CN102352415A - 一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。该制备方法包括将均一化的cDNA文库的cDNA质粒和差减cDNA文库的cDNA质粒贮存在384孔板的孔中，并依次编号；用SSC作为阴性对照，用β-actin的cDNA为阳性对照，按编号顺序依次将所提取的均一化的cDNA文库的cDNA质粒和差减cDNA文库的cDNA质粒，阴性对照和阳性对照在一张载体上制成所述的基因芯片。该基因芯片中的cDNA类型更能全面反映与抗水稻白叶枯病有关的基因cDNA，在后续应用中保证最大限度地检测、筛选出抗水稻白叶枯病相关基因。其cDNA平均程度为500bp，应用时特异性更好，提高了检测利用效率。

Description

一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用

技术领域

本发明属基因芯片技术领域。具体涉及一种检测应答水稻白叶枯病的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。

背景技术

水稻白叶枯病是仅次于稻瘟病的第二大世界性水稻病害，它的病原菌是黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)，因此，在现有基因芯片先进技术的基础上，研究出一种适宜认识抗水稻白叶枯病的基因分子基础，发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，抗水稻白叶枯病的表达谱，分析抗病相关基因在病原菌处理前后的表达，抗水稻白叶枯病的机制研究的基因芯片的制备方法及其基因芯片，对培育高抗水稻白叶枯病的水稻新品种具有重要意义。

基因芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。目前基因芯片技术以其快速、高通量、大规模、高度自动化、高度并行性、高灵敏度等优点，已经在大规模DNA测序、基因表达分析、基因型筛选、基因突变及多态性检测、疾病的诊断及治疗、药物筛选、新基因的发现克隆及功能研究等领域得到了广泛的应用。

基因芯片按所点DNA的种类不同可分为两种：寡核苷酸微阵列和cDNA微阵列。寡核苷酸微阵列是指主要利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制备成高密度的寡核苷酸阵列，寡核苷酸的长度随芯片用途不同而不同，但一般在50 bp以内，以8～25 bp为多。寡核苷酸微阵列密集程度高，一致性和可重复性好，但费用高、灵活性差，主要用于DNA序列测定、SNP分析等，也可用于表达谱研究。cDNA 微阵列是指利用点样法制备的较低密度的玻片或尼龙膜芯片，芯片上固定的探针主要是cDNA 片段。cDNA微阵列对靶基因检测的特异性好，技术相对简单、灵活性高，但重复性稍差，主要用于表达谱研究。根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因芯片的制作方法主要有两种，一是Affymetrix公司采用的原位合成法，二是将PCR得到的cDNA、寡核苷酸片段等直接点样，又叫合成后点样。对于基因组序列己知的生物，可以直接根据序列设计全基因组基因芯片。用Array Designer软件设计引物，在合成DNA片段前用序列同源性搜索软件分析，保证扩增片段不与基因组其它序列杂交，通过PCR可以扩增获得代表每个ORF的DNA片段，经纯化后可以点到玻片上。而对于基因组序列未知的生物，可以用DNA文库制备基因芯片。

基因芯片技术已被广泛应用于基因差异表达检测，也被逐渐用成植物抗病机理研究手段。用基因芯片检测表达谱，能提供大量信息有助于阐明防御应答网络，可分析评价多种防御途径之间的交流，利于对抗病机制的了解和抗病候选基因的筛选。已有的基因芯片技术研究水稻抗病机制中，是以水稻基因组相关基因制作芯片，提取病原物侵染后水稻叶片组织的RNA，反转录成cDNA后再与芯片杂交、分析。但现有技术的cDNA 微阵列的制备上还存在cDNA片段仅来自cDNA文库，使芯片中的cDNA质粒类型单一，不能全面反应待检测对象相关的基因的缺陷和不足，也还缺少一些重要材料如能免疫水稻白叶枯病的疣粒野生稻在应答水稻白叶枯病原菌处理（胁迫）后的cDNA 微阵列基因芯片，制约了全面深入认识、研究水稻抗白叶枯病的基因分子机制。

疣粒野生稻（Oryza meyeriana）对水稻白叶枯病具有高度的抗病性，彭绍裘等用湖南白叶枯病强菌系对云南普通野生稻，药用野生稻，疣粒野生稻进行检测，发现疣粒野生稻抗性水平达到免疫级（彭绍裘等，“野生稻多抗(病)性鉴定——高抗白叶枯病的抗源-疣粒野生稻”，《湖南农业科学》 1981年05期 ），章琦等鉴定了三种野生稻对水稻白叶枯病的抗性，参试的13个野生稻种共871份材料，抗性测定结果表明：多数野生稻种具有抗性优良的资源，就抗性水平而言，以疣粒野生稻最为突出，参试的疣粒野生稻全部高抗，整个生育期都表现高抗，甚至免疫（章琦,“ 水稻白叶枯病抗性的遗传及改良”。 科学出版社 2007年9月，北京第1版。），因此，进一步利用疣粒野生稻为材料制备应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，对发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，研究疣粒野生稻抗水稻白叶枯病的机制，对于选育抗白叶枯病的水稻新品种具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有制备cDNA芯片的cDNA类型单一，不能尽可能地包含与抗病相关的cDNA，使芯片在应用上不能够最大限度地把相关基因检测处理，另一方面，还没有基于疣粒野生稻能免疫白叶枯病能够提供更全面认识抗病分子机制的信息的基因芯片及其制备方法，其目的是提供一种适宜检测应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。

为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明所提供的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

（1） 构建cDNA文库

以接种蒸馏水的水稻叶片和接种Xoo后24h、48h、72h的水稻叶片作为总RNA的提取材料，构建cDNA文库；

（2） 均一化步骤（1）构建的cDNA文库；

（3） 构建差减cDNA文库

以接种Xoo后24h、48h、72h、96h和120h的水稻叶片等量取材作为接种样品，以接种样品作为差减杂交的试验方（tester）, 接种蒸馏水的水稻叶片等量取材作为驱动方（driver），构建差减cDNA文库；

（4） 将步骤（2）均一化的cDNA文库的cDNA质粒和步骤（3）差减cDNA文库的cDNA质粒， 贮存在384孔板的孔中，并从第1块384孔板的第1个孔开始依次编号；用SSC作为阴性对照，用β-actin 的cDNA为阳性对照，β-actin 在GenBank库登录号是XM-469569.1，阴性对照和阳性对照在cDNA质粒之后依次贮存在384孔板的孔中，并依次编号；

（5） 重复步骤（4）提取cDNA质粒，按步骤（4）的编号顺序依次将所提取的cDNA质粒、所述的阴性对照和阳性对照用生物芯片点样仪点在一张载体上，cDNA质粒不设重复，所述的阴性对照和阳性对照各设8个重复。

步骤（5）所述的载体为玻片。

步骤（1）和步骤（3）所述的水稻叶片为水稻孕穗期叶片。

步骤（1）和步骤（3）所述的水稻叶片为疣粒野生稻（Oryza meyeriana）叶片。

所述的疣粒野生稻叶片为疣粒野生稻孕穗期的叶片。

本发明所提供的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，是用上述本发明所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备获得。

本发明还提供了一种用本发明所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片在检测应答水稻白叶枯病菌基因及其相关基因表达的应用。

所述的应用是将待检测水稻接种Xoo ，分别取接种Xoo后24h、48h和72h的水稻叶片为三个处理，将三个处理按常规方法提取总RNA，将三个处理的总RNA等量混合后,在逆转录时用Cy5标记，以接种蒸馏水的待检测水稻的叶片为对照材料，将对照材料按常规方法提取总RNA，取对照材料的总RNA在逆转录时用Cy3标记，将标记Cy5的cDNA和标记Cy3的cDNA按常规DNA杂交方法与本发明制备的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片预杂交、杂交、进行图像处理和分析，将有杂交信号点所对应的克隆进行测序，将测序结果与GenBank或Protein DataBank进行BLAST比较，进行基因分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果

1、首次采用全世界范围所有稻属植物中，唯一能高抗白叶枯病达到免疫程度的疣粒野生稻作为制备cDNA的试验材料，其弥补了过去水稻上有关芯片制作中，缺乏能免疫白叶枯病的研究实验材料的不足。制作的芯片更能反应强抗白叶枯病相关的基因情况。

2、本发明制备基因芯片的方法在同一张芯片中的cDNA来自于用水稻白叶枯病处理后的叶片的均一化cDNA,以及水稻白叶枯病原菌处理后叶片的消减杂交后的cDNA，这样能够使芯片中的cDNA类型更能全面反映与抗水稻白叶枯病有关的基因cDNA，能够在后续应用中，保证最大限度地检测、筛选出抗水稻白叶枯病相关基因。

3、本发明基因芯片制作中使用的cDNA，平均长度为500bp，比以往的文献报道和芯片制作中的寡核苷酸片段（长度50bp）制作的芯片，在应用时特异性更好，因为芯片上的DNA长度越长，其检测的特异性越高，出现假阳性的可能性越小，使检测之后的鉴定和筛选工作效率更高。总体来说是提高了本基因芯片的检测利用效率。

4、用本发明的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备的基因芯片在应用中检测出了一批在水稻白叶枯病原菌处理后上调或下调表达的基因，并且功能预测发现一批与抗病密切相关的基因。说明本发明的基因芯片的制备方法制备的基因芯片本芯片在揭示水稻抗免疫白叶枯病的基因分子基础和机制，抗病基因的筛选发掘等方面有很大的利用价值。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是β-actin引物的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是β-actin引物的下游引物的碱基序列。

附图说明

图1是本发明基因芯片的制备方法的简要技术路线流程图。

图2是采用本发明基因芯片检测应答水稻白叶枯病菌基因及其相关基因表达的简要操作步骤流程图。

图3是cDNA文库构建电泳检测组图，图3A表示接种Xoo后1-3天及对照总RNA，CK表示对照总RNA，1d表示接种Xoo后1天（即24h）的总RNA，2d表示接种Xoo后2天（即48h）的总RNA，3d表示接种Xoo 后3天（即72h）的总RNA；图3B表示接种Xoo后的实验材料的mRNA, 图3C表示合成第一链cDNA和第二链cDNA，a为第一链cDNA，b为第二链cDNA,M为marker。

图4是差减法获得的差减cDNA文库中随机挑取30个菌落的长度电泳检测图，M为marker，1-30为差减cDNA文库中随机挑取30个菌落的电泳检测长度条带。

图5是用本发明基因芯片制备方法制备的基因芯片未杂交时扫描结果图，图5A是未杂交的芯片扫描的总体图，图5B其中随机选取一个局部放大图。

图6是用本发明基因芯片制备方法制备的基因芯片杂交后芯片扫描结果图，图6A是该芯片与待检测样品杂交后的扫描总体图，图6B是该总体图中随机选取有杂交信号点的局部放大图，图6B中标记1-5表示杂交信号点，更清晰地反映出应答基因。

图7是本发明基因芯片杂交信号散点图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述。以下各实施例无特别说明，所采用的方法均为常规方法。

1、主要仪器

AIR-TECH超净工作台（苏净集团安泰公司），(PTC200) PCR仪 （MJ公司）， （DU640）紫外分光光度计（ BECKMAN公司），（SYNGENE）凝胶成相系统（Gene Company Limited），(ACADEMIC-Q)超纯水器（MILLIPORE公司），VersAITay芯片点样仪，

（J2-MI） 低温高速离心机（BECKMAN公司），Gene Pix 4000B扫描仪（AXON Instruments, Inc 产品），(ULTRA LOW)超低温冰箱（SANYO公司），UNIPLATE V型底384孔板，Montage PCR₉₆滤膜板、CSS一100醛基化片基购买自Gene Company Limited。

2、主要试剂

蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司），Taq DNA聚合酶（上海生工生物工程有限公司）Cy5-dUTP （Amersham Pharmacia Biotech公司），RQI DNase、SuperScript^TM Ⅲ RT反转录酶、CySCribe Post一labelling标记试剂盒、ExpressHyb杂交缓冲液都购买自Amersham Pharmacia Biotech公司，DNA Ladder（MD108 50bp 和MD115 200bp）、其它各种化学试剂都为国产分析纯。

3、培养基

肉汁冻培养基(NA培养基)：

牛肉浸膏 3g

蛋白胨 7.5g

蔗糖 10g

蒸馏水 1000mL

PH 7.0

固体NA培养基再加15g琼脂粉。

4、菌株与植物材料

水稻白叶枯病菌株C1是中国强致病型生理小种，水稻白叶枯病菌株Y8是云南强致病型生理小种。本发明所用的水稻白叶枯病的病原菌黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)以及实施例采用的Xoo菌株C1和Xoo菌株Y8是利用Xoo的致白叶枯病的致病共性来感染植株，而非特异菌株，因此具有致病力的各种能感染白叶枯病的菌株都能达到本发明的目的和效果，这些菌株均可向云南省农业科学院生物所索取。

水稻栽培品种米泉黑芒作为易感白叶枯病对照品种。

以下实施例采用疣粒野生稻作为实验材料，如前所述，疣粒野生稻具有强抗白叶枯病的优越性，对于研究抗白叶枯病的新基因及其相关基因发掘，抗白叶枯病机制是理想的材料，更能反应强抗水稻白叶枯病相关的基因情况及其机制。也可采用其它水稻材料用本发明所述的制备方法制备所述的基因芯片及其应用。

实施例 1 应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片

1、芯片上cDNA探针的制备

1.1 用Xoo诱导处理疣粒野生稻获得基因表达后的cDNA，按构建cDNA文库的常规方法构建cDNA文库

1.1.1 试验材料接种Xoo

用Xoo菌株C1、Y8剪叶接种孕穗期的疣粒野生稻及栽培稻品种“米泉黑芒”, 米泉黑芒作为感病对照品种。

将C1、Y8菌株接种到NA培养基上，28℃活化培养72小时，分别将活化培养的C1、Y8菌株用灭菌双蒸水稀释到OD260为0.6，用于接种。接种时剪刀蘸菌液或灭菌双蒸水于距叶尖2cm处剪下，以灭菌双蒸水设对照。接种时温室温度为35℃。并分别于接种后24h、48h、72h的剪叶为材料，各处理叶片剪下后立即冻入液氮中，之后放于-70℃冰箱备用。每个处理留一些叶片观察感病情况。接种后15天，观察植株感病情况。米泉黑芒接种C1、Y8菌株植株感病，病斑长度超过8cm；疣粒野生稻未感病。说明所用C1、Y8菌株有活力。

1.1.2 疣粒野生稻总RNA提取及mRNA纯化

叶片总RNA的抽提采用TRIzol Reagent（天根公司）提取总RNA的试剂盒方法，分别以疣粒野生稻接种C1、Y8菌株不同时间（接种24h, 48h, 72h三个处理）及接种蒸馏水叶片（对照）为材料，以接种蒸馏水的水稻叶片和接种Xoo后24h、48h、72h的水稻叶片作为总RNA的提取材料，提取总RNA。紫外分光测浓度，并进行电泳检测。

疣粒野生稻总RNA的变性琼脂糖胶电泳检测结果见图3A，28SrRNA的量为18SrRNA的两倍，总RNA纯度好，RNA完整性好未降解。

mRNA纯化用上海华舜生物有限公司的mRNA Isolation Ⅰsystem from Tatal RNA and mRNA Isolation Ⅱsystem from Tissue/cell 试剂盒纯化mRNA。mRNA的变性琼脂糖胶电泳检测结果如图3B显示，mRNA弥散，亮度好，分子量也较高。

1.1.3 cDNA文库构建及结果检测

按Stratagene公司的pBluescript® II XR cDNA Library Construction Kit 试剂盒的操作进行。步骤分为：第一链合成cDNA，第二链合成cDNA，钝化cDNA末端，连接EcoRI接头, 磷酸化EcoRI末端，Xhol消化，连接cDNA与T载体(可以连接外源DNA片段的质粒载体)，转化。 对插入片段进行PCR检测（见图3C）。文库平均插入片段大小1000bp 。

1.1.4 均一化法cDNA消除重复cDNA

在1.1.3 步骤获得的大量cDNA中，有的基因表达量大，会使后续测序中出现相同的重复，造成不必要的损失，需经过cDNA均一化处理后，消除大量的重复 cDNA, 按常规均一化cDNA文库的方法进行，参照储昭晖（2002）方法（储昭晖等，“水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定”，《科学通报》，2002年第47卷第21期P1656-1662）。均一化后文库获得1692个cDNA质粒的克隆（菌）。

1.2 用Xoo诱导处理疣粒野生稻差减法获得基因表达后的cDNA，按构建差减cDNA文库的常规方法构建差减cDNA文库

用C1、Y8菌株剪叶接种孕穗期的疣粒野生稻，接种后24h、48h、72h、96h、120h等量取材；SDS法提取总RNA；纯化mRNA。

差减法：以接种样品作为差减杂交的试验方（tester)，以接种蒸馏水样品作为驱动方（driver)，根据试剂盒PCR-Select cDNA subtraction Kit说明进行文库构建，抑制消减杂交PCR，用抑制性消减杂交的第2轮PCR产物纯化后克隆到pMD-18T质粒载体中，然后转化大肠杆菌DH5α，构建成差减cDNA文库。随机挑取30个菌落，进行PCR扩增，以检测插入片段的长度，平均插入片段长500bp（见图4）。

构建成差减cDNA文库获得744个cDNA质粒的克隆，cDNA平均长500bp。紫外分光测定并调整全部cDNA的浓度一致，用于制备本发明的基因芯片。

2、芯片微阵列点制

用碱裂解法提取前述步骤1.1均一化后的cDNA和 1.2差减cDNA文库的cDNA获得的2436个cDNA质粒为样品，用SSC调整溶液盐离子终浓度为3M。

内参：是疣粒野生稻的看家基因β-actin，提取疣粒野生稻叶片的RNA,逆转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin引物：上游引物5`→3`GCAGAAGGATGCCTATGTTG，下游引物5`→3`GGACCCTCCTATCCAGACAC扩增出一条880bp的条带，胶回收，加SSC，（SSC为柠檬酸钠缓冲液，浓度0.2M，pH7.5），调整溶液盐离子终浓度为3M，作为阳性对照，阴性对照用SSC。

上样：将上述样品和对照（阴阳性对照）按编号顺序上到384孔板中，将每个cDNA质粒贮存在384孔板的孔中，并从第1块384孔板的第1个孔开始依次编号；阴性对照和阳性对照在cDNA之后依次贮存在384孔板的孔中，并依次编号；每孔上样量为30ul，共7块板。384孔板为常规的基因文库保存板，每块板有384个孔而得名384孔板。

点样：点样仪为英国RioRobotics公司的MicroGrid II生物芯片点样仪，9×9矩阵，cDNA质粒不设重复，阴阳性对照各设8个重复。一张芯片上点完，有两个大的矩阵。片基用的是美国Erie Scientific公司的Superfrost Plus glass slides。

点样参数：点样室温度、湿度稳定在23℃和48%。开点样仪，进入软件程序选择参数。384孔板按顺序放入点样仪中，放上玻璃片，每层27片，仪器靠抽真空使玻璃片稳定准确固定在相应位置。针的选择：实心针，4×4排列，洗针方式，每取样前洗两次，真空抽干。样品选择：384孔板，共7块384孔板。取样设计：选沾一下模式。矩阵设计：9×9，点间距0.5mm，玻片上设两个大矩阵，选择大矩阵距玻璃片顶、底、左、右距离。两个大矩阵中间距，X轴0.2mm, Y轴2mm。

芯片保湿：将点样结束的芯片样品面向下，放到两根玻璃棒间，放于HW-8B型超级微量恒温器上，62℃，产生蒸汽，待玻片完全起雾保湿10s－30s 后拿出。

交联：

将保湿结束后的芯片放入紫外交联仪内，所用仪器为stratagene公司的UVstratalinker 2400，利用紫外线的能量促使玻片上多聚赖氨酸的氨基与DNA上的磷酸基团发生化学反应而交联，稳定附着于玻璃片上，交联能量为65000uJ，时间10min。

荧光扫描：交联后的基因芯片进行荧光扫描，检查扫描结果未出现漏点情况，点大多圆而饱满。储存扫描结果见图5。扫描仪为Axon Instruments公司的GenePix4000B，采用非共聚焦光路，配有两个半导体激光器，可实时调节激光功能，并采用双激光同时扫描，在扫描每一个像素时刻获得双通道数据。配有GenePix Pro生物芯片分析软件。

所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片用实施例1所述的应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备获得。

实施例 2 检测疣粒野生稻应答水稻白叶枯病菌的基因表达

用本发明基因芯片的制备方法制备获得的基因芯片检测疣粒野生稻应答水稻白叶枯病菌的基因表达操作步骤如下：

1. 疣粒野生稻为待检测样品，其接菌处理及RNA提取方法同实施例1。

2.荧光标记：

逆转录时进行荧光标记，0.5µg对照用Cy3标记，三个处理的总RNA等量混合用Cy5标记，40μl 体系：RNA CK 10μl (7μg), oligodT 3μl, 70℃, 5min，立即冰上放置，再加5×Buffer 8μl , 10×lowT 4μl, Cy3-dUTP 4μl, RNasin 1.5μl, MMLV 1μl, 加水补到40μl, 37℃, 2h，70℃，10min。

疣粒野生稻接种Xoo后1d, 2d, 3d的总RNA各 5μl(共15μg), oligodT 3μl, 70℃, 5min，立即冰上放置，再加5×Buffer 8μl, 10×lowT 4μl, cy5-dUTP 4μl, RNasin 1.5μl, MMLV 1μl, 加水补到40μl, 37℃, 2h，70℃, 10min。

预杂交：将芯片放到有浸湿滤纸的玻璃杂交盒上，芯片点样面朝上，在芯片点阵位置滴加42℃预热的杂交液，完全覆盖住点阵，盖上盖玻片，防止蒸发；将玻璃杂交盒放入42℃的温箱中保温2h；把玻璃杂交盒从温箱中取出，洗脱液漂洗5min，用四蒸水漂洗后甩干。

杂交：Cy3, Cy5标记的样品等量混合，再与杂交液等量混合。将芯片放到有浸湿滤纸的玻璃杂交盒上，芯片点样面朝上，在芯片点阵位置滴加42℃预热的混合液，完全覆盖住点阵，盖上盖玻片，用玻璃板盖住，防止蒸发；将玻璃杂交盒放入42℃的温箱中保温4h。

洗涤：杂交好的芯片在洗液Ⅰ，洗液Ⅱ(洗液Ⅰ：2×SSC,0.2%SDS ;洗液Ⅱ：0.2×SSC)中各洗5分钟。水浴温度30℃，震荡频率每分80转。洗脱液漂洗后，用四蒸水漂洗甩干后扫描。结果见图6，图6表明能检测出应答基因。

图像处理：所用软件为：GenePix Pro生物芯片分析软件。计算机生成32个小矩阵网格（gridding），调节确定网格在图像上的位置，对样点进行识别并读取数据，弃除无效数据（flags≥0,前景值-背景值+2SD≥0），对所有有效数据点的杂交信号作散点图（见图7），在斜率为1的线上的点是表达无变化的基因，越远离斜率为1的线的点代表该基因表达差异越明显。计算比值，计算内参Cy5/Cy3值，用内参Cy5/Cy3值对所有有效数据点进行归一化处理，各点归一化处理后的Cy5/Cy3值≥1.5的为明显上调表达，Cy5/Cy3值≤0.5的为明显下调表达。明显上调表达是指基因表达因水稻白叶枯病原菌处理后明显地提高, 明显下调表达表示基因表达因水稻白叶枯病原菌处理后明显地下降。具体如下述。

7、用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻应答水稻白叶枯病菌的基因功能分析

7.1 用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻应答Xoo表达基因的比较分析和功能预测

本发明基因芯片上2436个样品点中，弃除无效数据点后，明显上调表达的点有383个，明显下调表达的点有836个，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5之间的点有1063个。选取近800个点的克隆进行测序，测序结果在NCBI基因库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov,美国国家生物信息中心）上进行比对，同源序列基因列于下列：表1-1 疣粒野生稻接种Xoo上调表达基因，表1-2疣粒野生稻接种Xoo上调表达基因，表2-1 疣粒野生稻接种Xoo ，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5的表达基因，表2-2 疣粒野生稻接种Xoo ，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5的表达基因，表2-3 疣粒野生稻接种Xoo ，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5的表达基因，表 3-1 疣粒野生稻接种Xoo下调表达基因，表 3-2 疣粒野生稻接种Xoo下调表达基因，表 3-3 疣粒野生稻接种Xoo下调表达基因，表 3-4 疣粒野生稻接种Xoo下调表达基因。近800个点的克隆进行比对后有35个点无同源序列，其中明显上调表达的点有4个，明显下调表达的点有18个，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5之间的点有96个。水稻基因组测序已完成，比对无同源序列点的克隆可能是疣粒野生稻特异的，接种Xoo后在叶片中表达的基因，值得关注。比对的已知功能基因中，把光合作用相关基因列于一起，其余基因列于一起，已知功能基因中明显上调表达的基因有：富含脯氨酸蛋白、泛素连接酶、伸展蛋白、谷胱甘肽S转移酶Ⅱ、脂类转移酶等，明显下调表达的基因有：细胞色素P450单加氧酶、醛缩酶、金属硫蛋白、硫氧还蛋白、热击蛋白等，0.5﹤Cy5/Cy3比值﹤1.5之间的基因有：抗坏血酸过氧化物酶、转铜伴侣、脂酶、花丝温敏H2A蛋白等。并把未知功能的10个序列上传NCBI基因库注册，注册号为EF119781(本发明基因芯片号1905), EF119782(本发明基因芯片号1793), EF119783(本发明基因芯片号2416), EF119784(本发明基因芯片号1966), EF119785(本发明基因芯片号1800), EF119786(本发明基因芯片号2281), EF119787(本发明基因芯片号2380), EF119788(本发明基因芯片号1728), EF119789(本发明基因芯片号1798), EF119790(本发明基因芯片号1784)。本发明基因芯片号即是在384孔板上的编号。上述明显上调表达的基因，明显下调表达的基因与抗水稻白叶枯病的关系非常密切。

7.2 用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻应答基因的主要类型和其功能

7.2.1 用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻中NBS-LRR型应答基因

从抗病基因的结构分析，NBS-LRR型基因是抗病基因中种类最多的一类，在已克隆的近88种植物抗病基因中有60种属于NBS-LRR型，在已克隆的7个抗白叶枯病基因中，Xa1属于NBS-LRR型。从比对结果中发现本发明基因芯片编号2416的基因是具有CC-NBS-LRR保守结构域的同源基因片段, 比值为0.201795，下调表达基因，在半定量RT-PCR方法验证中也得到证实，半定量RT-PCR扩增到所述的基因芯片编号2416的基因的长为350bp的片段。将所述的基因芯片编号2416的基因与已报道的水稻和野生稻的NBS-LRR抗病同源基因进行比较发现它们氨基酸序列相似性很低。又将所述的基因芯片编号2416的基因与我们以前从疣粒野生稻中分离的5类NBS-LRR同源基因（NCBI基因库登录号：AY169501，AY169506，AY169507，AY169508，AY169509）用DNASIS软件进行氨基酸序列相似性比较。聚类分析发现所述的基因芯片编号2416的基因单独聚成一类，并且氨基酸同源性也很低仅为21%，表明这个基因与其它基因的差异很大。

7.2.2 用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻的热激蛋白基因

本发明基因芯片编号为：2150、1926、2430、2288的4个基因的序列属于热激蛋白（heat-shock protein， HSP82，HSP70，HSP90）, Cy5/Cy3比值分别为：0.857391、0.926755、0.489434、0.838338。在NCBI基因库同源基因登录号： Z11920.1、AF035414、AB111810.1。热激蛋白（HSPs）根据分子量大小分为5个主要家族：HSP100家族、HSP90家族、HSP80、HSP70家族、HSP60家族和小分子量HSP家族。热激蛋白能维持天然蛋白结构的稳定，维护生物膜结构稳定，能作为抗氧化剂清除过剩的ROS活性氧，现已发现有些HSPs具有重要的调节作用，如HSP90可作用于蛋白激酶和甾醇激素受体，形成复合物。当HSP90解离时，伴随着脱氧核糖核酸结合受体的活化，所以HSP90具有保持受体呈无活性状态的功用，直到收到适当的信号再活化。热激蛋白众多生理功能的基本作用是作为分子伴侣(molecular chaperones)。分子伴侣是在细胞内多肽折叠、组装和解组装过程中，识别和稳定部分折叠的中间体的多种细胞内蛋白。HSP90有分子伴侣功能，多种R蛋白要完成其功能需要HSP90，RAR1和SGT1都能在酵母双杂交中与HSP90相互作用，RAR1、SGT1和HSP90形成一个分子伴侣复合物介导R蛋白及其结合的功能复合物的折叠（Shirasu K. “Complex formation, promiscuity and multi-functionality: protein interactions in disease-resistance pathways”. <Trends Plant Sci>,2003, 8: 252-258）。SGT1与LRR蛋白互作中有多种功能，酵母中SGT1与腺苷酸环化酶相互作用，腺苷酸环化酶是无F-box的LRR蛋白，突变体分析表明，是SGT特有的SGS结构域与腺苷酸环化酶的LRR结构域相互作用（DubacqC, “Sgt1p contributes to cyclic AMP pathway activity and physically interacts with the adenylyl cyclase Cyr1p/Cdc35p in budding yeast”，<Eukaryot Cell>，2002, 1:568-582）。SGT1通过与F-box-LRR蛋白的LRR结构域互作成为SCF-E3s的分子伴侣。SGT1能活化SCF-E3是通过F-box-LRR蛋白正确折叠进SCF复合物中而完成，其中是SGT1和HSP90而不是RAR1在起作用。在拟南芥中有F-box的基因有694个，其中42个有LRR结构域，共有160个不同的LRR结构域(Gagne JM， “The F-box subunit of the SCF E3 complex is encoded by a diverse superfamily of genes in Arabidopsis”,,<Proc Natl Acad Sci USA> 2002, 99:11519-11524）。COI1 (coronatine insensitive 1)与茉莉酸信号有关，TIR1是生长素受体，它们都是F-box-LRR蛋白，都需要SGT1和HSP90（Shirasu K, “Complex formation, promiscuity and multi-functionality: protein interactions in disease-resistance pathways”，<Trends Plant Sci>，2003, 8:252-258）。用本发明基因芯片检测出疣粒野生稻的热激蛋白基因表明该类蛋白质参与了抗病应答反应。

用本发明的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备的基因芯片在疣粒野生稻中检测出了一批在水稻白叶枯病原菌处理后上调或下调表达的基因，并且功能预测发现一批与抗病密切相关的基因。说明本芯片具有很好的利用价值，在今后揭示水稻抗免疫白叶枯病的基因分子基础和机制，抗病基因的筛选发掘等方面有很大的利用价值。

序列表

<110> 云南大学

云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用

<130> -

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据β-actin基因设计的上游引物

<400> 1

gcagaaggat gcctatgttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据β-actin基因设计的下游引物

<400> 2

ggaccctcct atccagacac 20

Claims (8)

1.一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建cDNA文库

以接种蒸馏水的水稻叶片和接种Xoo后24h、48h、72h的水稻叶片作为总RNA的提取材料，构建cDNA文库；

（2）均一化步骤（1）构建的cDNA文库；

（3）构建差减cDNA文库

以接种Xoo后24h、48h、72h、96h和120h的水稻叶片等量取材作为接种样品，以接种样品作为差减杂交的试验方, 接种蒸馏水的水稻叶片等量取材作为驱动方，构建差减cDNA文库；

（4）将步骤（2）均一化的cDNA文库的cDNA质粒和步骤（3）差减cDNA文库的cDNA质粒， 贮存在384孔板的孔中，并从第1块384孔板的第1个孔开始依次编号；用SSC作为阴性对照，用β-actin 的cDNA为阳性对照，β-actin 在GenBank库登录号是XM-469569.1，阴性对照和阳性对照在cDNA质粒之后依次贮存在384孔板的孔中，并依次编号；

（5）重复步骤（4）提取cDNA质粒，按步骤（4）的编号顺序依次将所提取的cDNA质粒、所述的阴性对照和阳性对照用生物芯片点样仪点在一张载体上，cDNA质粒不设重复，所述的阴性对照和阳性对照各设8个重复。

2.根据权利要求1所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，步骤（5）所述的载体为玻片。

3.根据权利要求1所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，步骤（1）和步骤（3）所述的水稻叶片为水稻孕穗期的叶片。

4.根据权利要求1所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，步骤（1）和步骤（3）所述的水稻叶片为疣粒野生稻叶片。

5.根据权利要求4所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，所述的疣粒野生稻叶片为疣粒野生稻孕穗期的叶片。

6.一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，其特征在于：所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片是用权利要求1至5中任一权利要求所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备获得。

7.权利要求6所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片在检测应答水稻白叶枯病菌基因及其相关基因表达的应用。

8.根据权利要求7所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片在检测应答水稻白叶枯病菌基因及其相关基因表达的应用，其特征在于：所述的应用是将待检测水稻接种Xoo ，分别取接种Xoo后24h、48h和72h的水稻叶片为三个处理，将三个处理按常规方法提取总RNA，将三个处理的总RNA等量混合后,在逆转录时用Cy5标记，以接种蒸馏水的待检测水稻的叶片为对照材料，将对照材料按常规方法提取总RNA，取对照材料的总RNA在逆转录时用Cy3标记，将标记Cy5的cDNA和标记Cy3的cDNA按常规DNA杂交方法与权利要求6所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片预杂交、杂交、进行图像处理和分析，将有杂交信号点所对应的克隆进行测序，将测序结果与GenBank或Protein DataBank进行BLAST比较，进行基因分析。

Images