CN103114135A - 柑橘溃疡病菌荧光pcr快速检测引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柑橘溃疡病菌的实时荧光PCR快速检测引物及试剂盒，所述的引物包括序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物。本发明根据柑橘溃疡病菌的全基因组序列，利用分子生物学分析获得了具有特异性的保守序列，并设计其特异性扩增引物。该保守基因序列为不同柑橘溃疡病菌株系所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的柑橘溃疡病菌的可靠性。另外，本发明的引物采用荧光标记，与普通PCR技术相比，不必用凝胶电泳方法来观察，实现了检测流程一体化封闭检测。

Description

柑橘溃疡病菌荧光PCR快速检测引物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柑橘溃疡病菌荧光PCR快速检测引物及包含该引物的试剂盒。

背景技术

柑橘溃疡病菌是柑橘上的最为重要的病害之一，在世界各国主要柑橘产区几乎都有分布报道。该病菌严重时可导致整株死亡，一般情况下由于阻碍了幼苗正常生长发育，促使成年果树的落叶、落果和树势削弱等原因，可导致产量降低、果实品质严重下降。1910年，该病菌在美国从日本引种时，随枳苗传入，后爆发了多次大规模流行，对美国的柑橘产业形成了毁灭性的灾害，迫使美国政府耗费了大量的物力和财力进行了彻底地病树根除措施，才基本控制了疫情的蔓延。目前，我国已将柑橘溃疡病菌列为检疫性有害物种，严格禁止入境。

柑橘溃疡病菌的传统检测与鉴定方法主要为病菌分离及致病性测定、血清学检测技术、噬菌体检测法。分离及致病性测定需要3至5天的时间才能观察到有效症状。我国的王中康等制备了该病菌的多克隆抗体，建立了DAS-ELISA和PAS-ELISA快速检测技术，也可用硝酸纤维代替传统聚苯乙烯微量反应板，采用Dot-ELISA检测。限为5×10³cfu/ml，可用玻片凝集反应、沉淀反应及免疫荧光法。但值得注意的是，单克隆抗体法无法检测该种细菌的全部菌系。日本的研究人员曾利用柑橘溃疡病菌噬菌体进行辅助鉴定。在采用噬菌体检测时，一般要求所用噬菌体对该菌所有菌系产生溶菌作用而对其他菌无溶菌作用。在国内，王中康等(1990)也开展了相关研究，分离到专化性的噬菌体。

现代检测技术越来越倾向于聚合酶链式反应法(PCR法)等分子检测手段，柑橘溃疡病菌荧光PCR是一种建立在高分辨率熔解曲线分析基础上的高精度核酸检测手段，该种技术无需后期图像处理，所有检测信息全部由荧光PCR仪自动采集完成，无需使用荧光探针即可完成基因、单碱基筛查，对于植物病原细菌一类病原微生物是一种理想的分子生物学检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供柑橘溃疡病菌荧光PCR快速检测，即一种能够通过检测柑橘溃疡病菌特异性片段来判断检测样品中是否存在柑橘溃疡病菌的荧光引物。

本发明的荧光引物，包括：

1)序列为SEQID NO：1的上游引物和序列为SEQID NO：2的下游引物；

2)对1)中的引物对通过转换、插入、缺失或5’添加基所形成的引物对，且引物对扩增的产物在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

本发明的柑橘溃疡病菌的荧光PCR快速检测试剂盒，包括如下组分

1)2倍浓度的PCR体系预混合物；

2)上游引物和下游引物，浓度分别为10μmol/L；

3)20倍浓度的荧光染料；

4)DNA样品/报告质粒，10μg/μL；

5)双蒸水。

本发明根据柑橘溃疡病菌保守基因序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该保守基因序列为不同柑橘溃疡病菌菌系所共有，以保证从种的水平上检测不同来源菌株的可靠性。另外，本发明的引物采用荧光标记，与普通PCR技术相比，不必用凝胶电泳方法来观察，实现了检测流程一体化封闭检测。

具体实施方式

本发明根据柑橘溃疡病菌保守基因序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该引物包括：

1)序列为SEQID NO：1的上游引物和序列为SEQID NO：2的下游引物；

2)对1)中的引物对通过转换、插入、缺失或5’添加基所形成的引物对，且引物对扩增的产物在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

对于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了内切酶识别标识片段所形成的长度不同引物，以及碱基替换、插入、删除所形成的变异引物。这些由序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物所衍生出的引物也能用来检测柑橘溃疡病菌，即2)中所描述的衍生引物所扩增出的核苷酸片段能够在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；所述的严谨条件参照Roche公司的DIG高效DNA标记及检测Starter Kit1手册中的杂交条件。

本发明的引物用于荧光PCR检测柑橘溃疡病菌，PCR反应体系中各组分构成比例如下：

PCR反应程序：

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性25s；53℃退火，30s，72℃延伸30s，循环40次。

(3)最后加做熔解曲线(95℃15sec，60℃15sec，95℃，15sec)

本发明的引物用于检测柑橘溃疡病菌，检测过程如下：

1、设计并合成特异性寡核苷酸引物用于荧光染料嵌合荧光PCR检测；

构建可以使用上游引物和下游引物扩增的报告质粒，作为阳性对照质粒，防止出现假阴性结果。

本发明所用的报告质粒可以选用人工合成的柑橘溃疡病菌质粒pXAC64(GenBank：AE008925.1)的部分基因片段，其序列为SEQ ID NO：3，将该扩增片段插入PMC-T载体得到本发明所应用的报告质粒。

2、以本发明的荧光引物作为引物，以待测样品总DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；

扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，可以观察到对保守基因序列进行特异性扩增产生的荧光，并得到扩增产生的特异性片段所持有的熔解曲线(主峰86.5±0.5)，则证明待测样品中存在柑橘溃疡病菌；如仅观测到荧光信号，而熔解曲线不符合柑橘溃疡病菌特有的熔解曲线，且可以观察到阳性对照报告质粒荧光信号及其产生的熔解曲线，则证明待测样品中不存在柑橘溃疡病菌；如出现其他结果则表明此次检验失败，不能确定是否存在柑橘溃疡病菌，需重新检验。

实施例1：本发明的效果检测

本发明特异性引物通过荧光嵌合PCR报告荧光信号对柑橘溃疡病菌标准菌株进行检测，扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，可以观察到对柑橘溃疡病菌进行特异性扩增产生的荧光，并得到对柑橘溃疡病菌进行扩增产生的特异性片段所持有的熔解曲线(主峰86.5±0.5)。结果表明，本发明的引物和试剂盒可以准确地检测出携带柑橘溃疡病菌的阳性样品，不会产生假阴性。

实施例2：阴性对照

用本发明的引物和试剂盒，按本发明的检测步骤对野油菜黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonascampestris pv.Malvacearum)、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris pv.holcicola)、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris pv.holcicola)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)、巴氏黄单胞菌(Xanthomonas badrii)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、野油菜黄单胞菌青苋致病变种(Xanthomonas campestris pv.amaranthicola)、油菜黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas campestris pv.Manihotis)、豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonassyringae pv.pisi)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)等10种阴性对照菌株进行荧光检测，扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR反应结束后测定所合成DNA片段的熔解温度，将数据传输至电脑通过荧光PCR仪配套软件进行分析，没有检测到与柑橘溃疡病菌扩增所得到的相近熔解曲线(主峰86.5±0.5)，且可以观察到阳性对照报告质粒荧光信号及其产生的熔解曲线。从而证明对非柑橘溃疡病菌的阴性对照病原细菌进行检测时，不会出现假阳性结果。

Claims (3)

1.一种柑橘溃疡病菌的实时荧光PCR快速检测引物，其特征在于，所述的引物包括序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物。 

2.柑橘溃疡病菌的荧光PCR快速检测试剂盒，包括如下组分： 

1)2倍浓度的PCR体系预混合物； 

2)上游引物和下游引物，浓度分别为10μmol/L； 

3)20倍浓度的荧光染料； 

4)DNA样品/报告质粒，10μg/μL 

5)双蒸水。 

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于上述的DNA样品/报告质粒中包括序列为SEQ ID NO：3的片段。