CN106755579B - 一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重pcr检测及预警方法 - Google Patents

一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重pcr检测及预警方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测及预警方法。本发明了针对SPCSV和Sweepoviruses两类病毒，设计特异性引物对CP‑F和CP‑R、引物对VF和VR，检测引物具有很好的特异性，仅能从目标病毒样品中扩增到特异大小的条带。本发明利用多重PCR引物建立的甘薯SPCSV和Sweepoviruses病毒的检测方法，能够通过一次PCR反应，同时检测甘薯块根中是否存在SPCSV和Sweepoviruses两类甘薯病毒，建立了一种根据甘薯种薯是否带毒，进一步判断种薯质量的预警方法。本发明明确了甘薯块根带毒与甘薯苗期、大田期病毒症状及产量损失的关系，为通过检测种薯是否携带病毒，进而判断种薯质量是否合格提供了依据，对于脱毒甘薯种薯质量和病害流行预警具有重要意义。

Description

一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重 PCR检测及预警方法
技术领域
本发明涉及一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测引物、方法及脱毒种薯质量预警方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
甘薯是我国重要的粮食作物，也是重要的食品加工和工业原料。我国是世界上最大的甘薯生产国，甘薯种植面积占全世界种植面积的45％左右。病毒病是危害甘薯的一类重要病害，可造成严重的产量损失和种性退化。目前全世界已报道侵染甘薯的病毒有30余种，其中，甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)和甘薯双生病毒(Sweepoviruses)是侵染甘薯的两类重要病毒，SPCSV侵染甘薯一般可引起15-88％的产量损失，特别是SPCSV可与多种病毒复合侵染甘薯形成协生病害，引起更严重的产量损失，甚至绝收。侵染甘薯的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒与侵染其它植物的Begomovirus明显不同，把这类病毒称之为“Sweepoviruses”。Sweepoviruses是甘薯上的一类重要病毒，据研究，我国甘薯上至少存在10种Sweepoviruses，包括SPLCV、SPLCCNV、SPLCGoV、SPLCCaV、SPLCShV、SPLCCSV、SPLCHnV、SPLCHnSV、SPLCGxV和SPLCJsV。甘薯双生病毒侵染甘薯一般可引起11-86％的产量损失，对甘薯生产危害很大。目前对甘薯病毒病尚无特别有效的化学防治方法，种植脱毒甘薯是防治病毒病最经济有效的方法。在培育和推广种植脱毒甘薯的过程中，需要对脱毒种薯种苗进行严格的病毒检测，只有经过检测不含病毒，特别是不含SPCSV和Sweepoviruses的种薯种苗才能在生产上推广应用，否则会引起产量损失和病毒病的流行和扩散蔓延。目前对SPCSV和Sweepoviruses的检测主要采用血清学方法或单一PCR方法。单一PCR方法需多次进行PCR，成本高，效率低，特别是甘薯块根中由于淀粉和多糖含量高，严重影响核酸提取质量和病毒的检测效率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测及预警方法，该方法一次PCR反应，可检测甘薯块根中是否存在SPCSV和Sweepoviruses两类甘薯病毒，有效地提高了检测效率，降低了检测成本。同时，本发明可通过检测种薯是否携带病毒，进而判断种薯质量是否合格，为脱毒甘薯种薯质量预警提供了一种方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR引物，所述的多重PCR引物包括引物对CP-F和CP-R、引物对VF和VR；其中，各引物对的序列如下：
CP-F：5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’
CP-R：5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’
VF：5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’
VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。
一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)提取甘薯块根的总RNA和总DNA；
(2)以甘薯块根总RNA为模板进行反转录，得到反转录产物cDNA；
(3)以反转录产物cDNA和甘薯块根总DNA为模板，利用多重PCR引物，进行PCR扩增；
(4)对PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果进行判定。
所述的多重PCR引物包括引物对CP-F和CP-R、引物对VF和VR；其中，各引物对的序列如下：
CP-F：5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’
CP-R：5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’
VF：5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’
VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。
步骤(2)中反转录的反应体系为10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反转录Buffer2μL、200U/μL反转录酶0.5μL、40U/μL RNase抑制剂0.25μL、10μmol/μL引物CP-R 0.5μL、200ng/μL总RNA 5.75μL。
反应程序为：42℃反转录40min，99℃5min，5℃5min。
步骤(3)中PCR扩增的反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μL引物CP-R各为0.5μL、10μmol/μL引物VF和10μmol/μL引物VR各为1μL、cDNA0.5μL、200ng/μL DNA 1μL，ddH2O补足20μL。
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57.6℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳判定结果为：当出现774bp大小的电泳条带时，说明甘薯块根携带甘薯褪绿矮化病毒；当出现194bp大小的电泳条带时，说明甘薯块根携带甘薯双生病毒；当同时出现774bp和194bp两个条带时说明甘薯块根携带甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒两类病毒。
一种利用多重PCR检测方法的甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的预警方法，当电泳结果出现774bp和194bp任何一个条带或同时出现两个条带时，说明甘薯块根携带病毒，可判断为不合格脱毒种薯，不能用于生产育苗。
本发明的有益效果：
1、本发明了针对SPCSV和Sweepoviruses两类病毒，设计特异性引物对CP-F和CP-R、引物对VF和VR，检测引物具有很好的特异性，仅能从目标病毒样品中扩增到特异大小的条带，不能从相近病毒或其他病原中检测到条带。
2、本发明利用多重PCR引物建立的甘薯SPCSV和Sweepoviruses病毒的检测方法，能够通过一次PCR反应，同时检测甘薯块根中是否存在SPCSV和Sweepoviruses两类甘薯病毒，建立了一种根据甘薯种薯是否带毒，进一步判断种薯质量的预警方法。
3、本发明明确了甘薯块根带毒与甘薯苗期、大田期病毒症状及产量损失的关系，为通过检测种薯是否携带病毒，进而判断种薯质量是否合格提供了依据，对于脱毒甘薯种薯质量和病害流行预警具有重要意义。
4、本发明的方法不仅可用于种薯(块根)的检测，也可用于薯苗的检测。
附图说明
图1为不同引物浓度对多重PCR检测结果的影响。其中，M为Marker，1-6分别对应引物浓度处理(1)-(6)。
图2为不同退火温度对多重PCR检测结果的影响。其中，M为Marker，1-8分别对应从低到高的退火温度。
图3为不同模板浓度对多重PCR检测结果的影响。其中，M为Marker，1-5分别对应模板浓度处理(1)-(5)。
图4为多重PCR和单一PCR的检测结果比较。其中，(1)为多重PCR；(2)为单一PCR(SPCSV)；(3)为单一PCR(Sweepoviruses)。
图5为多重PCR引物的特异性试验。其中M为Marker，1、2为含SPCSV和Sweepoviruses的薯块，3为含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯块。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1一种同时检测甘薯块根中褪绿矮化病毒(SPCSV)和双生病毒(Sweepoviruses)的多重PCR方法
(一)材料和方法
1、病毒材料与取样方法
田间收获并保存的病株薯块，分别为单含SPCSV、单含Sweepoviruses、同时含有SPCSV和Sweepoviruses的薯块以及含甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和/或潜隐病毒(SPLV)等混合病毒的薯块。检测前用消毒的解剖刀片横切甘薯块根结薯端2-3cm处，挖取薯肉用于检测。
2、引物的合成
3、核酸的提取
甘薯块根总RNA提取用Gene Mark公司生产的植物总RNA提取试剂盒，按照RNALysisSolution B说明书步骤进行。甘薯块根总DNA提取用美国OMEGA公司生产的植物总DNA提取试剂盒，按照提取说明书步骤进行。RNA反转录试剂盒以及其它PCR产品为TAKARA公司的产品。
4、单一PCR反应体系
以单含SPCSV的甘薯块根总RNA为模板进行反转录，得到反转录产物cDNA。反转录(RT)反应体系为10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反转录Buffer 2μL、200U/μL反转录酶0.5μL、40U/μL RNase抑制剂0.25μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、200ng/μL总RNA5.75μL。
RT反应程序为42℃反转录40min，99℃5min，5℃5min。
SPCSV的鉴定：以反转录产物cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM(version 2.0)10μL、10μmol/μL CP-F 0.5μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、cDNA2μL，ddH2O补足20μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。
Sweepoviruses的鉴定：以单含Sweepoviruses的甘薯块根总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/μL VR 1μL、10μmol/μL VF 1μL、200ng/μL DNA模板1μL，ddH2O补足20μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
5、多重RT-PCR反应条件筛选
以同时含有SPCSV和Sweepoviruses的甘薯块根为样品，进行多重RT-PCR反应条件筛选。
在其他条件不变情况下，筛选合适的引物浓度，共设6个处理：(1)CP-F 0.5μL，CP-R0.5μL，VF 1μL，VR 1μL；(2)CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 0.5μL，VR 0.5μL；(3)CP-F 0.8μL，CP-R 0.8μL，VF 1.2μL，VR 1.2μL；(4)CP-F 1μL，CP-R 1μL，VF 1μL，VR 1μL；(5)CP-F1.5μL，CP-R 1.5μL，VF 0.5μL，VR 0.5μL；(6)CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 1.5μL，VR 1.5μL。
其他条件不变，筛选退火温度，设置8个处理：48℃、50.4℃、51.8℃、54.7℃、56.2℃、57.6℃、58.8℃、60℃。
其他条件不变，筛选模板浓度，设置5个处理，(1)cDNA 0.5μL，DNA 1μL；(2)cDNA0.5μL，DNA 0.5μL；(3)cDNA 0.5μL，DNA0.8μL；(4)cDNA 1μL，DNA 1μL；(5)cDNA0.8μL，DNA 1.2μL。
6、多重PCR体系的建立
在单一PCR的基础上，分别对引物浓度、退火温度、模板浓度等条件进行优化，建立同时检测两类病毒的多重PCR体系。
7、PCR产物的电泳分析
用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，90V稳压电泳50min，EB染色，凝胶成像仪观察拍照。
8、多重PCR的特异性检测
利用建立的多重PCR方法对含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯块进行检测。
(二)结果与分析
1、多重PCR反应条件筛选
为了确定多重PCR的最优反应条件，分别对引物浓度、退火温度、模板浓度等进行了筛选。结果表明，设置的6个引物浓度都能扩增出目的条带，考虑条带的清晰程度和成本，选择最佳引物浓度为CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 1μL，VR 1μL(见附图1)。设置的8个温度都能扩增出目的片段，但当退火温度54.7℃-58.8℃能够更清晰扩增出目的条带(见附图2)。cDNA和DNA模板设置了5个浓度，结果表明cDNA 0.5μL和DNA 1μL，cDNA0.5μL和DNA0.8μL，cDNA 1μL和DNA 1μL能扩增出清晰目的片段，综合考虑目的条带的清晰度和成本，最佳模板浓度为cDNA 0.5μL和DNA 1μL(见附图3)。
2、多重PCR同时检测SPCSV和Sweepoviruses体系的建立
根据不同条件对试验结果的影响，综合考虑扩增效果和试验成本，最终优化的多重PCR反应体系为：
反转录的反应体系为10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反转录Buffer 2μL、200U/μL反转录酶0.5μL、40U/μL RNase抑制剂0.25μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、200ng/μL总RNA 5.75μL。RT反应程序为42℃反转录40min，99℃5min，5℃5min。
多重PCR反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μLCP-R各为0.5μL、10μmol/μL引物VR和10μmol/μL VF各为1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA1μL，ddH2O补足20μL。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57.6℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
3、多重PCR同时检测SPCSV和Sweepoviruses的应用
利用建立的多重PCR体系对薯块样品进行检测，检测结果与单一PCR的检测结果一致(见附图4)。
4、多重PCR的特异性检测
以含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯块为材料提取RNA，反转录后进行PCR扩增，结果表明，含SPCSV和Sweepoviruses病毒薯块均能扩增出目的条带，而从含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯块中未扩增出任何条带，说明建立的多重PCR方法有较好的特异性。(见附图5)。
实施例2种薯带毒对甘薯植株苗期和大田期症状及产量的影响
1、材料与方法
实验室薯窖保存的发病田薯块，随机取100个，品种为商薯19。
利用建立的检测方法分别对100个薯块进行病毒检测，然后将这100个薯块分别在装有蛭石的花盆中进行育苗，观察苗期症状，并把每个薯块长出的薯苗移栽到大田种植，每个薯块的薯苗种植一个小区，小区随机排列，共100个小区，大田期定期观察记载植株症状，调查每小区的病害严重度，收获期进行产量测定。
2、结果与分析
(1)薯块病毒检测结果
试验结果表明，100个薯块中，检测单含SPCSV的有26份，单含Sweepoviruses病毒的有17份，同时检测到含SPCSV和Sweepoviruses两类病毒的有51份，未检测到两类病毒的有6份。
(2)不同处理的症状表现
苗期症状观察结果表明，检测单含SPCSV和同时含SPCSV和Sweepoviruses两类病毒的薯块，苗期症状有叶片褪绿、皱缩、明脉、植株矮化等症状，单含SPCSV薯块的薯苗显症率为100％，同时含SPCSV和Sweepoviruses两类病毒的显症率为100％；单含Sweepoviruses薯块的薯苗症状较轻微，主要为皱缩和叶片褪绿，但显症率仍为100％。
移栽大田后45天调查结果表明，单含SPCSV和同时含SPCSV、Sweepoviruses两类病毒的症状主要有叶片褪绿、皱缩、明脉、植株矮化等，单含SPCSV和同时含SPCSV、Sweepoviruses两类病毒的小区显症率均为100％，单含Sweepoviruses的症状主要有褪绿、皱缩、明脉、植株矮化等，显症率为34％；未检测到两类病毒的健康薯块的植株均未表现症状。
(3)不同处理的产量损失情况
测产结果表明，单含SPCSV小区的产量损失为52.6-93.9％；同时含SPCSV和Sweepoviruses小区的产量损失为25.9-98.3％；单含Sweepoviruses小区的产量损失为1.7-97.4％。
(4)结论
检测单含SPCSV或Sweepoviruses以及同时含SPCSV和Sweepoviruses病毒薯块育出的薯苗与健康薯块育出的薯苗相比，都有不同程度的产量损失或表现不同类型的病毒症状，因此，通过检测薯块是否携带病毒，可判断种薯能否用于生产，为种薯质量安全提供预警。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测及预警方
法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgagtatgg ctgatagcac taa 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgaagacct gttccagtca act 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtaagcgtgt ttgtgtgaag t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccattcgga tcttagcagt agt 23

Claims (6)

1.一种检测甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述的多重PCR引物包括引物对CP-F和CP-R、引物对VF和VR；其中，各引物对的序列如下：
CP-F：5’— ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’
CP-R：5’— GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’
VF：5’— GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’
VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。
2.一种甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取甘薯块根的总RNA和总DNA；
（2）以甘薯块根总RNA为模板进行反转录，得到反转录产物cDNA；
（3）以反转录产物cDNA和甘薯块根总DNA为模板，利用多重PCR引物，进行PCR扩增；
（4）对PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果进行判定；
所述的多重PCR引物包括引物对CP-F和CP-R、引物对VF和VR；其中，各引物对的序列如下：
CP-F：5’— ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’
CP-R：5’— GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’
VF：5’— GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’
VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。
3.根据权利要求2所述的甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）中反转录的反应体系为10μL：10mM each dNTP 混合物1μL、5×反转录Buffer 2μL、200U/μL反转录酶0.5μL、40 U/μL RNase抑制剂0.25μL、10μmol/μL引物CP-R 0.5μL、200ng/μL总RNA 5.75μL；
反应程序为：42℃反转录40min，99℃ 5min，5℃ 5min。
4.根据权利要求2所述的甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中PCR扩增的反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μL引物 CP-R各为0.5μL、10μmol/μL引物VF 和10μmol/μL 引物VR各为1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA 1μL，ddH2O补足20μL；
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57.6℃退火40s，72 ℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2-4任一项所述的甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳判定结果为：当出现774bp大小的电泳条带时，说明甘薯块根携带甘薯褪绿矮化病毒；当出现194bp大小的电泳条带时，说明甘薯块根携带甘薯双生病毒；当同时出现774bp和194bp两个条带时说明甘薯块根携带甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒两类病毒。
6.一种利用权利要求5所述的多重PCR检测方法的甘薯块根中甘薯褪绿矮化病毒和甘薯双生病毒的预警方法，其特征在于，当电泳结果出现774bp和194bp任何一个条带或同时出现两个条带时，说明甘薯块根携带病毒，可判断为不合格脱毒种薯，不能用于生产育苗。
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