CN101921843A - 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 - Google Patents
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101921843A CN101921843A CN2010102186702A CN201010218670A CN101921843A CN 101921843 A CN101921843 A CN 101921843A CN 2010102186702 A CN2010102186702 A CN 2010102186702A CN 201010218670 A CN201010218670 A CN 201010218670A CN 101921843 A CN101921843 A CN 101921843A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- xrpod
- primer
- xoo
- rice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001272684 Xanthomonas campestris pv. oryzae Species 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 241000589652 Xanthomonas oryzae Species 0.000 title abstract description 5
- 241000589649 Xanthomonas campestris pv. campestris Species 0.000 title abstract description 4
- 241000520892 Xanthomonas axonopodis Species 0.000 title abstract 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 320
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 107
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 106
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 106
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 106
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 59
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 59
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 59
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 59
- 241000207199 Citrus Species 0.000 claims description 57
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 claims description 57
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 54
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 50
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 claims description 3
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 claims 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 10
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010089727 siderophore receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000589655 Xanthomonas citri Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，本方法通过两对引物同时对检测样本的DNA模板进行PCR反应扩增得到PCR产物，然后PCR产物与基因芯片上设置的特异性探针杂交，根据杂交结果阳性与否，来判断出检测样本是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌或甘蓝黑腐病菌；本发明能一次性对4种细菌完成检测，检测速度快，并且检测结果直观明了，容易判断。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的快速检测技术。
背景技术
黄单胞菌属Xanthomonas种类繁多，致病性多样，第2版的《伯杰氏系统细菌学手册》收录了20个种，70个分类地位已经确定的致病变种和70个分类地位尚不确定的致病变种。现行的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中收录了14个检疫性黄单胞菌。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv. oryzicola，Xooc)是水稻上重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌可造成水稻减产10％～30％，严重时可达50％以上。水稻细菌性条斑病菌可造成水稻减产5％～10％，严重时可达20％。柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri，Xac)能够侵染为害绝大多数柑桔栽培品种，是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病菌。以上三者都是我国重要的检疫性细菌。甘蓝黑腐病菌(X.campestris pv.campestris，Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，在世界范围内，尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物如甘蓝、花椰菜和大白菜等发生黑腐病，对蔬菜生产造成严重的经济损失。
若要有效防止上述4种黄单胞菌进境，就必须要有快速准确的诊断方法。鉴定黄单胞菌的方法主要有生理生化方法、基于PCR技术的分子生物学方法等。生理生化方法，操作步骤繁琐，一股鉴定一种菌需要15天左右的时间，太耗时，而且相关人员需要丰富的经验。基于PCR技术的分子生物学，对黄单胞菌检测主要有普通PCR、双重PCR、实时荧光PCR和滚环扩增等方法；这些方法存在易污染、灵敏度低，而且每次只能检测一种致病菌等不足。
发明内容
本发明的目的是克服以上技术缺陷，提供一种快速检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌的方法。
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物； 其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具
有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
c、杂交：将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
d、采集杂交结果；
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。 进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其具有如下序列，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG；
步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列，
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
步骤e还包括将探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2杂交结果与阳性定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其具有如下序列，阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC。
进一步地，步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
进一步地，步骤a之前还包括菌种的培养的步骤；具体地，菌种的培养是指30℃下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。
本发明的再一目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
本发明的第三目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第四目的是提供一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第五目的是提供一种用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第六目的是提供一种用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明提供的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，通过采用引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物同时对检测样本潜在的4种病菌的DNA模板进行PCR反应，因此速度快。通过基因芯片上设置的特异性探针与PCR产物杂交，能快捷准确得出反应结果阳性与否，这种杂交方法不易污染、灵敏度高；采用基因芯片杂交结果判断检测结果，技术人员无需丰富的形态学知识和经验，检测结果直观明确。
附图说明
图1是基因芯片杂交结果一；
图2是基因芯片杂交结果二；
图3是基因芯片杂交结果三；
图4是基因芯片杂交结果四；
图5是基因芯片杂交结果五；
图6是基因芯片杂交结果六。
具体实施方式
实施例1
检测样本A是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：在30℃下、将检测样本A在营养琼脂培养基上培养2-3天；提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
细菌基因组DNA的提取是公知技术，本实施例中具体操作如下：1)1.5mL菌液，室温13000r/min离心5min，去上清；2)取沉淀加浓度为50g/L的溶菌酶100μL，悬浮菌液，37°C，放置2h；3)加入TE 385μL，20％SDS 15μL，煮沸10min；4)用等体积的酚氯仿抽提，充分振荡混匀，4℃13000r/min离心5min，将上清移至灭菌离心管；5)加1mL冰无水乙醇，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；6)4℃13000r/min离心10min，弃上清，冰无水乙醇洗涤1次，75％乙醇洗涤2次，溶解于100μL ddH2O，-20℃保存备用。
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
PCR反应体系为：0.25mmol/L 10×Buffer(Mg2+free)(大连宝生物)、2.0mmol/L MgCl2(大连宝生物)、0.2mmol/L CY5-dNTPs(Amersham Biosciences公司)、正向引物(XrpoD-F，PSRG-F)和反向引物(XrpoD-R，PSRG-R)各0.2μmol/L、1U Taq酶(大连宝生物)、模板DNA 10～20ng，总体积25μL。标记PCR扩增在T3PCR仪(德国Biometra公司)上进行，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃10min。
c、杂交：将PCR产物、互补链探针AntiPos-ck与基因芯片上的特异性探针杂交；其中， 基因芯片上的探针包括特异性探针Xoo-S1、特异性探针Xooc-S1、特异性探针Xac-A1、特异性探针Xcc-S2、阳性定位点探针Pos-ck和阴性质控探针Neg-CK，各探针分别具有如下序列：
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC，
互补链探针AntiPos-ck是阳性定位点探针Pos-ck的互补链探针，该探针可与阳性定位点探针Pos-ck杂交并使得阳性定位点探针Pos-ck显示阳性；探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
基因芯片上还设置有空白对照，基因芯片上各特异性探针、阳性定位点探针、阴性质控探针和空白对照具有表1所示的布局：
表1
| Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck | Pos-ck |
| Pos-ck | Xoo-S1 | Xoo-S1 | Xoo-S1 | Xoo-S1 | Xoo-S1 | Xooc-S1 | Xooc-S1 | Xooc-S1 | Xooc-S1 | Xooc-S1 |
| Pos-ck | Xac-A1 | Xac-A1 | Xac-A1 | Xac-A1 | Xac-A1 | Xcc-S2 | Xcc-S2 | Xcc-S2 | Xcc-S2 | Xcc-S2 |
| Pos-ck | Neg-CK | Neg-CK | Neg-CK | Neg-CK | Neg-CK | 空白对 照 | 空白对 照 | 空白对 照 | 空白对 照 | 空白对 照 |
芯片基片选择晶芯光学级醛基基片(北京博奥生物有限公司)；探针用TE缓冲液(pH 8.0)稀释至终浓度40μmol/L，将50％DMSO加入384孔板中，再加入等量的探针溶液，轻轻混匀，并按表1设计的探针顺序，用芯片点样仪(德国GeSim公司)将探针点至基片上；点样后基片经37℃水合12h，用0.2％SDS溶液漂洗5min；去离子水分别漂洗3次，每次2min；再将基片放入0.2％NaBH4封闭液中漂洗15min，前5min搅拌，中间5min静置，后5min搅拌；去离子水漂洗3次，每次2min；2000r/min室温离心2min，4℃避光保存；用激光共聚焦扫描仪GenePix 4200A(美国Axon公司)对基片进行预扫描质检；
杂交过程如下：分别取杂交液7μL(2％SDS和5％SSPE等体积混合)、PCR产物6μL和互 补链探针AntiPos-ck 1μL，混匀后95℃变性5min，立即于冰水中放置5min。将变性后的混合物加入基因芯片点样区，盖上盖玻片置于湿盒中50℃避光杂交3h。杂交后的基因芯片依次在洗液I(0.3×SSC，0.2％SDS)和洗液II(0.06×SSC)中各清洗2min，室温2000r/min离心2min。
d、采集杂交结果；用激光共聚焦扫描仪扫描基因芯片，用GenePix 5.0软件分析扫描得到的图像，杂交结果如图1所示。
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，同时参照基因芯片上的阳性定位点探针Pos-ck杂交结果、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，判断探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2的杂交结果阳性与否，来判断检测样本A中是否含有探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2对应的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
在本实施例中探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阳性，因此检测样本A含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌。
实施例2
检测样本B是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图2所示，即探针Xoo-S1为阳性，因此检测样本B含有水稻白叶枯病菌，不含水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例3
检测样本C是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图3所示，即探针Xooc-S1为阳性，因此检测样本C含有水稻细菌性条斑病菌，不含水稻白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例4
检测样本D是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图4所示，即探针Xac-A1为阳性，因此检测样本D含有柑桔溃疡病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例5
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图5所示，即探针Xcc-S2为阳性，因此检测样本E含有甘蓝黑腐病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃疡病菌。
实施例6
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图6所示，即探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阴性，因此检测样本F不含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种病菌。
实施例7
用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；并且引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰。
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR 产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
实施例8
用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例9
用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例10
用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病 菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例11
用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC。
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例12～28采用已知样本病菌作为检测样本，并采用实施例1完全相同的检测方法进行检测，以验证引物、探针的有效性和特异性；各实施例具体数据如表2所示。
表2
| 实施例 | 检测样 本序号 | 样本名称 | 来源 | 检测结果 | 结论 |
| 12 | G | 水稻白叶枯病菌 | 南京农业大学 | 探针Xoo-S1呈阳 性 | 探针Xoo-S1及引物对 样本病菌有效 |
| 13 | H | 水稻白叶枯病菌 | 南京农业大学 | 探针Xoo-S1呈阳 性 | 探针Xoo-S1及引物对 样本病菌有效 |
| 14 | I | 水稻白叶枯病菌 | 中国检验检疫科学 研究院 | 探针Xoo-S1呈阳 性 | 探针Xoo-S1及引物对 样本病菌有效 |
| 15 | J | 水稻细菌性条斑 病菌 | 南京农业大学 | 探针Xooc-S1呈 阳性 | 探针Xooc-S1及引物 对样本病菌有效 |
| 16 | K | 水稻细菌性条斑 病菌 | 南京农业大学 | 探针Xooc-S1呈 阳性 | 探针Xooc-S1及引物 对样本病菌有效 |
| 17 | L | 水稻细菌性条斑 病菌 | 中国检验检疫科学 研究院 | 探针Xooc-S1呈 阳性 | 探针Xooc-S1及引物 对样本病菌有效 |
| 18 | M | 柑桔溃疡病菌 | 南京农业大学 | 探针Xac-A1呈阳 性 | 探针Xac-A1及引物对 样本病菌有效 |
| 19 | N | 柑桔溃疡病菌 | 中国检验检疫科学 研究院 | 探针Xac-A1呈阳 性 | 探针Xac-A1及引物对 样本病菌有效 |
| 20 | 0 | 甘蓝黑腐病菌 | 南京农业大学 | 探针Xcc-S2呈阳 性 | 探针Xcc-S2及引物对 样本病菌有效 |
| 21 | P | 甘蓝黑腐病菌 | 中国检验检疫科学 研究院 | 探针Xcc-S2呈阳 性 | 探针Xcc-S2及引物对 样本病菌有效 |
| 22 | Q | 玉米细菌性枯萎 病菌 | 深圳出入境检验检 疫局动植中心 | 探针Xoo-S1、探 针Xooc-S1、探针 Xac-A1、探针 Xcc-S2均阴性 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
| 23 | R | 西瓜果斑病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
| 24 | S | 洋葱腐烂病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
[0154]
| 25 | T | 番茄细菌性溃疡 病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
| 26 | U | 玉米细菌性萎蔫 病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
| 27 | V | 马铃薯环腐病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
| 28 | W | 菜豆晕疫病菌 | 中国农业大学种子 健康检测中心 | 同上 | 探针相对样本病菌具 有特异性 |
由表1可知，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌有效扩增，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌三种黄单胞菌有效扩增，探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2具有特异性。
实施例1～6、12～28均设置了用于质控杂交、方便判断杂交结果阳性与否的阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照；阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，不是本发明中所必需的，熟练的检测人员可以在不设置阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照的情况下做好杂交质控、判断杂交结果阳性与否。
Claims (10)
1.水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
c、杂交：将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；
探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
d、采集杂交结果；
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
2.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其具有如下序列，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG；
步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列，
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
步骤e还包括将探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2杂交结果与阳性定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
3.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其具有如下序列，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC。
4.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
5.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：步骤a之前还包括培养检测样本的步骤。
6.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：培养检测样本是指30℃下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。
7.用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，其特征是：PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
8.用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，其特征是：引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG。
9.用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，其特征是：引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG。
10.用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，其特征是：引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102186702A CN101921843B (zh) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102186702A CN101921843B (zh) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101921843A true CN101921843A (zh) | 2010-12-22 |
| CN101921843B CN101921843B (zh) | 2012-07-04 |
Family
ID=43337058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102186702A Expired - Fee Related CN101921843B (zh) | 2010-07-06 | 2010-07-06 | 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101921843B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102352415A (zh) * | 2011-10-31 | 2012-02-15 | 云南大学 | 一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用 |
| CN103215374A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-07-24 | 新疆农业大学 | 鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测试剂盒及检测方法 |
| CN103361400A (zh) * | 2012-03-29 | 2013-10-23 | 广西大学 | 水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法 |
| CN106701968A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-24 | 北京市农林科学院 | 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用 |
| CN107338313A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-10 | 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种利用数字pcr检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒 |
| CN111304275A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-19 | 济宁利马菌业股份有限公司 | 一种用于检测金针菇黑腐病的培养基及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1524964A (zh) * | 2003-02-26 | 2004-09-01 | 国家质量检验检疫总局动植物检疫实验 | 应用于水稻白叶枯病菌检测的探针和引物序列 |
| CN1546666A (zh) * | 2003-12-05 | 2004-11-17 | 浙江大学 | 一种水稻抗白叶枯抗性相关基因、蛋白及其用途 |
| CN101608235A (zh) * | 2009-03-27 | 2009-12-23 | 南京农业大学 | 水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌的padlock探针及多重检测方法 |
-
2010
- 2010-07-06 CN CN2010102186702A patent/CN101921843B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1524964A (zh) * | 2003-02-26 | 2004-09-01 | 国家质量检验检疫总局动植物检疫实验 | 应用于水稻白叶枯病菌检测的探针和引物序列 |
| CN1546666A (zh) * | 2003-12-05 | 2004-11-17 | 浙江大学 | 一种水稻抗白叶枯抗性相关基因、蛋白及其用途 |
| CN101608235A (zh) * | 2009-03-27 | 2009-12-23 | 南京农业大学 | 水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌的padlock探针及多重检测方法 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102352415A (zh) * | 2011-10-31 | 2012-02-15 | 云南大学 | 一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用 |
| CN103361400A (zh) * | 2012-03-29 | 2013-10-23 | 广西大学 | 水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法 |
| CN103361400B (zh) * | 2012-03-29 | 2016-08-03 | 广西大学 | 水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法 |
| CN103215374A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-07-24 | 新疆农业大学 | 鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测试剂盒及检测方法 |
| CN106701968A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-05-24 | 北京市农林科学院 | 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用 |
| CN106701968B (zh) * | 2017-01-22 | 2020-07-28 | 北京市农林科学院 | 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用 |
| CN107338313A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-10 | 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种利用数字pcr检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒 |
| CN111304275A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-19 | 济宁利马菌业股份有限公司 | 一种用于检测金针菇黑腐病的培养基及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101921843B (zh) | 2012-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101921843B (zh) | 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 | |
| CN104232782B (zh) | 一种检测烟草土传真菌病原物的pcr引物及应用与方法 | |
| CN113151522A (zh) | 基于lfd-rpa技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用 | |
| CN101492739B (zh) | 奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法 | |
| Kang et al. | Simple detection of Cochliobolus fungal pathogens in maize | |
| CN115976254A (zh) | 用于植物病原尖孢镰刀菌的rpa-lfd引物及检测法 | |
| CN103014144A (zh) | 检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法 | |
| Changtor et al. | Rapid detection of Sclerotium rolfsii causing dry stem and root rot disease in cassava by recombinase polymerase amplification technique (RPA) combined with CRISPR/Cas12a | |
| CN105039535B (zh) | 一种用于检测梨黑斑病菌的引物及利用其检测梨黑斑病菌的检测方法 | |
| CN108624655A (zh) | 马铃薯晚疫病菌实时荧光lamp检测方法及试剂盒 | |
| CN111321242A (zh) | 橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用 | |
| CN114703313B (zh) | 一种菰黑粉菌分型鉴定方法及其应用 | |
| CN114958875A (zh) | 柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用 | |
| CN101418337A (zh) | 玉米及其制品中腐马素产毒菌株的复合pcr检测方法 | |
| Allawi | Isolation and Identification of Penicillium rubens from the Local Strain in Mosul, Iraq, and Investigation of Potassium Phosphate Effect on its Growth | |
| Hussain et al. | Molecular Characterization of Deciphering Fungal Community Structure in Zea Mays L. and Triticum Aestivum L | |
| Paraguison-Alili et al. | Application of molecular tools in detecting zoonotic pathogens in organic fertilizers and liquid supplements | |
| CN1261590C (zh) | 菌血症检验用基因芯片的检验方法 | |
| Rivelli Zea et al. | Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification for the Detection of Prototheca bovis Directly from Milk Samples of Dairy Cattle | |
| CN114107532B (zh) | 用于鉴定铜绿假单胞菌的分子靶标及其定量检测方法 | |
| CN109504789A (zh) | 用于副溶血弧菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用 | |
| CN102304560B (zh) | 发酵乳酸杆菌的荧光定量pcr快速检测方法 | |
| AU2021101342A4 (en) | Enhanced loop-mediated isothermal amplification method for detecting latent xap infection in pomegranate | |
| Alghuthaymi | Cultural, anastomosis, and universally primed PCR typing of Rhizoctonia solani from potato | |
| Weir et al. | Development of an advanced PCR technique to detect grapevine trunk diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120704 Termination date: 20130706 |