CN113186318A - 一种柑桔溃疡病菌的pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种柑桔溃疡病菌的pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用一组特异性的引物，通过将微量的DNA大幅增加来进行检测，具有特异性强、灵敏度高，结果准确的优点，从而使得其具有良好的市场应用前景和推广应用价值。

Description

一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及植物病原菌分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)既是国内的植物检疫对象，更是我国禁止入境的对外检疫对象。该病原属于黄单胞杆菌属植物病原细菌，该病危害柑桔叶片、枝梢和果实。苗木和幼树受害特别严重会造成落叶、枯梢，影响树势；果实受害重者落果，轻者带有病疤不耐贮藏，发生腐烂，大大降低果实的商品价值，在未发生过该病的国家或地区发现病树时，目前只能采取烧毁病苗的方式进行处置，种植者和生产区会损失惨重。
柑桔溃疡病菌对在亚洲、南美洲、大洋洲和非洲很多国家，以及美国佛罗里达州广泛存在的热带和亚热带条件下种植的(CABI，2006：EPPO， 2006)，以柑橘属(Citrusspp.)、金橘属(Fortunella spp.)和枳属(Poncirus spp.)为主的很多芸香科(Rutaceae)栽培种造成危害(EPPO，1979)。一些寄主范围有限的非典型柑橘溃疡病菌菌株已被鉴定并命名为菌株A*和 Aw(Sun等，2004；Vernière等，1998)。菌株A*自然条件下在亚洲危害墨西哥莱檬(Citrus aurantiifolia)。菌株Aw自然条件下在美国佛罗里达引起墨西哥莱檬和大叶莱檬(Citrus macrophylla)溃疡(Cubero和Graham， 2002，2004)。均有报道称这两个菌株在实验条件下会在其他柑桔种类上引起非典型病变(Escalon等，2013)。
柑桔溃疡病菌可以作为寄主或非寄主植物的表生菌在病变组织中存活，也可以作为腐生菌在稻草覆盖物或土壤中生存。在越冬病斑，尤其是在嫩梢上形成的病斑是下一季最重要的侵染源。近距离扩散的主要机制是风雨和植株内、植株间的飞溅的水花：细菌随流经病斑表面的雨水传播，并飞溅到健康枝梢上(CABI，2006)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种快速、准确的柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。
在本发明的一方面，提供一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，提供一种柑桔溃疡病菌的PCR检测试剂盒，其包括上述的引物组。
进一步地，其中前述的PCR检测试剂盒中，其中所述PCR检测试剂盒还包括12.5μL的2×Premix Taq缓冲液、100ng/μL的阳性对照和100ng/μL 的阴性对照。
进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述阳性对照为20μL的柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri)的基因组DNA。
进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述阴性对照管为黄单孢 20μL的杆菌属草莓黄单孢菌(Xanthomonas fragarice)的基因组DNA。
进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中还包括9.5-10.5mL的无菌水。
进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物、下游引物以混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。
进一步地，前述的PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L。
在本发明的另一方面，提供一种不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用所述的引物进行PCR检测。
进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：
1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，得到研磨样品；
2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨样品中的DNA，获得待测样本的模板DNA。
进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，将待测样本加入液氮后充分研磨至80-100微米；所述植物发病部位组织或干重组织与液氮的重量比例为1：(0.8-2)。
进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。
进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述PCR检测反应体系为25μL；其中模板DNA 2μl，扩增反应液2xPremix Taq，12.5μl；10μmol/L所述的引物各1μL，和无菌水 8.5μL。
进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述PCR检测的反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸 10min，4℃下保存。
本发明的原理在于针对柑桔溃疡病菌的Xcc49 chromosome基因序列设计并筛选出的一组特异性引物，用于柑桔溃疡病菌的普通PCR特异性检测，从而为检测柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)提供新的检测方法。
本发明相比于现有技术至少具有以下有益效果：
本发明通过设计一组特异性引物并采用普通PCR方法来检测柑桔溃疡病菌，可以实现快速、方便、高效的检测目的。
本发明利用一组特异性的引物，通过将微量的DNA大幅增加来进行检测，具有特异性强、灵敏度高，结果准确的优点，从而使得其具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
本发明通过设计一组柑桔溃疡病菌的特异性引物，并对反应体系进行了优化，建立了针对该菌株的PCR检测，能够在受到单一病原菌或至少两种病原菌复合侵染的样本中检测出该病原菌，而且整个检测能控制在3个小时内完成，提高了工作效率，特别符合国境口岸快速检测、快速通关的需求。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1为应用本发明的引物所建立的普通PCR特异性实验检测图，其中， M为Marker；1为柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri)；2～8分别为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、辣椒疮痂病菌Xanthomonaseuvesicateria、野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonas vesicatoria)、野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.melhusii)、茄科植物细菌性斑点病菌(Xanthomonas perforans)、细菌性疮痂病菌(Xanthomonas gardneri)及草莓角斑病菌(Xanthomonas fragarice)；
图2为应用本发明的引物所建立的普通PCR灵敏度实验检测图，其中， M为Marker；1～7是浓度(即模板量)分别为93.7ng/μL、9.37ng/μL、 937pg/μL、93.7pg/μL、9.37pg/μL、937fg/μL、93.7fg/μL的柑桔溃疡病菌基因组DNA扩增产物；
图3为应用本发明的引物所建立的普通PCR口岸样品检测图，其中， M为Marker；1为柑桔溃疡病菌菌株；2-4为阳性口岸样品；5-8为阴性口岸样品。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种柑桔溃疡病菌的PCR 检测用引物组、试剂盒及检测方法其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。
以下材料或试剂，如非特别说明，均为市购。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明提供了一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种柑桔溃疡病菌的PCR检测试剂盒，其包括上述的引物组，其可以扩增出237bp大小的特异性扩增条带。
具体实施时，所述PCR检测试剂盒还包括12.5μL的2×Premix Taq缓冲液、约100ng/μL的阳性对照和约100ng/μL的阴性对照。
具体实施时，所述阳性对照为20μL的柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citripv.citri)的基因组DNA。
具体实施时，所述阴性对照管为黄单孢20μL的杆菌属草莓黄单孢菌(Xanthomonas fragarice)的基因组DNA。
具体实施时，所述PCR检测试剂盒中还包括9.5-10.5mL的无菌水。
具体实施时，所述上游引物、下游引物以混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。
具体实施时，所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L。
本发明还提供了一种不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用所述的引物进行PCR检测。
具体实施时，步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：
1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，得到研磨样品；
2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨样品中的DNA，获得待测样本的模板DNA。
具体实施时，所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，加入液氮后充分研磨至80-100微米(粉末状)，优选为85-95微米；所述植物发病部位组织或干重组织与液氮的重量比例为1：(0.8-2)，优选为1：1，这样优选后液氮恰好可以盖住植物发病部位组织或干重组织，液氮变为气体时要吸收大量的热，使叶片瞬间冷冻，这样研磨起来就更彻底；而若液氮量过少或不加液氮直接研磨的话，则会破坏植物发病部位组织或干重组织细胞内所含的物质的形态，不便于下一步的DNA提取。
具体实施时，步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。
具体实施时，步骤S2中，所述PCR检测反应体系为模板DNA 2μl，扩增反应液2xPremix Taq，12.5μl；10μmol/L权利要求1所述的引物各1μL，和无菌水8.5μL。
具体实施时，步骤S2中，所述PCR检测的反应程序为：95℃预变性 4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，4℃下保存。
具体实施时，步骤S2还包括以下步骤：
1)取出反应管，将PCR产物加入1.2wt％的琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设Marker作为片段大小标准；在1×TAE电泳缓冲液中、100V电压下，电泳30min；电泳结束后取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察，记录PCR 扩增条带；
2)结果判定：在阳性对照扩增出237bp大小的特异性扩增条带、阴性对照和空白对照均无特异性扩增条带的情况下，被检样品进行检测时出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带，样品判定为阳性；被检样品进行检测时未出现与阳性对照相同大小的特异性条带，样品判为阴性。
实施例1：建立柑桔溃疡病菌PCR检测体系
设计引物：
针对柑桔溃疡病菌的Xcc49 chromosome基因序列通过PrimerPremier5 软件分别设计并筛选出的一组特异性引物，用于柑桔溃疡病菌的普通PCR 方法特异性检测，该对引物的序列为：
上游引物P1：5’-ATCATTCGCCCTAGCAGCGG-3’(如SEQ ID NO.1 所示)
下游引物P2：5’-GCATAGGAAGTAGGGCGGAC-3’(如SEQ ID NO.2 所示)
所述上游引物P1、下游引物P2可以采用本领域的常规方法合成。本实施例应用的引物P1、P2委托宝生物合成。
本发明实施例所述PCR检测使用的仪器为ABI ProFlex PCR系统。
本实施例基于上述引物和体系等条件，提供一种柑桔溃疡病菌的PCR 检测方法，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用所述引物进行PCR检测。
其中，S1提取DNA的具体方法参照现有技术，具体为：于NA平板培养基上挑取单个柑桔溃疡病菌接种于新鲜的NB培养基中，28℃下摇床培养48h。取1mL菌液12000r/min离心5min，取上清，采用天根公司的植物基因组DNA试剂盒提取DNA。所述NA平板培养基和NB培养基为市购或商业化途径获得的现有常规NA培养基。
S2中所述PCR检测反应体系为25μL：模板DNA 2μL，扩增反应液 2xPremix Taq12.5μL；10μmol/L上下游引物各1μL，和无菌水8.5μL。
S2中所述PCR检测的反应程序为：95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s(35个循环)；72℃继续延伸10min， 4℃下保存。取出反应管，将PCR产物加入1.2wt％的琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设Marker(也称为M)作为片段大小标准。在1×TAE电泳缓冲液中、100V电压下，电泳30min。电泳结束后取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察，记录PCR扩增条带。
实施例2：本发明方法的特异性和灵敏度试验
(1)检测特异性分析
将柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、辣椒疮痂病菌 Xanthomonaseuvesicateria、野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种 (Xanthomonas vesicatoria)、野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.melhusii)、茄科植物细菌性斑点病菌(Xanthomonas perforans)、细菌性疮痂病菌(Xanthomonas gardneri)及草莓角斑病菌(Xanthomonas fragarice)(均为中国农业大学植物保护学院赠送)作为实验菌株，分别用本发明所述的检测方法进行PCR扩增，以观察这些实验菌株有无特异性条带扩增，扩增结果见图1。从图1中可以看出有且只有柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri)有特异性扩增，其他菌均无特异性条带产生，表明本发明建立的针对柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitri pv.citri)基因检测的PCR方法特异性良好。
(2)检测灵敏度分析
实施例1中步骤S1提取的柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri) 的初始模板的浓度经NanoDrop微量分光光度计测得其浓度为93.7ng/μL，用TE buffer对其进行10倍梯度稀释，共制作6个稀释倍数(100～10-5)，对经10倍梯度稀释的柑桔溃疡病菌的基因组DNA模板进行检测，该PCR 体系可以检测柑桔溃疡病菌的DNA的最低检测限为9.37pg/μL。扩增结果见图2。从图2的电泳结果可知，当稀释至10-5倍(浓度为937fg/μL)时，已无阳性条带，因此本发明建立的PCR检测方法中，建议DNA浓度的最低检测限为9.37pg/μL，以便提高实验的准确性；
实施例3：口岸样品的检测
本实施例采用实施例1所述的方法对8份口岸截获的柑桔叶片样品进行检测，8份柑桔叶片样品中3份有检出柑桔溃疡病菌，见图3。
通过以上的口岸样品检测数据发现，采用本发明PCR方法可节约大量检测时间并同时保证更高的特异性和准确性。本发明方法快速、准确、可靠，适用于柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri)的快速检测与鉴定。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实施例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海关科学技术研究中心
<120> 一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法
<130> 2100134-I
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence（人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<223> primer（引物）
<400> 1
atcattcgcc ctagcagcgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence（人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<223> primer（引物）
<400> 2
gcataggaag tagggcggac 20

Claims (11)

1.一种柑桔溃疡病菌的PCR检测用引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物及下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种柑桔溃疡病菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的引物组。
3.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增反应液2xPremix Taq和1-2μg/ml的阳性对照。
4.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物以混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。
5.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L。
6.一种不以疾病诊断为目的的柑桔溃疡病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用权利要求1所述的引物进行PCR检测。
7.如权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：
1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，得到研磨样品；
2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨样品中的DNA，获得待测样本的模板DNA。
8.如权利要求7所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，将待测样本加入液氮后充分研磨至80-100微米；所述植物发病部位组织或干重组织与液氮的重量比例为1：(0.8-2)。
9.如权利要求7所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。
10.如权利要求7所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR检测反应体系为25μL；其中模板DNA 2μl，扩增反应液2xPremix Taq，12.5μl；10μmol/L权利要求1所述的引物各1μL，和无菌水8.5μL。
11.如权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR检测的反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，4℃下保存。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1824801A (zh) * 2005-12-29 2006-08-30 重庆大学 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法
CN101712983A (zh) * 2009-11-04 2010-05-26 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 用于柑橘溃疡病菌检测的引物对及检测方法
CN102534016A (zh) * 2012-01-20 2012-07-04 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于柑桔溃疡病菌检测的lamp引物组
CN102634603A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 湖南农业大学 柑橘溃疡病的pcr检测方法
CN103114135A (zh) * 2013-01-25 2013-05-22 郑媛 柑橘溃疡病菌荧光pcr快速检测引物及试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1824801A (zh) * 2005-12-29 2006-08-30 重庆大学 柑桔溃疡病菌实时荧光pcr检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法
CN101712983A (zh) * 2009-11-04 2010-05-26 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 用于柑橘溃疡病菌检测的引物对及检测方法
CN102534016A (zh) * 2012-01-20 2012-07-04 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于柑桔溃疡病菌检测的lamp引物组
CN102634603A (zh) * 2012-05-10 2012-08-15 湖南农业大学 柑橘溃疡病的pcr检测方法
CN103114135A (zh) * 2013-01-25 2013-05-22 郑媛 柑橘溃疡病菌荧光pcr快速检测引物及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU,X.等: "NCBI Reference Sequence: NZ_CP023662.1", 《GENBANK》 *
熊书等: "柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立", 《植物保护》 *
王中康等: "柑桔溃疡病菌PCR快速检验检疫技术研究", 《植物病理学报》 *

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