CN106701968A - 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR引物及其应用。该组引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。这组引物可以在一个双重PCR反应中分别检测到我国3个葡萄溃疡病菌优势种——小新壳梭孢、可可毛色二孢和葡萄座腔菌与4种葡萄蔓枯病菌的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄苗木以及田间葡萄病样中的葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌，为苗木带菌检测和针对性防治这2类病原菌引起的葡萄枝干病害提供依据。

Description

同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用
技术领域
本发明属于植物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用双重PCR技术检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的方法的建立及双重PCR引物组合物及其应用。
背景技术
近年来，葡萄枝干病害在我国发生日趋普遍，调查结果显示，到目前为止葡萄枝干病害在我国辽宁、山东、浙江、广西等18个省市均有发生，并在部分省份的果园中造成了极为严重的损失。我国的葡萄枝干病害主要有葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病，目前已知引起我国葡萄溃疡病有6种(Li X H,Yan J Y,Kong F F,et al.Botryosphaeriadothideacausing canker of grapevine newly reported in China.Plant Pathology.2010,59(6):1170.Yan J Y,Peng Y L,Xie Y,et al.First Report of Grapevine Trunk DiseaseCaused by Botryosphaeriaobtusa in China.Plant Disease.2011,95(5):616.Yan J Y,Li X H,Kong F F,et al.Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeriarhodina in China.Plant Disease.2011,95(2):219.Yan J Y,Xie Y,Zhang W,et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback inChina.Fungal Diverisity.2013,61:221-236.Dissanayake A J,Zhang W,Liu M,etal.Lasiodiplodiapseudotheobromae causes pedicel and pedunclediscolouration ofgrapes in China.Australasian Plant Disease Notes.2015,10(1):1-5.Dissanayake AJ,Zhang W,Li Xinghong,et al.First report of Neofusicoccummangiferaeassociated with grapevinedieback in China.PhytopathologiaMediterranea.2015,54(2):414-419.)，其中小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)、可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是我国的优势种群。我国葡萄蔓枯病的病原菌种类有4种，分别是Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae(Dissanayake A J,Liu M,Zhang W,etal.Morphological and molecular characterizationof Diaporthe speciesassociated with grapevinetrunk disease in China.Fungal Biology.2015,119:283-294.)。在实际生产中，葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌在田间常发生复合侵染，因此为了能够有针对性的防控葡萄溃疡病和葡萄蔓枯病，开发准确的早期诊断技术十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一组能够同时检测葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae)的双重PCR引物以及一种操作简便、结果可靠的上述两种葡萄枝干病害病原菌的双重PCR检测方法。
基于上述发明目的，分别根据葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae)EF延伸因子和ITS序列上的差异位点，设计了上述两种葡萄枝干病害病原菌的特异性引物，通过对PCR反应程序、体系的反复摸索，建立了这两种葡萄枝干病害病原菌的双重PCR检测体系，能够将葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae)快速准确的区分开来，对于开展繁殖材料带菌检测和上述两种葡萄枝干病害病原菌的动态监测具有重要意义。
本发明所提供的同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。其能够同时用于检测我国3种葡萄溃疡病菌优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae)。
本发明的另一目的是提供一种同时检测葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthesojae)的试剂盒，包括所述的双重PCR引物组。
在本发明的一个技术方案中，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂；所述PCR反应试剂包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、浓缩PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。其中，浓缩PCR缓冲液即为10×PCR缓冲液，是由100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2组成的溶液。
上述双重PCR引物组以及包括该引物组的试剂盒在检测葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)中的应用也属于本发明的保护范围。所述的检测优选为同时检测。
本发明还提供一种检测葡萄溃疡病菌葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和4种葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthehongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)的双重PCR检测方法，包括使用上述引物扩增待测样品。所述扩增过程中还使用PCR反应试剂。PCR反应试剂可以从商业途径获得，也可以自己配置。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA，以该DNA为模板，用权利要求1所述的引物双重PCR扩增；
2)鉴定步骤1)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个365bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄溃疡病菌3个优势种(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)的样品，将扩增产物中含有一个219bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthe sojae)的样品。
PCR反应体系为25μL，包括：待测样品DNA(约5ng，终浓度0.2ng/μL)，KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R引物(10μmol/L)各0.5μL(即终浓度为0.2μmol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度均为2.5mmol/L，2.5μL 10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL，添加终浓度为0.05U/μl)，其余部分用ddH2O补足；
PCR条件为：94℃预变性3min；35个循环的94℃30s，56℃30s和72℃15s；72℃延伸5min。
步骤2)中所述鉴定步骤1)PCR扩增产物的大小的方法是取5μL PCR产物用质量百分浓度为2％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据有无扩增产物判定结果。
上述双重PCR引物可应用于检测引起葡萄枝干病害的葡萄溃疡菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)，其中，本发明的双重PCR引物中的序列1和序列2能够在葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)中特异性的扩增出365bp的产物，序列3和序列4能够在葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthehongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)中特异性的扩增出219bp的产物。而且，本发明的双重PCR引物可以在菌量较少的情况下检测到病原菌的存在，实验证明，当待测DNA样品浓度达10-3μg/μL时即可检出，表明上述方法具有较高的灵敏性。其中，葡萄溃疡病菌特异性检测引物的检测灵敏度为10-3μg/μL，即序列1和序列2组成的引物对葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)基因组DNA的检测灵敏度为10-3μg/μL，葡萄蔓枯病菌特异性检测引物的检测灵敏度为10-5μg/μL，即序列3和序列4组成的引物对葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)基因组DNA的检测灵敏度为10-5μg/μL。这组引物可以在一个双重PCR反应中也可以在DNA浓度分别为10-3μg/μL和10-5μg/μL时分别检测到葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthehongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄繁殖材料以及田间葡萄病样中的葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthehongkongensis,Diaporthe phaseolorum和Diaporthe sojae)。
同时，由于本发明可以减少对葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢，可可毛色二孢和葡萄座腔菌)和葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthe sojae)的鉴定时间，能够尽早的在带菌苗木、繁殖材料和发病早期的病组织中检测到病原菌的存在，实现早期针对性防病控病的目的。
附图说明
图1为本发明的引物KYEF1F/KYEF1R特异性检测的PCR扩增结果，图中，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1-2：小新壳梭孢Neofusicoccumparvum；3-4：可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae；5-6；葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea；7-8：葡萄蔓枯病菌Diaportheeres；9：葡萄蔓枯病菌Diaporthe hongkongensis；10：葡萄蔓枯病菌Diaporthe phaseolorum；11-12：葡萄蔓枯病菌Diaporthe sojae；13：葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsissp.；14：葡萄炭疽病菌Colletotrichumviniferum；15：葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；16：葡萄白腐病菌Coniellavitis；17：葡萄穗轴褐枯病菌Alternariaviticola；18：ddH2O。
图2为本发明的引物MKits-F/MKits-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1-2：小新壳梭孢Neofusicoccumparvum；3-4：可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae；5-6；葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea；7-8：葡萄蔓枯病菌Diaportheeres；9：葡萄蔓枯病菌Diaporthe hongkongensis；10：葡萄蔓枯病菌Diaporthe phaseolorum；11-12：葡萄蔓枯病菌Diaporthe sojae；13：葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsissp.；14：葡萄炭疽病菌Colletotrichumviniferum；15：葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；16：葡萄白腐病菌Coniellavitis；17：葡萄穗轴褐枯病菌Alternariaviticola；18：ddH2O。
图3为本发明的引物KYEF1F/KYEF1R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1-6分别是以浓度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL小新壳梭孢Neofusicoccumparvum基因组DNA为模板的PCR扩增产物，泳道7-12分别是以浓度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae基因组DNA为模板的PCR扩增产物，泳道13-18分别是以浓度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL小新壳梭孢Neofusicoccumparvum基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图4为本发明的引物MKits-F/MKits-R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1-6分别是以浓度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL葡萄蔓枯病菌Diaportheeres基因组DNA为模板的PCR扩增产物，泳道7-12分别是以浓度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL葡萄蔓枯病菌Diaporthe hongkongensis基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图5为本发明引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R的双重PCR反应验证结果，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1为以已知含有葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和葡萄蔓枯病菌Diaporthe sojae基因组DNA为模板的双重PCR扩增产物，泳道2是以已知含有小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)和葡萄蔓枯病菌Diaporthe phaseolorum基因组DNA为模板的双重PCR扩增产物。
图6为本发明的引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R对供试菌株的检测结果，图中，泳道M为分子量Marker(DL2000plus DNA Marker)，泳道1-2：小新壳梭孢Neofusicoccumparvum；3-4：可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae；5-6；葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea；7-8：葡萄蔓枯病菌Diaportheeres；9：葡萄蔓枯病菌Diaporthehongkongensis；10：葡萄蔓枯病菌Diaporthe phaseolorum；11-12：葡萄蔓枯病菌Diaporthe sojae；13：葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsissp.；14：葡萄炭疽病菌Colletotrichumviniferum；15：葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；16：葡萄白腐病菌Coniellavitis；17：葡萄穗轴褐枯病菌Alternariaviticola；18：ddH2O。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一组同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR引物组合物及其检测方法
一、葡萄溃疡病菌Neofusicoccumparvum和Botryosphaeriadothidea双重PCR引物的获得
提取GeneBank中引起我国葡萄溃疡的3种葡萄溃疡病菌优势种(Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodia theobromae和Neofusicoccumparvum)和我国已报道的4种葡萄蔓枯病菌(Diaporthe eres,Diaporthe hongkongensis,Diaporthephaseolorum和Diaporthe sojae)的ITS和EF延伸因子序列(登录号分别为：JX275787；FJ790831；JX275781；JX275796；JX275799；HQ288210；JX462291；GU294713；JX462289；JX462299；JX462306；HQ288254；KJ609004；KJ609008；KJ609014；KJ609019；KJ609005；KJ609017；KJ609018；KJ623314；KJ623310；KJ623303；KJ623299；KJ623313；KJ623300；KJ623304)进行同源性比较。根据3种葡萄溃疡病菌与4种葡萄蔓枯病菌EF延伸因子序列上的差异位点设计出葡萄溃疡病菌的特异性引物KYEF1F/KYEF1R，序列分别为上游正向引物KYEF1F序列：5'-CTTATCACTCTGGTGAGGGGCA-3'(序列表中序列1)；下游反向引物KYEF1R序列：5'-AGGAACCCTTACCGAGCTC-3'(序列表中序列2)。根据4种葡萄蔓枯病菌与葡萄溃疡病菌3个优势种ITS序列上的差异位点，设计得到葡萄蔓枯病菌的特异性引物MKits-F/MKits-R，序列分别为：上游正向引物MKits-F序列：5'-AGGAACCCTTACCGAGCTC-3'(序列表中序列3)；下游反向引物MKits-R序列：5'-GGCCAACCCAACTCTTGTTT-3'(序列表中序列4)。
二、本发明的用于葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌双重PCR引物的效果验证
1、引物合成
KYEF1F/KYEF1R引物：上游正向引物KYEF1F序列：
5'-CTTATCACTCTGGTGAGGGGCA-3'(序列表中序列1)；下游反向引物KYEF1R序列：5'-AGGAACCCTTACCGAGCTC-3'(序列表中序列2)；
MKits-F/MKits-R引物：上游正向引物MKits-F序列：
5'-AGGAACCCTTACCGAGCTC-3'(序列表中序列3)；下游反向引物MKits-R序列：5'-GGCCAACCCAACTCTTGTTT-3'(序列表中序列4)，委托上海生工生物技术有限公司合成。
2、特异性引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R的准确性验证
2.1菌株的采集和鉴定
研究中所用菌株均采用常规组织分离法(方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社.1998：122-137.)分离自我国不同地区的葡萄病样上，获得了菌株的纯培养，并通过接种实验完成了柯赫氏法则的验证。菌株信息如下：
2株小新壳梭孢Neofusicoccumparvum；2株可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae；2株葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea；2株葡萄蔓枯病菌Diaportheeres；1株葡萄蔓枯病菌Diaporthe hongkongensis；1株葡萄蔓枯病菌Diaporthephaseolorum；2株葡萄蔓枯病菌Diaporthe sojae；1株葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsissp.；1株葡萄炭疽病菌Colletotrichumviniferum；1株葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；1株葡萄白腐病菌Coniellavitis和1株葡萄穗轴褐枯病菌Alternariaviticola。
2.2菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定
对上述菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。首先观察28℃黑暗培养箱中培养3-7d的菌落形态，并在显微镜下观察产孢结构特征以及分生孢子形态和颜色等，对菌株种类进行初步确定。进一步采用PCR技术对菌株种类进行分子生物学鉴定，具体方法如下：
采用CTAB法提取菌株DNA，PCR扩增其rDNA—ITS区段用于菌株种类鉴定。PCR反应体系为：Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，10×缓冲液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L Mg2+)2.5μL，dNTP(各2.5mmoL/L)2μL，10μmo1/L引物ITS1(序列为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(序列为：5’-TCCTCCGCTATGAATGC-3’)各0.5μL，模板5-20ng，用双蒸水将反应体系补充至25μL。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物的检测：取5μL PCR扩增产物于0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE。电泳后的凝胶浸在0.5g/mL溴化乙锭染色液中染色l5-20min，清水冲洗后，置于UV紫外成像系统上观察成像，并拍照。
将条带清晰且大小正确的PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司做正反双向测序。将测序结果在NCBI网站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST下的blastn模块与GenBank上已经发表的基因序列进行比对，确定菌株种类。
根据病原菌形态学特征及分子生物学实验结果，参照文献(Yan J Y,Xie Y,ZhangW,et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback inChina.Fungal Diverisity.2013,61:221-236.Dissanayake A,Liu M,Zhang W，etal.Morphological and molecular characterization of Diaporthe speciesassociated with grapevine trunk disease in China.Fungal Biology.2015,283-294.Jayawardena R,Zhang W,Liu M,et al.Identification and characterization ofPestalotiopsis-like fungi related to grapevine diseases in China.FungalBiology.2015,348-361赵奎华.葡萄病虫害原色图鉴[M].北京：中国农业出版社.2006：12-17,30-41,50-57,74-77.)完成病原菌种类鉴定。
2.3本发明的双重PCR方法鉴定
以上述菌株的基因组DNA为模板，分别以引物对KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R进行PCR扩增实验。以ddH2O为模板的PCR反应为阴性对照。
PCR反应体系为25μL，包括：待测样品DNA(5ng)，上游正向引物和下游反向引物终浓度均为0.2μmol/L，2μL dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度各2.5mmol/L)，2.5μL10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，其余部分用ddH2O补足。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；35个循环的94℃30s，58℃30s和72℃30s；72℃延伸10min。
PCR扩增产物用质量百分浓度2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果分别见图1和图2。图1结果表明供试的所有菌株中，只有6株葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢、可可毛色二孢和葡萄座腔菌各2株)扩增得到一条219bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带；同样地，在图2中可见，所有供试菌株中，除在6株葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres和Diaporthesojae各2株，Diaporthehongkongensis和Diaporthephaseolorum各1株)扩增到一条365bp的DNA特异性扩增片段外，其余菌株中均扩增不到任何条带。
上述结果表明，本发明对葡萄溃疡病菌的的3个优势种和4种葡萄蔓枯病菌的检测特异性100％。
3、引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R的灵敏性验证
将葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌菌株基因组DNA浓度调整为1μg/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10-6μg/μL作为模板，分别以引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R进行PCR扩增，PCR体系和反应程序按照步骤2中所述，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3和图4，引物KYEF1F/KYEF1R对3种葡萄溃疡病菌的检测灵敏度为10-3μg/μL，引物MKits-F/MKits-R对4种葡萄蔓枯病菌的检测浓度为10-5μg/μL。
4、引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R的双重PCR反应验证
PCR反应体系为25μL，包括：含有葡萄溃疡病菌和/或葡萄蔓枯病菌菌株的基因组DNA(1-10ng)，引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R终浓度均为0.2μmol/L，2μL dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度各2.5mmol/L)，2.5μL 10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余部分用ddH2O补足。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；35个循环的95℃30s，56℃30s和72℃15s；72℃延伸5min。PCR扩增产物用质量百分浓度2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图5，利用引物KYEF1F/KYEF1R和MKits-F/MKits-R可以在一个双重PCR反应体系中分别检测到葡萄溃疡病菌和/或葡萄蔓枯病菌的存在。
利用该反应体系和反应程序对步骤2所述的菌株进行双重PCR检测，结果见图6，供试的所有菌株中，只有6株葡萄溃疡病菌(小新壳梭孢、可可毛色二孢和葡萄座腔菌各2株)扩增得到一条219bp的DNA特异性扩增片段，6株葡萄蔓枯病菌(Diaportheeres和Diaporthesojae各2株，Diaporthehongkongensis和Diaporthephaseolorum各1株)扩增到一条365bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带。
同样，利用本发明的上述双重PCR反应体系和反应程序进行如步骤3所述的灵敏度检测，结果表明，将葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌检出的DNA浓度为分别为10-3μg/μL和10-5μg/μL。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用
<130>WHOI170002
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cttatcactc tggtgagggg ca 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
aggaaccctt accgagctc 19
<210> 3
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ggccaaccca actcttgttt 20
<210> 4 <211>18
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ggggtttaac ggcagggc 18

Claims (10)

1.一组检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。
2.根据权利要求1所述的检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR引物组，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)、可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌为Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。
3.一种同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的试剂盒，包括权利要求1或2所述的双重PCR引物组。
4.根据权利要求3所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
5.权利要求1或2所述的双重PCR引物组以及权利要求3或4所述的试剂盒在检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢、可可毛色二孢和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌为Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。
7.同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的双重PCR方法，包括下述步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的双重PCR引物组进行双重PCR扩增；
3)鉴定步骤2)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个219bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄溃疡病菌的样品，将扩增产物中含有一个365bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄蔓枯病菌的样品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢、可可毛色二孢和/或葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)，所述葡萄蔓枯病菌为Diaportheeres,Diaporthehongkongensis,Diaporthephaseolorum和/或Diaporthesojae。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双重PCR扩增的反应体系为25μL，包括：待测样品DNA 0.01-0.8ng/μL，序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸终浓度分别为0.2μmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度分别为2.5mmol/L，2.5μL 10×PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶终浓度为0.05U/μl，其余部分用ddH2O补足；其中，10×PCR缓冲液是由100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2组成的溶液。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：双重PCR反应条件为：94℃预变性3min；35个循环的95℃30s，56℃30s和72℃15s；72℃延伸5min。
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