CN104450977B - 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法 - Google Patents

用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104450977B
CN104450977B CN201510004529.5A CN201510004529A CN104450977B CN 104450977 B CN104450977 B CN 104450977B CN 201510004529 A CN201510004529 A CN 201510004529A CN 104450977 B CN104450977 B CN 104450977B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
detection
seq
primer
sweet potato
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510004529.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104450977A (zh
Inventor
张凯
王季春
卢会翔
唐道彬
吕长文
赵勇
刘勋
黄远新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN201510004529.5A priority Critical patent/CN104450977B/zh
Publication of CN104450977A publication Critical patent/CN104450977A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104450977B publication Critical patent/CN104450977B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物及检测方法，检测引物包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，具体序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示，该引物能够同时检测甘薯SPVD病毒病的2种复合侵染病毒SPCSV和SPMFV，具有快速简单、灵敏度高、特异性强等优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的缺陷，具有很好的应用前景。

Description

用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR检测的引物，还涉及含有检测引物的试剂盒和检测方法。
背景技术
甘薯病毒病(Sweet potato virus disease，SPVD)是由甘薯褪绿矮化病毒(sweet potatocholotic stunt virus，SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。感染SPVD的甘薯表现叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉以及植株严重矮化等症状。SPVD对甘薯产量影响极大，可使甘薯减产50％～98％，严重时可造成90％以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯上的毁灭性病害。2012-2013年度SPVD病毒病在我国大面积爆发，在重庆地区爆发造成了严重的影响；因此，建立一种简便、快速、有效的检测SPVD的方法，对于该病的预警和防治具有重要意义。
目前用于甘薯病毒检测目前检测手段有病状学诊断、指示植物检测法、电子显微镜检测法、血清学检测，较为常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术。由于ELISA技术的灵敏度较低，而且SPLV、SPVG和SPFMV 3种病毒的抗体之间常常有交互反应，不能对3种病毒进行特异性检测。而利用单一的RT-PCR检测方法对多种病毒进行检测时，工作量大，效率低。因此，急需建立一种在一次PCR反应中同时检测上述3种甘薯病毒的多重方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物；本发明的目的之二在于提供含有上述检测引物的试剂盒；本发明的目的之三在于提供利用上述试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2、含有所述检测引物的检测试剂盒。
进一步，所熟检测试剂盒还包括内标基因检测引物，所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因，所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。
3、利用所述检测试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法，包括如下步骤：
(1)提取检测样品和对照样品总RNA，反转合成第一链cDNA，备用；
(2)根据甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因设计荧光定量PCR的检测引物和内标基因检测引物，然后以步骤(1)合成的第一链cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
(3)比对检测样品和对照样品的Ct值计算甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的相对表达量。
进一步，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。
进一步，所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因。
进一步，所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。
进一步，所述荧光定量PCR的扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，50个热循环。
本发明的有益效果在于：本发明公开了用于甘薯SPVD病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，该引物能够通过荧光定量检测甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的转录水平，能够同时检测甘薯褪绿矮化病毒SPCSV和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV感染。将检测引物构建成检测试剂盒后能够简单、高效、低成本检测甘薯SPVD病毒病，并且灵敏度高于血清学检测。解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的缺陷，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为两种内参基因的溶解曲线(1.IbH2B基因，2IbUBI基因)。
图2为6对荧光定量PCR引物的筛选(a：引物组合FSPCSV-1Q和RSPCSV-1Q检测结果；b：引物组合FSPCSV-2Q和RSPCSV-2Q检测结果；c：引物组合FSPFMV-1Q+RSPFMV-1Q检测结果；d：引物组合FSPFMV-2Q+RSPFMV-2Q检测结果；e：引物组合FSPFMV-3Q+RSPFMV-3Q检测结果；f：引物组合FSPFMV-3Q+RSPFMV-2Q检测结果)。
图3为荧光定量PCR检测结果(A：SPFMV；B：SPCSV，a表示C198-1，b表示C198-2，c表示0841-14-1，d表示0841-14-1，e表示0841-14-2，f表示0841-14-3，g表示浙255，h表示渝薯6号顶部幼嫩叶片，i表示渝薯6号底部老叶，j表示宁紫薯1号-1顶部幼嫩叶片、k表示宁紫薯1号-1底部老叶，l表示宁紫薯1号-2，m表示1036-1，n表示1041-7，o表示徐薯22)。
图4为SPFMV和SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附检测结果(a表示C198-1，b表示C198-2，c表示0841-14-1，d表示0841-14-1，e表示0841-14-2，f表示0841-14-3，g表示浙255，h表示渝薯6号顶部幼嫩叶片，i表示渝薯6号底部老叶，j表示宁紫薯1号-1顶部幼嫩叶片、k表示宁紫薯1号-1底部老叶，l表示宁紫薯1号-2，m表示1036-1，n表示1041-7，o表示徐薯22)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、甘薯样品的采集
于2013～2014年，从我国重庆市万州、北碚歇马、漕上基地田间采集甘薯品种/系渝薯6号、浙薯255、宁紫薯1号、徐薯22、C198、0841-14、1036-1、1041-7的顶部幼嫩叶片和底部老叶共14份具有SPVD病毒病典型症状的植株，其主要症状表现为叶片畸形、扭曲、褪绿、明脉及植株严重矮化等。同时取甘薯品种0841-14无明显病毒病症状、正常生长植株1份(0841-14-3)作为对照。每份材料分别取上部幼嫩叶片和中部成熟叶片各3个叶片，叠放后平均分为2份，1份于液氮中保存，用于总RNA提取；另1份放置于取样袋中，于取样当日进行血清学检测。二、核酸提取及引物设计
采用植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取总RNA，用DNase I(天根生化科技有限公司，北京)去除总RNA中的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书进行。然后取1μg提取的总RNA为模板，采用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa公司)的Oligo dT-Adaptor Primer进行反转录(宝生生物工程有限公司，大连)合成第一链cDNA，具体操作步骤参照说明书进行。
然后根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)的热激蛋白70(Heat Shock 70)编码基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)的外壳蛋白编码基因(CP基因)保守核苷酸序列设计克隆SPFMV外壳蛋白和克隆和SPFMV热激蛋白70的引物，具体引物如下：
SPFMV正向引物：5’-tct(a/g)(a/g)tga(g/a)(a/c)(a/g)(t/a/c)actgaatt(t/c)aa(a/g)(g/a)atg-3’(SEQID NO.1)；SPFMV反向引物：5’-gcacacccctcattcc(t/c)aagaggttatg-3’(SEQ ID NO.2)。
SPFMV热激蛋白70正向引物：5’-gacgg(g/t)ggtac(t/g)atgaa(g/a)gtccttcgaa-3’(SEQ IDNO.3)；SPFMV热激蛋白70反向引物：5’-ggctcacaaac(c/a/t)ga(c/t)ttcataaacat-3’(SEQ IDNO.4)。
四、克隆SPFMV外壳蛋白和和SPFMV热激蛋白70基因
分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物对，合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：(94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火1min，72℃延伸1min，35个热循环；最后72℃延伸7min)。扩增完毕后，将PCR扩增产物用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片断，然后将回收片段与pEASY-T5载体(TransGen Biotech，北京，中国)连接，连接产物转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。将挑选含有目的片断的克隆加入到1mL Amp浓度为100μg·μL-1的LB培养基中37℃，200r·min-1震荡培养过夜，培养后送上海英捷潍基生物技术有限公司(Invritrogen，上海，中国)完成测序。将测序结果利用Geneious7.1.7和MEGA 6.06软件进分析。
五、荧光定量PCR特异检测引物的设计
根据NCBI登录序列中SPCSV的热激蛋白70(Heat Shock 70)基因和SPFMV的外壳蛋白(Coat Protein，CP)基因的核苷酸序列，结合第四部分测序获得的序列，根据其核苷酸序列的保守序列设计6对特异性检测引物，具体序列如表1所示：
表1荧光定量PCR扩增的特异引物
设计的引物由上海英捷潍基生物技术有限公司(Invritrogen,上海，中国)合成；实时荧光检测使用Bio-Rad公司的SsoAdvanced SYBR Green Supermix在CFX96实时定量PCR系统(美国Bio-Rad公司)，操作按照MIQE国际化标准进行。荧光定量PCR的内标引物采用甘薯中使用的甘薯泛素基因(ubiquitin extension protein，UBI)和甘薯组蛋白H2B(histoneH2B)基因双内标体系，具体引物为：
FIbUBI序列为：5’-tcgacaatgtgaaggcaaag-3’(SEQ ID NO.15)，RIbUBI序列为：5’-cttgatcttcttcggcttgg-3’(SEQ ID NO.16)，扩增片段长度为209bp；FIbH2B序列为：5’-gtgccggagacaagaagaag-3’(SEQ ID NO.17)，RIbH2B序列为5’-cttgctggagattccgatgt-3’(SEQID NO.18)，扩增片段长度110bp。
六、荧光定量PCR检测分析
内标检测引物检测：以提取的15份供试材料进行荧光定量，验证内标检测引物，荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，50个热循环；融解曲线测定从55℃到95℃，每个试验设3次重复，数据由Bio-Rad CFX Manager 3.1软件进行分析，结果如图1所示。结果显示，内参引物没有形成稳定的二级结构和引物二聚体，两种内参引物具有较高的稳定性。
荧光定量PCR引物的筛选：然后利用表1所示的6对引物，重庆地区随机4个染病材料(1213-41、1233-1、1013-7、1213-23)中进行初步检测，结果如图2所示。结果表明，SPCSV病毒检测引物组合FSPCSV-1Q和RSPCSV-1Q在4个染病材料中均检测到病毒信号(图2a)，引物组合FSPCSV-2Q和RSPCSV-2Q在4个染病材料中均未获得检测信号(图2b)，原因可能是该序列并非代表典型的SPCSV编码序列；SPFMV病毒检测引物检测结果表明，4对引物组合在染病材料中均获得检测信号(图2d-图2f)，其中FSPFMV-3Q+RSPFMV-2Q(图2f)引物组合扩增效果好，荧光信号稳定，重复性好，可用于重庆地区SPFMV得荧光定量PCR检测。
然后以引物组合FSPCSV-1Q和RSPCSV-1Q，以及FSPFMV-3Q+RSPFMV-2Q在所有15个供试材料的叶片中进行荧光定量PCR检测，结果如图3所示。结果显示，供试的15份材料中，C198-1、C198-2、0841-14-1(顶部幼嫩叶片)、0841-14-1(底部老叶)、0841-14-2、浙255、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)、渝薯6号(底部老叶)、宁紫薯1号-1(顶部幼嫩叶片)、宁紫薯1号-1(底部老叶)、宁紫薯1号-2、1036-1、1041-7、徐薯2214份材料感染SPFMV；C198-1、C198-2、0841-14-1(底部老叶)、0841-14-2、浙255、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)、渝薯6号(底部老叶)、宁紫薯1号-1(顶部幼嫩叶片)、宁紫薯1号-1(底部老叶)、宁紫薯1号-2、1036-1、徐薯2212份材料感染SPCSV；材料0841-14-1(顶部幼嫩叶片)、1041-72份材料只感染SPFMV病毒，未感染SPCSV；对照材料0841-14两种病毒均未感染；结果还表明供试材料不同品种间SPFMV外壳蛋白编码基因与SPFMV热激蛋白70编码基因表达水平基本不相同，渝薯6号(老叶)、宁紫薯1号-1(老叶)中SPFMV外壳蛋白编码基因表达水平相对较高，C198-1、浙薯255中病毒SPCSV热激蛋白70编码基因表达水平相对较高。并且同一供试材料植株顶部幼嫩叶片和底部老叶两种病毒上述编码基因表达量不同，一般为底部老叶高于顶部幼嫩叶片，但供试材料宁紫薯1号-1SPFMV顶部幼嫩叶片高于底部老叶，可能与染病时间长短等有关。
七、血清学检测
利用SPFMV和SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测试剂盒(国际马铃薯中心，CIP)对供试的15份材料进行包含SPFMV、SPCSV在内的10种病毒进行检测，检测方法按照试剂盒使用说明书进行，结果如图4所示。肉眼观察检测结果，阳性样品在膜上形成紫色沉淀，阴性样品无颜色反应。结果表明，供试材料C198-1、C198-2、0841-14-1(顶端幼嫩叶片)、0841-14-1(底部老叶)、0841-14-2、浙255、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)、渝薯6号(底部老叶)、宁紫薯1号-1(顶端幼嫩叶片)、宁紫薯1号-1(底部老叶)、宁紫薯1号-2、1036-1、1041-7、徐薯2214份材料与SPFMV的克隆抗体呈阳性反应，C198-1、C198-2、0841-14-1(底部老叶)、0841-14-2、浙255、渝薯6号(底部老叶)、宁紫薯1号-1(顶部幼嫩叶片)、宁紫薯1号-1(底部老叶)、宁紫薯1号-2、1036-110份材料与SPCSV的克隆抗体成阳性反应，所有材料与SPMMV、SPCFV、SPMSV、SPLV、SPVG、SPCV、C-6的克隆抗体均呈阴性反应。其中甘薯品系1036-1中除检测到SPFMV、SPCSV病毒病外，与CMV的克隆抗体也呈阳性反应，说明在重庆地区SPFMV、SPCSV和CMV共同发生。
八、症状学诊断、血清学检测(NCM-ELISA)与荧光定量PCR检测结果对照分析
通过症状学诊断可初步判断供试15份材料中，除对照材料0841-14-3外，其余14份材料全部感染甘薯病毒病，但不能精确判断两种病毒的感染程度，只能以一种辅助手段作初步判断。利用NCM-ELISA检测试剂盒检测供试的15份材料，除对照材料0841-14-3外，其余14份材料均感染SPFMV，10份材料感染SPCSV，10份材料同时感染这两种病毒，1份材料同时感染SPFMV、SPCSV、CMV三种病毒。由于荧光定量PCR是一种准确、灵敏的检测植物病毒的方法，并且本发明通过检测甘薯SPVD荧光定量PCR检测方法，快速检测出供试15份材料中14份材料感染SPFMV，12份材料感染SPCSV，12份材料同时感染这两种病毒，与ELISA检测结果所表示的病毒拷贝数基本一致。徐薯22、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)ELISA检测未检测出含有SPCSV，可能是荧光定量PCR检测方法更加灵敏的缘故。荧光定量PCR结果还反应出SPFMV在材料渝薯6号(底部老叶)、宁紫薯1号-1(顶部幼嫩叶片)、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)、宁紫薯1号-2、C198-2、C198-1、0841-14-1(底部老叶)、0841-12-2、宁紫薯1号-1(底部老叶)、浙255、徐22、1041-7、1036-1、0841-14-1(底部老叶)中拷贝数较高(顺序为由高到底)，与NCM-ELISA显色反应检测出的病毒含量基本一致，植株叶片均出现不同程度的不规则羽状黄化斑点、叶片不同程度皱缩、畸形等症状；也反应出SPCSV在材料C198-1、浙255、渝薯6号(底部老叶)、C198-2、宁紫薯1号-2中拷贝数较高，与NCM-ELISA显色结果反应出的病毒含量基本一致，植株叶片均出现不同程度的褪绿症状；SPCSV在材料徐22、渝薯6号(顶部幼嫩叶片)中拷贝数较低，而ELISA结果显示未感染SPCSV病毒，两者结果不相符可能是由于荧光定量PCR检测更加灵敏。SPCSV在1041-7、0841-14-1(顶部幼嫩叶片)中拷贝数极低(与健康对照材料0841-14-3中拷贝数相当)，视为未感染SPCSV，其结果与ELISA检查结果一致。
综上所述，本发明获得了快速检查甘薯高危病毒病SPVD的荧光定量PCR引物，利用该引物进行荧光定量PCR检测，可同时检测供试材料种SPFMV外壳蛋白编码基因与SPCSV热激蛋白编码基因转录水平，提高了甘薯SPVD的检测效率。与症状学诊断、血清学(NCM-ELISA)等检测方法相比，更加灵敏、准确、高效，为SPVD监测预警提供了一个极为有效的方法。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.用于甘薯病毒病实时荧光定量PCR的检测引物，其特征在于：所述检测引物包括甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物，所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示。
2.含有权利要求1所述检测引物的检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括内标基因检测引物，所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因，所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。
4.利用权利要求2或3所述检测试剂盒检测甘薯SPVD病毒病的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取检测样品和对照样品总RNA，反转合成第一链cDNA，备用；
(2)根据甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因设计荧光定量PCR的检测引物和内标基因检测引物，然后以步骤(1)合成的第一链cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
(3)比对检测样品和对照样品的Ct值计算甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因和甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的相对表达量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述甘薯褪绿矮化病毒SPCSV热激蛋白70基因的检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述甘薯羽状斑驳病毒SPFMV外壳蛋白基因的检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述内标基因为甘薯泛素基因UBI和甘薯组蛋白H2B基因。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述甘薯泛素基因UBI的检测引物如SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16所示；所述甘薯组蛋白H2B基因的检测引物如SEQ ID NO.17和SEQID NO.18所示。
8.根据权利要求4～7任一项所述的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR的扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，50个热循环。
CN201510004529.5A 2015-01-06 2015-01-06 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法 Expired - Fee Related CN104450977B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510004529.5A CN104450977B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510004529.5A CN104450977B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104450977A CN104450977A (zh) 2015-03-25
CN104450977B true CN104450977B (zh) 2016-08-17

Family

ID=52897722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510004529.5A Expired - Fee Related CN104450977B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104450977B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105176986B (zh) * 2015-10-12 2018-06-08 北京市植物保护站 一种检测甘薯羽状斑驳病毒的rt-lamp试剂盒及其专用引物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102108419B (zh) * 2010-11-30 2012-10-03 河南省农业科学院植物保护研究所 甘薯病毒病害spvd的多重rt-pcr检测方法
CN103849691B (zh) * 2014-02-26 2015-10-07 福建省农业科学院作物研究所 一种甘薯病毒检测引物及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104450977A (zh) 2015-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Silva et al. Rapid and specific detection of Yam mosaic virus by reverse-transcription recombinase polymerase amplification
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN104513865B (zh) 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
CN104328222B (zh) 反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法
CN108315483B (zh) 一种用于区分鸭坦布苏病毒野毒株和疫苗株的引物和探针的组合
CN107034316B (zh) 同时检测6种猪病毒的系统及其专用lamp引物
KR101149422B1 (ko) 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법
CN111334608A (zh) 用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法
CN103074447B (zh) 一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒pcr-hrm分析方法的建立
CN103210093B (zh) 一种检测消化道病原体的方法
La Fauce et al. TaqMan real-time PCR for detection of hepatopancreatic parvovirus from Australia
Shi et al. A survey of jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) infection in sheep in the three northeastern provinces of China
CN112322789B (zh) 一种检测大口黑鲈双rna病毒巢式pcr试剂盒及方法
CN104450977B (zh) 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
KR100801558B1 (ko) 벼흑조위축병 바이러스, 벼오갈병 바이러스 및벼줄무늬잎마름병 바이러스 진단용 프라이머 및 이를이용한 동시진단 방법
CN1865937A (zh) 同时检测a、b型流感病毒的实时荧光定量检测方法及试剂盒
CN110257561B (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
TWI402502B (zh) Genome detection system
CN105695629A (zh) 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法
CN106191319A (zh) 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN108866245B (zh) 鸡细小病毒、禽流感病毒和鸡新城疫病毒三重pcr检测方法的建立
Li et al. Development of a rapid and sensitive reverse transcription real-time quantitative PCR assay for detection and quantification of grass carp reovirus II
CN110616278B (zh) 检测fav-8和fav-11的特异性引物及试剂盒
KR101617142B1 (ko) 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160817

Termination date: 20180106

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee