CN101250594B

CN101250594B - 三种甘薯病毒的多重rt-pcr检测方法

Info

Publication number: CN101250594B
Application number: CN2008100495032A
Authority: CN
Inventors: 张振臣; 张业辉; 张德胜; 蒋士君; 乔奇; 王永江; 秦艳红
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2028-04-07
Also published as: CN101250594A

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法。该方法通过，分别合成甘薯潜隐病毒引物、甘薯G病毒引物和甘薯羽状斑驳病毒的引物，然后提取样品中病毒的总RNA，进行反转录；将病毒的上、下游引物分别混合后置于一个PCR反应体系中，置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。本发明建立了可同时检测甘薯三种病毒的多重RT-PCR检测技术，即在一次PCR反应中同时检测三种甘薯病毒，有效地提高了检测效率，降低了生产成本；通过对三种主要甘薯病毒的高效检测，可确保脱毒甘薯的质量和增产效果。

Description

三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法

一、技术领域：

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法。

二、背景技术：

甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus，SPLV)、甘薯G病毒(Sweet PotatoVirus G，SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)是危害甘薯的主要病毒。三种病毒都属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，常常混合侵染，造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用茎尖分生组织培养，培育脱毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在培育脱毒甘薯的过程中，需要对甘薯茎尖苗进行病毒检测，因此，建立甘薯病毒高效的检测技术是培育脱毒甘薯的前提和基础。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术，由于ELISA技术的灵敏度较低，而且SPLV、SPVG和SPFMV三种病毒的抗体之间常有交互反应，不能对三种病毒进行特异性检测。而利用单一的RT-PCR检测方法对多种病毒进行检测时，工作量大，效率低。

申请号为200610019481.6的专利申请公开了一种一次复合PCR反应同时检测马铃薯病毒和类病毒的方法，该方法通过一次复合PCR，可同时检测四种马铃薯病毒和一种马铃薯类病毒。但是，该方法并不适用于甘薯病毒的检测。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题：提供了一种在一次PCR反应中可同时检测三种甘薯病毒的方法，为甘薯病毒的特异性检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。

本发明的技术方案是：

三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其步骤包括：

(1)分别合成甘薯潜隐病毒引物SEQ 1、SEQ 2，甘薯G病毒引物SEQ 3、SEQ 4和甘薯羽状斑驳病毒引物SEQ 5、SEQ 6；

其中，SEQ 1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′，

SEQ 2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′，

SEQ 3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′，

SEQ 4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′，

SEQ 5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′，

SEQ 6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′；

(2)提取样品中病毒的总RNA，作为PCR模板，进行反转录；

(3)将所述SEQ 1、SEQ 3、SEQ5引物等体积混合形成上游引物混合物，将所述SEQ 2、SEQ 4、SEQ 6引物等体积混合形成下游引物混合物，然后将所述上、下游引物混合物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

(4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

所述反转录反应体系为10μl，包括1μl 10×RT buffer、2μl浓度为25mM的MgCl₂、1μl浓度各为10mM的dNTP混合物、0.5μl浓度为2.5μM的Oligo dT引物、10U RNase抑制剂、2.5UAMV反转录酶和4.75μl病毒的总RNA；反转录反应程序为：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

所述PCR反应体系为50μl，包括10μl 5×PCR buffer、2.5U Taq酶、0.5μl浓度各为10mM的dNTP混合物、1μl上游混合引物、1μl下游混合引物，其中每种引物浓度均为10μM，用5μl反转录产物作模板，用DEPC-H₂O补足至50μl。

所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果：

(1)本发明建立了可同时检测SPLV、SPVG和SPFMV三种病毒的多重RT-PCR检测技术，即在一次PCR反应中同时检测上述三种病毒，有效地提高了检测效率，降低了生产成本。

(2)本发明可应用于脱毒甘薯的培育过程中，通过对三种主要甘薯病毒的快速高效检测，可以确保脱毒甘薯的质量和增产效果。

(3)本发明可对甘薯病毒种类进行特异性鉴定，可应用于甘薯种薯调运以及病害调查等过程中。

四、附图说明：

图1：引物浓度对实验结果的影响

图中1-5分别表示引物浓度为：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μl

图2：Mg²⁺浓度对实验结果的影响

图中1-5分别表示Mg²⁺浓度为：1.6、1.8、2.0、2.2、2.4μl

图3：酶浓度对实验结果的影响

图中1-4分别表示酶浓度为：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μl

图4：退火温度对实验结果的影响

图中1-5分别表示退火温度为：48℃、50℃、56℃、58℃、60℃

图5：多重RT-PCR和单一RT-PCR的检测结果比较

图中1-3分别为SPLV、SPVG和SPFMV病毒的单一RT-PCR检测结果，4为三种病毒的多重RT-PCR检测结果。

五、具体实施方式：

实施例一：甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法

(一)材料和方法

1、引物的设计与合成：

根据SPLV、SPVG和SPFMV三种病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了三对引物，引物由TaKaRa公司合成。

SPFMV的引物为：

SEQ 1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′

SEQ 2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′

SPLV的引物为：

SEQ 3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′

SEQ 4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′

SPVG的引物为：

SEQ 5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′

SEQ 6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′

利用上述三对引物对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒扩增的目的片段大小分别为300bp、420bp和600bp。

2、病毒材料

取田间显症薯苗的茎尖，嫁接到巴西牵牛(Ipomoea setosa)上，待巴西牵牛出现系统花叶症状后，取其叶片-80℃保存备用。

3、酶及试剂(盒)

UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒(TaKaRa RNA PCR Kit，AMVVer.3.0)购自TaKaRa公司。三种病毒外壳蛋白基因的重组质粒分别命名为pMDLVCP、pMDVGCP和pMDMVCP，由本实验室构建并保存。

4、核酸提取

利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式总RNA抽提试剂盒，并按其说明书的方法，提取感病牵牛叶片的总RNA。

5、单一RT-PCR：

(1)反转录(RT)：反应体系的体积为10μl，其中包括1μl 10×RT buffer、2μl MgCl₂(25mM)、1μl dNTP混合物(各10mM)、0.5μl Oligo dT引物(2.5μM)、0.25μl RNase抑制剂(40U/μl)、0.5μl反转录酶(AMV Reverse Transcrptase)(5U/μl)、4.75μl样品RNA。

反应程序为：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

(2)PCR：反应体系的体积为50μl，其中包括10μl 5×PCR buffer、0.5μl Taq酶(5U/μl)、0.5μl上游特异性引物(SEQ 1、SEQ 3或SEQ 5)(10μM)、0.5μl下游特异性引物(SEQ 2、SEQ 4或SEQ 6)(10μM)、0.5μl dNTP混合物(各10mM)、5μl反转录产物作模板，用DEPC-H₂O补足至50μl。反应程序为：94℃预变性2min、94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2min、30个循环，最后72℃延伸10min。

6、多重PCR反应条件的初步筛选

首先以含有目的片段的重组质粒pMDLVCP、pMDVGCP和pMDMVCP为模板，筛选合适的反应条件。

(1)混合模板：以pMDLVCP、pMDVGCP和pMDMVCP三种质粒(质粒浓度约为1mM)各稀释10倍，按1∶1∶1混合，作为PCR的模板。

(2)混合SEQ 1、SEQ 3和SEQ 5三种引物(每种引物浓度均为10μM)按1∶1∶1混合，为上游混合引物；混合SEQ 2、SEQ 4和SEQ 6三种引物(每种引物浓度均为10μM)按1∶1∶1混合，为下游混合引物。

(3)PCR：反应体系总体积为50μl，其中5μl 10×PCR Buffter、0.5μl dNTPMixture(各10mM)、0.5μL混合模板；MgCl₂浓度设5个处理，分别为25mM MgCl₂1.6μl、1.8μl、2.0μl、2.2μl和2.4μl；混合引物浓度分别设0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl和1.2μl 5个处理；Taq酶浓度分别设0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl 4个处理；退火温度分别设48℃、50℃、56℃、58℃和60℃5个处理。以单一RT-PCR反应体系为基础，通过调节上述参数，筛选和优化多重PCR反应体系。

7、多重RT-PCR体系的建立

(1)反转录(RT)：与单一RT-PCR的反转录反应相同。

(2)PCR反应体系：首先以含有目的片段的质粒混合模板初步筛选反应条件，然后在单一RT-PCR的基础上，分别对引物浓度、Taq酶浓度、MgCl₂浓度和退火温度等条件进行优化，建立同时检测三种病毒的多重RT-PCR体系。

8、PCR产物的电泳分析

用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。上样量为5μl，80V稳压电泳50min，EB染色，凝胶成像仪观察拍照。

(二)结果与分析

1、多重PCR反应条件筛选

为了确定多重PCR的最优反应条件，分别对引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq酶浓度、退火温度进行了不同的处理。

结果表明，引物浓度对实验结果影响较大，浓度低时目的条带不清晰，在本实验中，用1.0μl左右的混合引物时，可以看到3条清晰的目的条带(见附图1)。Mg²⁺对实验结果影响不是太大，1.6μl-2.4μl都可产生清晰的条带(见附图2)。Taq酶浓度对实验结果没有明显的影响，酶的用量为0.4μl-1.0μl时都可看到清晰的目的条带(见附图3)。退火温度对实验结果影响较大，低于58℃时目的条带不清晰(见附图4)。

2、多重RT-PCR同时检测SPLV、SPVG和SPFMV体系的建立

根据不同参数对实验结果的影响，综合考虑实验结果和实验成本，最终优化的多重RT-PCR反应体系为：

PCR反应体系体积为50μl，其中10μl 5×PCR buffer、0.5μl Taq酶(5U/μl)、0.5μl dNTP Mixture(各10mM)、1μl上游混合引物(各10μM)、1μl下游混合引物(各10μM)、5μl反转录产物作模板，用DEPC-H₂O补足至50μl。

反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。

3、多重RT-PCR同时检测SPLV、SPVG和SPFMV的应用

利用建立的多重RT-PCR体系对嫁接发病的牵牛样品进行检测，检测结果与单一RT-PCR的检测结果一致(见附图5)。

序列表

<110>河南省农业科学院植物保护研究所

<120>三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法

<160>6

<170>PatentIn 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus)

<400>1

CTTCAGTGAC GTTGCTGAAG C 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus)

<400>2

TGCACACCCC TCATTCCTAA G 21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus)

<400>3

CCAAATATCA ATGGTGATTG GGT 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus)

<400>4

CCACGCATTC CAAGTAGTGT GTGT 24

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>甘薯G病毒(Sweet Potato Virus G)

<400>5

GCACCAATGG CAAATGGAAG AATAG 25

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>甘薯G病毒(Sweet Potato Virus G)

<400>6

GAGGTTATGT ATATTCCTTG TAAC 24

Claims

1.三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，

(1)分别合成甘薯潜隐病毒引物SEQ1、SEQ2，甘薯G病毒引物SEQ3、SEQ4和甘薯羽状斑驳病毒引物SEQ5、SEQ6；

其中，SEQ1：5′-CTTCAGTGACGTTGCTGAAGC-3′，

SEQ2：5′-TGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′，

SEQ3：5′-CCAAATATCAATGGTGATTGGGT-3′，

SEQ4：5′-CCACGCATTCCAAGTAGTGTGTGT-3′，

SEQ5：5′-GCACCAATGGCAAATGGAAGAATAG-3′，

SEQ6：5′-GAGGTTATGTATATTCCTTGTAAC-3′；

(2)提取感病牵牛叶片的总RNA，作为PCR模板，进行反转录；

(3)将所述SEQ1、SEQ3、SEQ5引物等体积混合形成上游引物混合物，将所述SEQ2、SEQ4、SEQ6引物等体积混合形成下游引物混合物，然后将所述上、下游引物混合物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

(4)用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录的反应体系为10μl，包括1μl 10×RT buffer、2μl浓度为25mM的MgCl₂、1μl浓度各为10mM的dNTP混合物、0.5μl浓度为2.5μM的Oligo dT引物、10U RNase抑制剂、2.5UAMV反转录酶和4.75μl病毒的总RNA；反转录反应程序为：42℃30min，99℃5min，5℃5min。

3.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为50μl，包括10μl 5×PCR buffer、2.5U Taq酶、0.5μl浓度各为10mM的dNTP混合物、1μl上游混合引物、1μl下游混合引物，其中每种引物浓度均为10μM，用5μl反转录产物作模板，用DEPC-H₂O补足至50μl。

4.根据权利要求1所述的三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。