CN101875983B

CN101875983B - 一种快速检测多种甜瓜病毒的方法

Info

Publication number: CN101875983B
Application number: CN2010102327679A
Authority: CN
Inventors: 吴云锋
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2030-07-21
Also published as: CN101875983A

Abstract

本发明还提供了一种快速检测多种甜瓜病毒的方法，该方法包括提取病毒总RNA，反转录得cDNA模板，应用引物组对模板进行多重PCR，然后检测产物，确定病毒种类，其中多重PCR中应用5对引物SEQ ID NO.1-10，该方法在甜瓜复合感染病毒的检测中，具有节省时间、降低成本、提高效率优点。

Description

一种快速检测多种甜瓜病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种快速检测多种甜瓜病毒的方法。

背景技术

我国是西瓜的主要生产国之一，每年西瓜种植面积平均在1800万亩以上，种植面积居世界第一位。其中西北地区为我国重要的西瓜优质产区。病毒病在西瓜生产上是一种普遍发生且危害性很大的病害，一般年份发病比率为10％～30％，重发年份可高达50％～80％以上。西瓜病毒病的大面积发生，造成西瓜大量减产，品质下降，将会严重影响了西瓜的高产、稳产、优质、高效益及瓜农的生产积极性。

侵染西瓜的病毒主要有以下5种：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)，而且在田间病毒会经常发生复合感染。

目前，用于西瓜病毒的检测方法，有生物学、电镜观察、血清学、RT-PCR和核酸杂交，但由于生物学检测法周期长，电镜操作需要一定技能，不易进行大量样本的集中处理，同时仪器费用高，所以生物学方法和电镜检测在西瓜病毒检测中存在很大局限性。尽管血清学方法得到了广泛应用[3-4]，但商品化的抗血清价格较高，一种抗血清只能检测一种病毒，而且还具有一定的假阳性反应等问题。单重RT-PCR(sRT-PCR)和核酸杂交检测方法一个反应只能检测一种病毒，而田间西瓜病毒多是复合侵染，所以用这两种方法检测要耗费较多时间和试剂。为了保证西瓜生产的产量和质量，准确鉴定西瓜病毒病，西瓜生产上急需一种较为准确、灵敏和快速的病毒检测方法。

发明内容

本研究针对陕西省西瓜病害发生的现状，运用根据5种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物对，从影响多重RT-PC(M-PCR)扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立能从西瓜叶片组织中同时检测CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV 5种病毒复合侵染田间样品的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种同步检测2-5种甜瓜病毒的方法，该方法包括甜瓜病毒总RNA的提取，多重RT-PCR和电泳检测，确定病毒种类，其中甜瓜病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草花叶病毒(TMV)、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)中的2-5种，其中多重RT-PCR反应中应用的引物为包含如下5对引物中的2-5对引物的引物组，优选地，引物组中包含如下5对引物：

第1对引物：CMV-F(SEQ ID NO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)

SEQ ID NO.1：5′-ATTGGTCGTCCCACTCTT-3′

SEQ ID NO.2：5′-TCGCCAAACATAGCAGAG-3′

第2对引物：SqMV-F(SEQ ID NO.3)/SqMV-R(SEQ ID NO.4)

SEQ ID NO.3：5′-AGGCACATTTCGCAGTTC-3′

SEQ ID NO.4：5′-CGATGGTTGCCTTTATGT-3′

第3对引物：TMV-F(SEQ ID NO.5)/TMV-R(SEQ ID NO.6)

SEQ ID NO.5：5′-GCCGACCCAATAGAGTTA-3′

SEQ ID NO.6：5′-GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′

第4对引物：WMV-F(SEQ ID NO.7)/WMV-R(SEQ ID NO.8)

SEQ ID NO.7：5′-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3′

SEQ ID NO.8：5′-TGCTGCGTCTGAGAAATG-3′

第5对引物：ZYMV-F(SEQ ID NO.9)/ZYMV-R(SEQ ID NO.10)

SEQ ID NO.9：5′-GGAGCGGAAACAAGTGAA-3′

SEQ ID NO.10：5′-ACCTGCTCATTCCCATCC-3′

上述方法中，检测病毒的种类和引物对种类选择的对应关系是：

CMV对应第1对引物

SqMV对应第2对引物

TMV对应第3对引物

WMV对应第4对引物

ZYMV对应第5对引物

也就是当需要检测CMV和SqMV的时候，需要引物组包含第1对和第2对引物，引物组中可以包含其他引物对，但是至少要包含第1对和第2对引物。

具体地，上述同步检测2-5种甜瓜病毒的方法包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染1-5种病毒的甜瓜叶中的病毒总RNA；

2)多重RT-PCR：

应用SEQ ID NO.2、4、6、8、10(第1-5对引物中反向引物序列)对病毒总RNA进行逆转录制备cDNA模板，然后应用SEQ ID NO.1-10(第1-5对引物中的正向和反向序列)对cDNA模板进行多重PCR反应，得扩增产物；

3)电泳检测：

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草病毒种类。

上述方法还可以包含如下步骤：

4)结果分析

将条带中的基因与质粒进行体外连接，挑取阳性克隆，提取质粒测序，与设计的PCR产物大小比较，分析所得序列与参考序列的同源率，判定多重RT-PCR检测结果的可靠性。

上述方法中，多重PCR反应中五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1.2-1.6∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶1.3-1.7，优选地，五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1∶1∶1∶1∶1。

上述方法中，多重PCR反应中dNTPs浓度为0.10-0.6mmol/L；Taq DNA聚合酶浓度为0.05-0.5U/μL；Mg²⁺浓度为1.0-3.5mmol/L，优选地dNTPs浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶浓度为0.20U/μL，Mg²⁺浓度为3.0mmol/L，PCR缓冲液浓度为0.8×至1×。

上述方法中，多重PCR反应中，退火温度为46-51℃，延伸时间为20s-90s，循环次数为2545次，优选地，扩增条件为退火温度51℃，延伸时间60s，循环次数35次。

甜瓜病毒病常为复合侵染，本研究经过多次优化和摸索条件建立了同时检测五种甜瓜病毒的多重PCR体系。此技术在甜瓜复合感染病毒的检测中，具有节省时间、降低成本、提高效率优点。在甜瓜栽培生产中，能够即快速、准确又简便和经济的检测出幼苗带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。在国内同时检测多种甜瓜病毒病害几乎没有报道。这项技术已成功的应用于田间甜瓜病害复合侵染的同步检测。

附图说明

图1实验室条件下用所建立的多重RT-PCR体系检测五种单一(样品1、样品2、样品3、样品4、样品5)及混合的甜瓜病毒(样品6)；

图2是检测陕西省杨凌、韩城、礼泉、扶风、周至、武功6个地区甜瓜样品上的甜瓜病毒(样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)的电泳检测结果

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

引物的设计和制备

根据GenBank上登录的CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV病毒外壳蛋白基因序列(EF202597.1、DQ868881.1、DQ352454.1、DQ399708.1、AY611022.1)，应用Primier 5.0引物设计软件分别设计这5种病毒的特异引物。由于多重PCR要求在同一个退火温度下同时扩增多个目的片段，因此利用软件DNAMAN计算引物Tm值，对设计的大量引物进行筛选，选择Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退火温度下同时检测到WMV、CMV、SqMV、TMV和ZYMV 5种病原CMV-F(SEQ ID NO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)、SqMV-F(SEQ ID NO.3)/SqMV-R(SEQ ID NO.4)、TMV-F(SEQ ID NO.5)/TMV-R(SEQ ID NO.6)、WMV-F(SEQ ID NO.7)WMV-R(SEQ ID NO.8)和ZYMV-F(SEQ ID NO.9)/ZYMV-R(SEQ ID NO.10)。每个引物的信息如下表1所示：

表1引物序列SEQ ID NO.1-10的信息

上述引物由北京赛百盛公司合成。

本发明的实施例中所用到的实验材料如下：

ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV 5种毒原分别在甜瓜上接种繁殖，保存于-80℃冰箱中。Taq盒为优晶生物工程有限公司产品，克隆载体pMD18-T simple vector、分子生物学菌株材料购自TaKaRa(大连)生物有限公司。

实施例1单重RT-PCR检测陕西杨凌5种单一甜瓜病毒样品

分别采取6个样品：ZYMV、WMV、TMV、SqMV、CMV及5种病毒混合感染的甜瓜叶，样品标号为：样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6。

病毒总RNA的提取

分别称取ZYMV、WMV、TMV、SqMV、CMV及5种病毒混合感染的甜瓜叶(分别标记为样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)各0.5g放入-80℃深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1.5mLeppendorf管中，加入500μL苯酚/氯仿(1∶1)和500μLRNA抽提缓冲液(Tris-HCl20mmol/L，SDS1％，NaCl 200mmol/L，EDTA50mmol/L)，充分振荡2min，4℃，12,000g离心5min。上清用等体积苯酚/氯仿再抽提一次，4℃，12,000g离心5min。上清加入等体积4M LiCl，4℃沉淀4h以上，于4℃，12,000g离心15min。弃上清液，沉淀用70％预冷的乙醇洗涤两次，充分干燥后溶于30μL DEPC处理的ddH2O中-20℃保存备用。同时以健康烟草(标记为样品1)总RNA为阴性对照，提取方法同上。

逆转录(RT)反应

分别对每种病毒的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒cDNA第一链。25μLRT反应体系如下：2μL总RNA，1μL病毒特异反向引物(10μmol/L)，7μLDEPC-H₂O，70℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入5μL 5×RT buffer，5μLdNTP(2.5mmol/L each)，0.5μLRNase抑制剂(40U/μL)和1μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，离心后，42℃水浴1h，95℃灭活5min，置冰上待用。

PCR反应

25μL PCR标准反应体系：12.3μL ddH2O，2.5μL10×PCR buffer[750mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，200mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1％Tween 20]，2μL25mmol/LMgCl₂，2μLdNTP(2.5m mol/L each)，2μL正向和反向引物混合物(各10μmol/L)，0.2μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)和2μL RT产物。PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃变性45s，46℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终止补偿延伸10min。取5μLPCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析比较。

电泳检测

取5μL PCR反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5条特异性条带，得到每种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图1。

实施例2多重RT-PCR检测陕西杨凌多种病毒感染的甜瓜病毒样品

病毒总RNA的提取

分别对来自陕西杨凌、韩城、礼泉、扶风、周至和武功六个地方的甜瓜花叶病样品(分别标记为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)各0.5g放入-80℃深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1.5mLeppendorf管中，加入500μL苯酚/氯仿(1∶1)和500μLRNA抽提缓冲液(Tris-HCl 20mmol/L，SDS 1％，NaCl 200mmol/L，EDTA50mmol/L)，充分振荡2min，4℃，12,000g离心5min。上清用等体积苯酚/氯仿再抽提一次，4℃，12,000g离心5min。上清加入等体积4M LiCl，4℃沉淀4h以上，于4℃，12,000g离心15min。弃上清液，沉淀用70％预冷的乙醇洗涤两次，充分干燥后溶于30μL DEPC处理的ddH2O中-20℃保存备用。

多重逆转录(RT)反应

分别对每个病毒样品的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒cDNA第一链。25μLRT反应体系如下：15μL总RNA，2μL 5种病毒特异反向引物混合物(各10μmol/L)，7μL DEPC-H₂O，70℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入5μL 5×RT buffer，5μLdNTP(2.5mmol/L each)，0.5μLRNase抑制剂(40U/μL)和1μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，离心后，42℃水浴1h，95℃灭活5min，置冰上待用。

多重PCR反应

25μL PCR标准反应体系：12.3μL ddH2O，2.5μL 10×PCR buffer[750mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，200mmol/L(NH4)₂SO₄，0.1％Tween 20]，3μLMgCl₂(25mmol/L)，4μLdNTP(各2.5m mol/L)，5对特异性引物各0.4μL(各10μmol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)和2μL RT产物。PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃变性45s，46℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终止补偿延伸10min。取5μLPCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析比较。

电泳检测

取5μL PCR反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5条特异性条带，得到每种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图2。

PCR产物序列分析

割胶回收经多重PCR扩增的ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV条带，与pMD18-T simple vector进行体外连接，挑取阳性克隆，提取质粒测序。测序结果表明，ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的扩增产物分别由542、485、410、354、293个核苷酸组成，与设计的PCR产物大小相同，分别为ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMVCP基因的部分序列。序列同源性分析结果表明，所得序列与参考序列的同源率分别达到98.63％、99.24％、99.91％、98.32和99.02％。证明了多重PCR检测结果的可靠性。

本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种同步检测5种甜瓜病毒的方法，该方法包括甜瓜病毒总RNA的提取，多重RT-PCR和电泳检测，确定病毒种类，其中甜瓜病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草花叶病毒(TMV)、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)中的5种，其中多重RT-PCR反应中应用的引物为如下5对引物组成的引物组：

第1对引物：

SEQ ID NO.1：5′-ATTGGTCGTCCCACTCTT-3′

SEQ ID NO.2：5′-TCGCCAAACATAGCAGAG-3′

第2对引物：

SEQ ID NO.3：5′-AGGCACATTTCGCAGTTC-3′

SEQ ID NO.4：5′-CGATGGTTGCCTTTATGT-3′

第3对引物：

SEQ ID NO.5：5′-GCCGACCCAATAGAGTTA-3′

SEQ ID NO.6：5′-GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′

第4对引物：

SEQ ID NO.7：5′-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3′

SEQ ID NO.8：5′-TGCTGCGTCTGAGAAATG-3′

第5对引物：

SEQ ID NO.9：5′-GGAGCGGAAACAAGTGAA-3′

SEQ ID NO.10：5′-ACCTGCTCATTCCCATCC-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取感染1-5种病毒的甜瓜叶中的病毒总RNA；

2)多重RT-PCR：

应用SEQ ID NO.2、4、6、8、10对病毒总RNA进行逆转录制备cDNA模板，然后应用SEQ ID NO.1-10对cDNA模板进行多重PCR反应，得扩增产物；

3)电泳检测：

3.根据权利要求2所述的方法，该方法还包括如下步骤：

4)结果分析

4.根据权利要求2所述的方法，其中多重PCR反应中五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1.2-1.6∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶1.3-1.7。

5.根据权利要求4所述的方法，其中五对引物浓度比例为第1对引物∶第2对引物∶第3对引物∶第4对引物∶第5对引物＝1∶1∶1∶1∶1。

6.根据权利要求2所述的方法，其中多重PCR反应中dNTPs浓度为0.10-0.6mmol/L；Taq DNA聚合酶浓度为0.05-0.5U/μL；Mg²⁺浓度为1.0-3.5mmol/L

7.根据权利要求6所述的方法，其中dNTPs浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶浓度为0.20U/μL，Mg²⁺浓度为3.0mmol/L，PCR缓冲液浓度为0.8×至1×。

8.根据权利要求2、6或7所述的方法，其中多重PCR反应中，退火温度为46-51℃，延伸时间为20s-90s，循环次数为25-45次。

9.根据权利要求8所述的方法，其中扩增条件为退火温度51℃，延伸时间60s，循环次数35次。