mottle virus

残基:

acaccaagag tcttaatgat gaagattgcc gatatggtct caaatttggc tggtgatggt 60

cgtgaaaacg ccatcgttag aagaaatttg atgaagatgg 100

序列号 (ID): 9

长度: 100

分子类型: DNA

特征位置/限定符:

- source, 1..100

> mol_type, genomic DNA

> organism, Strawberry mild yellow edge virus

残基:

ccatacaaaa tattgggttg agcctgatgt cgctcaagtg tatgctggtg atgattctgc 60

ccaggatagg acccccgtac ctaggcccag cttcaacaag 100

END

Claims

1.一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是用基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针（Dual-Labeled Locked Nucleic Acid Probe）的实时荧光定量核酸酶链式反应（qPCR），以脱氧核糖核酸（DNA）和互补脱氧核糖核酸（cDNA）的混合物为模板，用多对病毒特异引物通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被主要病毒感染；

所述的主要病毒是指中国在草莓种植和生产中常见的三种主要草莓病毒，即镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）、斑驳病毒（Strawberry mottle virus）和轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）；通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被一种或两种或三种感染；三种病毒各自的特异引物如下:

用于探测镶脉病毒（Strawberry vein banding virus）的引物

Fv：gggctcttgtagcaccgata，Rv：cagttcggcttcttttctgg，针对如下目标序列扩增71bp片段：

gggctcttgtagcaccgataaaacaaaactatcatcaccaggccttttccaccagaaaagaagccgaactg；

用于探测斑驳病毒（Strawberry mottle virus）的引物Fm：aagattgccgatatggtctca，Rm：ttctaacgatggcgttttca，针对如下目标序列扩增61bp目标片段：aagattgccgatatggtctcaaatttggctggtgatggtcgtgaaaacgccatcgttagaa；

用于探测轻型黄边病毒的引物Fy：gagcctgatgtcgctcaagt，Ry：taggtacgggggtcctatcc，针对如下目标序列扩增64bp片段：gagcctgatgtcgctcaagtgtatgctggtgatgattctgcccaggataggacccccgtaccta；

所述基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针是qPCR反应体系中的探针，为经过荧光标记的锁核酸八聚体，具体是5’-6-FAM-locked C-locked A-locked T-locked C-locked A-locked C-locked C-locked A-BHQ-1-3’或5’-6-FAM-locked T-locked G-locked G-locked T-locked G-locked A-locked T-locked G-BHQ-1-3’。

2.如权利要求1所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是所述草莓材料是用草莓幼叶为材料，提取植物材料及其上所附着的所有微生物包括病毒的总DNA和RNA，并对RNA进行反转录合成cDNA，用DNA和cDNA的混合物为模板进行qPCR；提取RNA时不使用DNA水解酶去除残留的DNA，对RNA进行反转录合成cDNA后，溶液中含有DNA和cDNA，以此为模板进行qPCR；模板的质量用测试Actin基因的DNA和cDNA确证；由于镶脉病毒是DNA病毒，可以直接用其DNA为模板，而斑驳病毒和轻型黄边病毒是RNA病毒，需要其cDNA为模板；为同一PCR反应提供了宏基因组DNA和cDNA模板，并同时加入三种病毒的三对特异引物，这样可以一次性探测三种病毒；由于三对引物的扩增产物较短，长度全部在60-80个核苷酸，扩增反应相对灵敏；同时由于在PCR反应体系中加入了荧光FAM标记的八聚体锁核酸探针，增强了核酸扩增产物的特异性；qPCR的扩增反应用热激活TagDNA聚合酶，此酶在90℃以上被激活，避免低温下可能引起的非特异扩增从而导致的假阳性。

3.如权利要求2所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是提取RNA时不使用DNA水解酶为DNase I。

4.如权利要求1所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是使用商用的热激活Tag酶qPCR预混液，其中包括了热激活TagDNA聚合酶、dNTP、镁离子，以二倍的浓度预配直接使用。

5.如权利要求4所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是商用的热激活Tag酶qPCR预混液是罗氏公司（Roche）生产的2X FastStart TagMan Probe Master，或天根生物科技有限公司生产的2X HotStart Tag MasterMix。

6.如权利要求1所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是以50uL反应混合物的配制，DNA和cDNA模板量为10pg-10ng，根据所检测材料样本的数量配置总量，然后以10uL分装入用于qPCR的排管或板管中进行扩增反应。

7.如权利要求6所述的快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，其特征是配制总量为50uL的反应混合物需要加入25uL二倍的热激活Tag酶qPCR预混液，1.25µL浓度为10µm的如权利要求1所述的探针，六种浓度全为10µm的如权利要求1所述的引物各1µL，DNA和cDNA模板1-5µL，加PCR级的纯水至50µL，然后混匀并以10uL分装于qPCR的排管或板管中进行扩增反应；qPCR的反应程序为：95℃15分钟；60℃30秒，95℃15秒，45个循环。