CN102108419B

CN102108419B - 甘薯病毒病害spvd的多重rt-pcr检测方法

Info

Publication number: CN102108419B
Application number: CN201010565665A
Authority: CN
Inventors: 张振臣; 张盼; 张德胜; 乔奇; 秦艳红; 田雨婷; 郑文明; 王永江
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102108419A

Abstract

本发明涉及一种危险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，先分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒的引物、甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物，然后提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；将上述引物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；PCR反应程序为：94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环，最后72℃延伸10min；最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出甘薯病毒病害SPVD是否存在的方法，并且可有效区分SPFMV的株系类型，检测效率提高，并能对SPVD的危险程度及时预警，为该病防控提供可靠依据。

Description

甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法

技术领域

本发明涉及甘薯病毒的RT-PCR检测，属于生物工程技术领域，特别是涉及一种危险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法。

背景技术：

甘薯病毒病害（Sweet potato virus diseases，SPVD)是由甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD是上世纪70年代首先在非洲发现，目前主要分布在非洲和南美的一些国家。感染SPVD的甘薯表现为植株矮化、叶片褪绿、扭曲变形、脉明等症状。该病对甘薯产量影响极大，在非洲，病害严重时可造成减产80%以上，甚至绝收，SPVD是甘薯上最危险的病害之一。目前，发明人已在我国的广东、四川、江苏等地首次检测到SPVD的存在，为了加强对该病的预警和控制，防止该病的进一步蔓延危害，必须建立快速、高效的检测技术。

目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附（ELISA）技术和PCR技术，由于ELISA技术的灵敏度较低，而且需要分别检测SPCSV 和SPFMV才能确定SPVD是否存在。另外SPFMV在中国至少存在CH和CH2两个株系类型，由于SPCSV与SPFMV不同的株系类型互作可能引起不同的产量损失，利用ELISA方法还不能有效区分SPFMV不同株系。而利用单一的RT-PCR进行检测时，也需要分别对SPCSV 和SPFMV进行检测才能确定SPVD是否存在，工作量大，效率低。

发明内容：

本发明要解决的技术问题：克服现有的甘薯病毒检测的缺点，提供一种在一次PCR反应中检测危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在以及存在类型的方法，为甘薯病毒的特异性检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。

本发明的技术方案是：

甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV 1和CSV 2；甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2；甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH，甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上游引物FMVCH2，所述引物序列为：

CSV 1：5＇-AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3＇，

CSV 2：5＇-GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3＇，

FMV 1：5＇-GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3＇，

FMV 2：5＇-GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3＇，

FMVCH：5＇-GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3＇，

FMVCH2：5＇- CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3＇，

其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C；

（2）提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（3）将所述CSV 1、CSV 2、FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2引物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

所述反转录时的反应体系为10μl，包括：2μl 5×RT buffer，1μl 浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μl浓度各为10mmol/L的 dNTP混合物，CSV 2引物0.5μl，FMV 2引物0.5μl，0.25μl浓度为40U/μl的抑制剂，0.5μl浓度为5U/μl的反转录酶，4.25μl 甘薯叶片的总RNA；所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10μmol/L。

所述PCR反应体系为25μl，包括：2.5μl 10×PCR buffer，0.3μl浓度为5U/μl 的Taq 酶，2μl浓度各为2.5mmol/L的 dNTP混合物，1.3μl 浓度为25mmol/L 的 MgCl₂溶液，CSV 1引物0.5μl、CSV 2引物0.5μl、FMV 1引物0.2μl、FMV2引物1.3μl、FMVCH引物0.3μl、FMVCH2引物0.5μl，所述引物浓度均为10μmol/L，用2μl反转录产物作模板，用DEPC- H₂O 补足至25μl。

所述反转录时反应程序为：42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s, 30个循环，最后72℃ 延伸10min。

本发明的有益效果：

（1）本发明建立了在一次PCR反应中即可检测出危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在的方法，并且可有效区分SPFMV的株系类型，能对SPVD的危险程度及时预警，为该病的防控提供可靠依据。而目前单一的RT-PCR检测，需要分别对SPCSV 和SPFMV进行检测才能确定SPVD是否存在，本发明的检测方法的工作量大大降低，工作效率大大提高。

（2）本发明利用建立的多重RT-PCR体系对疑似SPVD病毒甘薯样品进行检测，检测结果与单一的RT-PCR检测结果一致，进一步证明了本发明方法的可行性。

（3）本发明可应用于脱毒甘薯的培育过程中，通过对SPVD的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果。

（4）本发明可有效区分甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）的株系类型，及时对SPVD的危险程度进行预警，可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中，防止该病的进一步扩散。

附图说明：

图1：多重PCR反应中引物浓度对实验结果的影响

图中1-6分别表示4种上游引物FMV1、FMVCH、FMVCH2、CSV1的比例分别为0.2:0.2:0.4:0.4、0.2:0.4:0.4:0.4、0.2:0.4:0.6:0.6、0.3:0.3:0.6:0.6、0.2:0.4:0.4:0.4、0.2:0.4:0.6:0.6。

图2：多重PCR反应中退火温度对实验结果的影响

图中1-6分别表示退火温度为：50.0℃、51.9℃、53.7℃、56.1℃、58.0℃和60.0℃。

图3：多重PCR反应中dNTP 混合物浓度对实验结果的影响

图中1-6分别表示dNTP浓度为：0μl、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl。

图4：多重PCR反应中Mg²⁺浓度对实验结果的影响

图中1-6分别表示Mg²⁺浓度为：0μl、0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl。

图5：多重PCR反应中酶浓度对实验结果的影响

图中1-6分别表示0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl。

图6：多重和单一RT-PCR检测结果比较

图中1-5分别表示：引物混扩增、FMVCH2引物扩增、FMVCH引物扩增、CSV引物扩增、FMV通用引物扩增。

图7：多重RT-PCR的特异性检测结果

图中1-5分别表示：混样、苏-10-34、苏-10-45、渝-10-1、阴性对照。

图8：多重RT-PCR的灵敏性测试结果

图中1-7分别表示：叶片总RNA、10^-1倍稀释、10^-2倍稀释、10^-3倍稀释、10^-4倍稀释、10^-5倍稀释、10^-6倍稀释。

具体实施方式：

以下结合实施例详细说明本发明，其中出现的百分比浓度如无特别说明，均指质量百分比浓度。

实施例1：甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法

（一）材料和方法

1、引物的设计与合成：

根据SPCSV和SPFMV 病毒的基因组序列，设计以下引物，引物由TaKaRa公司合成。引物序列见下表1。

注：其中Y=C/T，D=G/A/T，R=A/G，M=A/C。

2、病毒材料

分别在广东、四川、江苏等地采集有典型SPVD症状的甘薯茎曼栽种于防虫温室中，分别利用血清学方法和单一PCR方法检测SPCSV和SPFMV，以确定SPVD病毒，并通过核苷酸测序确定SPFMV的株系类型，最后选定若干株SPVD感病甘薯植株，备用。

3、酶及试剂(盒)

UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒购自上海生物工程公司，RT-PCR试剂盒[TaKaRa RNA PCR Kit，AMV Ver.3.0]购自TaKaRa公司。

4、核酸提取

利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式总RNA抽提试剂盒，按照其说明书的方法，提取感病甘薯叶片的总RNA。

5、单一RT-PCR：

（1）反转录（RT）：反转录反应体系为10μl，包括2μl 5×RT buffer，1μl MgCl₂(25mmol/L)，1μl dNTP 混合物(各10mmol/L), 0.5μl SPCSV的通用引物CSV 2，0.5μl SPFMV的通用引物FMV 2，0.25μl RNase抑制剂（40U/μl），0.5μl反转录酶（AMV Reverse Transcrptase）（5U/μl），4.25μl样品RNA。反应程序为：42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min。

（2）PCR：反应体系为25μl，包括2.5μl 10×PCR buffer（Mg²⁺-），0.2μl Taq 酶（5U/μl），0.4μl上游特异性引物（CSV 1、FMV 1、FMVCH或FMVCH2）(10μmol/L)，0.4μl下游特异性引物（CSV 2或FMV 2）(10μmol/L，1μl dNTP混合物(各2.5mmol/L)，MgCl₂(25mmol/L) 1μl；以2μl反转录产物为模板，用DEPC- H₂O补足至25μl。

反应程序为: 94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃ 延伸10min。

6、多重PCR反应条件的初步筛选

在检测 SPFMV 和SPCSV 的单一RT-PCR反应体系基础上，建立同时检测这两种病原的多重RT-PCR反应体系。

在有效的RT- PCR 条件下，RT条件不变，对多重PCR的各引物浓度、TaqDNA 聚合酶量、退火温度、dNTPs 浓度、Mg²⁺等主要影响因子进行优化，筛选出多重 PCR反应体系的最佳反应体系。在优化某一影响因素时，其它因素不变。

PCR反应体系为25μl。

退火温度：分别设50.0℃、51.9℃、53.7℃、56.1℃、58.0℃和60.0℃ 6个处理；

dNTP 混合物(各2.5mmol/L)浓度：分别设0μl、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl 6个处理；

MgCl₂浓度（25mmol/L）：分别设0μl、0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl 6个处理，Taq 酶（5U/μl)浓度：分别设0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl 6个处理；

引物浓度(10μmol/L)设6个处理，4种上游引物的比例分别为FMV1: FMVCH: FMVCH2:CSV1：（1）0.2:0.2:0.4:0.4 （2）0.2:0.4:0.4:0.4 （3）0.2:0.4:0.6:0.6 （4）0.3:0.3:0.6:0.6，其中下游引物加入量与上游引物对应；（5）0.2:0.4:0.4:0.4，其中FMV2引物加入量为1.3μl；（6）0.2:0.4:0.6:0.6，其中FMV2下游引物加入量为1.5μl。

以单一RT-PCR反应体系为基础，通过调节上述参数，筛选和优化多重PCR反应体系。

7、多重RT-PCR体系的建立

（1）反转录（RT）：与单一RT-PCR的反转录反应相同；

（2）PCR反应体系：在单一RT-PCR的基础上，分别对引物浓度、Taq酶浓度、MgCl₂浓度和退火温度等条件进行优化。

8、PCR产物的电泳分析

用含EB的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。上样量为5μl，80V稳压电泳40 min，EB染色，凝胶成像仪观察拍照。

（二）结果与分析

1、多重RT-PCR反应条件的筛选

为确定多重PCR的最优反应条件，分别对引物浓度、退火温度、dNTPs 浓度、Mg²⁺浓度和Taq DNA聚合酶量进行系列对比试验。

引物浓度：6种不同的FMV、FMVCH、FMVCH2 和CSV引物用量组合的PCR结果显示，几个引物用量组合效果都较好，但考虑到实际应用中，SPFMV和SPCSV对甘薯共同侵染时，SPCSV能使SPFMV得含量显著升高，而本身含量却显著降低，且SPFMV的两类株系并不一定同时与SPCSV共同侵染的现实情况，本实验选择引物量组合为0.5μl CSV 1引物，0.5μl CSV 2引物，0.2μl FMV 1引物，1.3μl FMV2引物，0.3μl FMVCH引物，0.5μl FMVCH2引物作为最佳引物浓度 (参见图 1)。

退火温度：结果显示，退火温度在 50～56℃范围内，都能比较好的扩增出四条目的带，综合考虑，本试验选择54 ℃为最佳退火温度 (参见图 2)。

dNTPs 浓度梯度：结果显示，当 dNTPs 加入量低于0.5μl时，不能很好地扩出所有目的条带，而加入量达到0.5μl后则能够扩出全部目的条带，并且随浓度的增加四种目的条带越来越亮，但加入量达到1.5μl后目的条带则没有太大变化。本实验选择2.0μl作为最佳的dNTPs 浓度 (参见图 3)。

Mg²⁺浓度梯度：结果显示，当 Mg²⁺加入量低于0.5μl时不能扩增出目的条带，当Mg²⁺加入量达到0.5 μl后就能够扩出全部条带，并且随浓度的增加四种目的条带越来越亮，但当 Mg²⁺加入量高于2.5μl时，各目的条带的亮度反而变弱。综合考虑，选择Mg²⁺最佳加入量为1.3μl (参见图 4)。

Taq DNA聚合酶量梯度: 结果显示，当 Taq DNA聚合酶加入量为0.2μl时，就能清晰地扩出各条目的条带，随着酶量的增加，目的条带没有很大变化，本试验选择0.3μl进行下面的实验 (参见图 5)。

2、多重RT-PCR的特异性测验

选取在我国江苏、重庆等地采集的病毒样品（编号分别为：苏-10-34、苏-10-45、渝-10-1）及阴性对照甘薯样品提取总RNA，进行多重RT-PCR检测，其中血清学检测苏-10-34、苏-10-45甘薯样品中含有SPCSV和SPFMV两种病毒，而渝-10-1甘薯样品中含有SPFMV、SPLV、SPVG、SPCFV 、CMV等病毒。结果显示：苏-10-34为SPFMV-CH2与SPCSV两种病毒共同侵染，苏-10-45为SPFMV-CH和SPCSV两种病毒共同侵染，渝-10-1同时含有SPFMV的两类株系。检测结果与血清学检测结果一致 (参见图7)。

3、多重RT-PCR的灵敏性测验

从受SPVD侵染的甘薯叶片中提取总RNA，经过核酸蛋白分析仪测定并计算出总RNA的浓度为1619.6ng/μl，对总RNA进行10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6一系列稀释，经过多重RT-PCR扩增，观察电泳结果，分析多重RT-PCR检测的灵敏性。

结果表明，能同时检测出3种病毒的总RNA最大稀释限度为10^-3，即该体系最低能从总RNA浓度为1619.6ng/ml的样品中检测出2种病毒的存在(参见图8)。

4、甘薯病毒病害SPVD多重RT-PCR检测方法的建立

根据不同参数对实验结果的影响，综合考虑实验结果和实验成本，最终优化的多重RT-PCR反应体系为：

PCR反应体系为25μl：包括2.5μl 10×PCR buffer（Mg²⁺-），0.3μl Taq 酶（5U/μl）, 2μl dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，MgCl₂(25mmol/L) 1.3μl，0.5μl CSV 1引物，0.5μl CSV 2引物，0.2μl FMV 1引物，1.3μl FMV2引物，0.3μl FMVCH引物，0.5μl FMVCH2引物，2μl反转录产物作模板，用DEPC- H₂O 补足至25μl。

反应程序为: 94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s, 30个循环，最后72℃ 延伸10min。

5、甘薯病毒病害SPVD多重RT-PCR检测方法的应用

利用建立的多重RT-PCR体系对采自广东、四川等地的疑似SPVD甘薯样品进行检测，检测结果与单一RT-PCR的检测结果一致（参见图6）。

Claims

1.甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，

CSV 1：5＇-AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3＇，

CSV 2：5＇-GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3＇，

FMV 1：5＇-GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3＇，

FMV 2：5＇-GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3＇，

FMVCH：5＇-GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3＇，

FMVCH2：5＇- CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3＇，

其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C；

（2）提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录，所述反转录时的反应体系为：2μl 5×RT buffer，1μl 浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μl浓度各为10mmol/L的 dNTP混合物，CSV 2引物0.5μl，FMV 2引物0.5μl，0.25μl浓度为40U/μl的RNase抑制剂，0.5μl浓度为5U/μl的反转录酶，4.25μl 甘薯叶片的总RNA；所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10μmol/L；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：2.5μl 10×PCR buffer，0.3μl浓度为5U/μl 的Taq 酶，2μl浓度各为2.5mmol/L的 dNTP混合物，1.3μl 浓度为25mmol/L 的 MgCl₂溶液，CSV 1引物0.5μl、CSV 2引物0.5μl、FMV 1引物0.2μl、FMV2引物1.3μl、FMVCH引物0.3μl、FMVCH2引物0.5μl，所述引物浓度均为10μmol/L，用2μl反转录产物作模板，用DEPC- H₂O 补足至25μl。

3.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录时反应程序为：42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。

4.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s, 30个循环，最后72℃ 延伸10min。