CN103361400B - 水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，能够有效地分离几乎每个TAL效应物家族基因的重复区，并对其进行精确测序、组装，为TAL效应物的功能性研究及应用提供了必不可少的支持。
Description
技术领域
本发明涉及水稻白叶枯病菌转录激活因子样(TAL，TranscriptionActivator-Like)效应物基因的测序方法。
背景技术
水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，简称Xoo)既是水稻的重要病原菌，也是研究细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。该菌的TAL效应物，也称AvrBs3/PthA家族蛋白，是主要的致病和致敏因子。该类蛋白的最大特点是能够特异地识别DNA序列，从而激活或抑制相关基因的表达。
AvrBs3/PthA家族蛋白是一类进化程度较高的生物大分子，家族成员间氨基酸序列同源性达80％～97％，它们在结构上也有许多共同特点，如图1所示，中间区域(即重复区Repeatregion)是几乎一样的34个或35个氨基酸(aa，aminoacid)重复单元的重复，不同效应蛋白间的差异主要是重复单元的重复数目和每个重复单元的第12和第13位氨基酸，决定了其毒性和专化性；其C端(右侧)和N端(左侧)高度保守，C端含有1个亮氨酸拉链结构(LZ，LeucineZipper)、3个核定位信号(NLSs，NuclearLocalizationSignals)和1个真核生物酸性转录激活区域(AAD，AcidTranscriptionalActivationDomain)；N端含有一个三型分泌系统分泌信号(TTS)。
实验证明，TAL效应物能够通过三型分泌系统(TypeIIIsecretionsystem，简称T3SS)进入植物的细胞，通过核酸定位信号(NLS，NucleicacidpositioningSignal)进入寄主细胞核，利用自身第12位和第13位的氨基酸(RVD，repeatvariablediresidue)靶标植物细胞中特定基因启动子的UPA(upregulatedbyAvrBs3)区，诱导其表达，以控制植物的生理生化进程。病原菌通过进化产生一系列的TAL效应物，以利于该病原菌在寄主上的定殖和传播；而植物亦进化出一系列的抗病策略以抑制该病原菌引起的病害。因此针对不同的寄主植物的基因型，TAL效应物既有可能是毒性因子，也有可能是无毒因子。
近年来关于黄单胞菌的蛋白类效应物TAL效应物的研究有许多新进展，尤其是TAL效应物与寄主DNA特异性识别的分子密码的破解，将在生物工程领域、遗传病靶向治疗和植物抗病育种应用上产生重要作用。
TAL效应物家族基因是目前已知进化多样性最高的基因类群之一，以典型的TAL效应物基因avrBs3为例，该基因全长3495bp，其5’端最前端编码一个三型分泌信号功能域，该基因的3’端，从第3061到第3495个碱基为含有编码三个真核生物细胞核定位信号和一个真核生物转录激活功能域的区域；avrBs3的中部(第865至第2658个碱基)为一个由17.5个同源性极高的重复单元组成的重复区，每个重复单元含有102个碱基。事实上，TAL效应物家族基因间的同源性很高，几乎每个基因在5’端和3’端各有一个很保守的BamHI酶切位点，详细可参见后附序列表(包括talCDNA序列和talC蛋白质序列)。不同TAL效应物家族基因间的区别主要在于重复区重复单元个数以及每个重复单元编码第12、13位氨基酸的碱基的差异，而正是这样的差异，直接影响到TAL效应物功能的特异性。在已知的TAL效应物家族基因中，重复区含重复单元数目从1.5到33.5个不等，而大多数基因含有17.5±2个重复，如此多的高度相似的重复给实验室常用的基于PCR反应的亚克隆带来极大的困扰；而且由于大多数TAL效应物家族基因的重复区长度大于1kb，使得直接利用Sanger测序方法对全基因进行测序变得异常困难。
TAL效应物与寄主靶标序列互作机理的解码，不仅推进了水稻白叶枯病菌的致病机理、小种进化机制和抗病育种研究，而且为人类靶向治疗遗传疾病提供了新的选择。TAL效应物基因家族成员具有几乎一样的5′端和3′端，不同的只是中间102bp重复单元的重复数不同，而且在一个细菌的基因组中存在多个共生同源基因(paralogousgene)。该类基因的结构特点，以及多拷贝问题给TAL效应物基因家族的测序和基因克隆带来不便，从而不能为TAL效应物的功能性研究及应用提供了必不可少的支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，能够精确地对TAL效应物进行测序。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，包括：
(1)将水稻白叶枯病菌BAI3R的基因组DNA和含有avrBs3/pthA家族基因的BAI3Rcosmid文库质粒分别用限制性内切酶BamHI完全消化，所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离；以avrBs3/pthA家族基因avrXa7中的第122至842碱基片段为探针，对分离得到的DNA片段进行Southern杂交，确定cosmid文库质粒中携带的avrBs3/pthA家族基因与基因组中avrBs3/pthA家族基因的对应情况，同时估计该avrBs3/pthA家族基因含有重复单元数目n；
(2)将cosmid文库质粒中与Southern杂交中条带对应的BamHI条带切下，并回收DNA片段；将该BamHI条带中DNA片段克隆到用BamHI消化过的载体pWEB-TNC中，得到pWEB-tal质粒；
(3)将pWEB-tal与EZ-Tn5TMTransposase混合，其中pWEB-talC2μg，EZ-Tn5TMTransposase1U，10X反应缓冲液1μl，37℃下反应两个小时；反应结束时加入1μl反应中止液，70℃下温浴10分钟以中止反应；
(4)取1/10上述反应液，用化学转化方法转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并筛选其中缺乏氯霉素抗性且有氨苄青霉素抗性的克隆；
(5)提取上述克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全消化，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱；有单一或两个外源片段的克隆均可用于测序分析；
(6)选取超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，对每个克隆测一个反应；
(7)将含有两个外援片段的克隆的测序结果进行反向互补转化，然后与含有单一外源片段克隆的测序结果综合，依据序列间的相似性将测序结果排序、组装，最终得到BamHI片段的完整序列；
(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终的到avrBs3/pthA家族基因的全长序列。
优选地，步骤(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，具体是指：
选取酶切图谱中25个含有一个或两个外源片段的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上的引物5′TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCT3′进行测序。
优选地，步骤(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，具体是指：
以BamHI片段序列为模板，分别设计引物5′TGCAGATCGTGGGGTGTCTG3′和5′GGCTGTCGAGGTGCGCGTTC3′用以对talC的5′端、3′端进行测序。
优选地，步骤(1)所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离，即在30V电压下电泳分离20小时。
本发明能够有效地分离几乎每个TAL效应物家族基因的重复区，并对其进行精确测序、组装，为TAL效应物的功能性研究及应用提供了必不可少的支持。
附图说明
图1为典型TAL效应物的主要功能域示意图；
图2为水稻白叶枯病菌菌株BAI3R基因组DNA及一个携带avrBs3/pthA家族基因的BAI3Rcosmid文库质粒的Southern杂交示意图；
图3为pWEB-tal质粒结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
本发明提供的水稻白叶枯病菌TAL效应物基因的测序方法实施例，包括如下步骤：
步骤1：将水稻白叶枯病菌BAI3R的基因组DNA和含有avrBs3/pthA家族基因的BAI3R粘性质粒(cosmid，简称质粒)文库质粒分别用限制性内切酶BamHI完全消化，所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离(30V下20小时)；以avrBs3/pthA家族基因avrXa7中的第122至842碱基片段为探针(32P标记)，对分离得到的DNA片段进行Southern杂交(分子生物学的经典试验方法)，确定cosmid文库质粒中携带的avrBs3/pthA家族基因与基因组中avrBs3/pthA家族基因的对应情况，同时估计该avrBs3/pthA家族基因含有重复单元数目n；
图2中显示BAI3Rcosmid文库质粒中携带有BAI3R基因组中的talC基因。
步骤2：将cosmid文库质粒中与Southern杂交中条带对应的BamHI条带切下，并回收DNA片段；将该BamHI条带中DNA片段克隆到用BamHI消化过的载体pWEB-TNC(Epicentre)中，得到pWEB-tal质粒，如图3所示；
由图3可看出，avrBs3/pthA家族基因的BamHI片段被克隆到pWEB-TNC上位于AmpR和cos位点间的多克隆位点上。
步骤3：将pWEB-tal与EZ-Tn5TMTransposase(Epicentre)混合，其中pWEB-talC2μg，EZ-Tn5TMTransposase1U，10X反应缓冲液1μl，37℃下反应两个小时；反应结束时加入1μl反应中止液，70℃下温浴10分钟以中止反应；
步骤4：取1/10上述反应液，用化学转化方法转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并筛选其中缺乏氯霉素抗性且有氨苄青霉素抗性的克隆；
步骤5：提取上述克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全消化，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱；有单一或两个外源片段的克隆均可用于测序分析；
步骤6：选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，对每个克隆测一个反应；
譬如选取上述酶切图谱中25个含有一个或两个外源片段的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上的引物5′TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCT3′进行测序，对每个克隆测一个反应。
步骤7：将含有两个外援片段的克隆的测序结果进行反向互补转化，然后与含有单一外源片段克隆的测序结果综合，依据序列间的相似性将测序结果排序、组装，最终得到BamHI片段的完整序列；
步骤8：以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终的到avrBs3/pthA家族基因的全长序列。
即以BamHI片段序列为模板，分别设计引物5′TGCAGATCGTGGGGTGTCTG3′和5′GGCTGTCGAGGTGCGCGTTC3′用以对talC的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终的到talC的全长序列。
序列表
talCDNA序列
ttcgtccgcgcgcgccaagtcctgcccgcgaggttctgcccggcccccaa
61ccggatagggttcagccgactgcagatcgtggggtgtctgcgcctgctggcagccctctg
121gatggcttgcccgctcggcggacgatgtcccggacccggctgccatctccccctgccccc
181ttgcctgcgttctcggcgggcagcttcagcgatctgctccgtcagttcgatccgtcgctt
241cttgatacatcgctttttgattcgatgcctgccgtcggcacgcctcatacagaggctgcc
301ccagcagagggggatgaggtgcaatcggctctgcgtgcagccgatgacccgccacccacc
361gtgcgtgtcgctgtcactgccgcgcaggtggatctacgcacgctcggctacagtcagcag
421caagagaagatcaaaccgaatgttcgttcgacagtggcgcagcaccacgaggcactggtg
481ggccatgggtttacacacgcgcacatcgttgcgctcagccgacacccggcagcgttaggg
541accgtcgctgtcaagtatcaggacatgatcgcggcgttaccagaggcgacacacgaagac
601atcgttggggtcggcaaacagtgttccggcgcacgcgccctggaggccttgctcacggtg
661gcgggagagttgagaggtccaccgttacagttggacacaggccaacttgtcaagattgca
721aaacgtggcggcgtgaccgcagtggaggcagtgcatgcatcgcgcaatgcactgacgggt
781gcccccctgaacctgaccccggcacaggtggtggccatcgccagcaatagcggcggcaag
841caggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgacc
901ccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggcggcaagcaggcgctggagacggtg
961cagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggcgcaggtggtggcc
1021atcgccagcaatagcggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtg
1081ctgtgccaggcccatggcctgaccccggaccaggtggtggccatcgccagccacgatggc
1141ggcaagcaggcgctggagacggtgcagcgactgttgccggtgctgtgccaggcccatggc
1201ctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatattggcggcaagcaggcgctggag
1261acggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtg
1321gtggccatcgccagcaatggcggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggttgttg
1381ccgatgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaat
1441aacggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcc
1501catggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggcggcaagcaggcg
1561ctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggac
1621caagtggtggccatcgccagccacgatggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcgg
1681ctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggcgcaggtggtggccatcgcc
1741agcaatattggcggcaagcaggcgctggagacggtgcggcggctgttgccggtgctgtgc
1801caggcccatggcctgaccccggcgcaggtggtggccatcgccaacaataacggcggcaag
1861caggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgacc
1921ccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggcaagcaggcgctggagacggtgcag
1981cggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatc
2041gccagcaatattggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctg
2101tgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaataacggcggc
2161aagcaggccctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctg
2221accccggaccaggtggtggccatcgccagccacgatggcggcaagcaggcgctggagacg
2281gtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccctggagcaggtggtg
2341gccatcgccagcaatggcggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccg
2401gtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggcgcaggtggtggccatcgcctgcaatatt
2461ggcggcaagcaggcgctggagacggtgcggcggctgttgccggtgctgtgccaggcccat
2521ggcctgaccccggcgcaggtggtggccatcgccaacaataacggcggcaagcaggcgctg
2581gagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggcgcag
2641gtggtggccatcgccagcaatggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttg
2701ccggtgctgtgccaggcccatggtctgaccccggcgcaggtggtggccatcgccagccac
2761gatggcggcaagcaggcgttggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcc
2821catggcctgaccccggaccaggtggtggccatcgccagcaataacggcggcaagcaggcg
2881ctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggag
2941caggtggtggccatcgccagcaatggcggcggcaagcaggcgctggagagcattgttgcc
3001cagttatctcgccctgatccggcgttggccgcgttgaccaacgaccacctcgtcgccttg
3061gcctgcctcggcggacgtcctgccctggatgcagtgaaaaagggattgccgcacgcgccg
3121gaattgatcagaagagtcaatagccgtattgccgaacgcacgtccgatcgcgttaccgac
3181tacgcgcaagtggttcgcgtgctggagtttttccagtgccactcccacccagcgcacgca
3241tttgatgaggccatgacgcagttcggtatgagcaggaacggattgttacagctctttcgc
3301agagtgggcgtcaccgaactcgaagcctgcggtggaacgctccccccagcctcgcagcgt
3361tggcaccgtatcctccaagcatcagggatgaaaagtgccaaaccgtcctgtgcttcggct
3421caaacgccggatcaggcgtctttgcatgcattcgccgattcgccggagcgtgaccttgat
3481gcgcccagcccaatgcacgagggagatcagacgcgggcaagcagccgtaaacggtcccga
3541tcggatcgtgctgtcaccggcccctccgcacagcaggctgtcgaggtgcgcgttcccgaa
3601cagcgcgatgcgctgcatttgcccctcagctggagtgtaaaacgcccgcgtaccaggatc
3661gggggcggcctccctggtacgcccatggctgccgacctggcagcgtccagcacc
3721ctgatgtgggaacaagatgtggaccacttcgcaggggcagcggatgatttcccggcattc
3781aacgaagaggaactcgcatggttgagggagctattgcctcagtga
注：黑色且带下划线字体标注为BamHI酶切位点
talC蛋白质序列
1MetAspProIleArgProArgAlaProSerProAlaArgGluValLeu
17ProGlyProGlnProAspArgValGlnProThrAlaAspArgGlyVal
33SerAlaProAlaGlySerProLeuAspGlyLeuProAlaArgArgThr
49MetSerArgThrArgLeuProSerProProAlaProLeuProAlaPhe
65SerAlaGlySerPheSerAspLeuLeuArgGlnPheAspProSerLeu
81LeuAspThrSerLeuPheAspSerMetProAlaValGlyThrProHis
97ThrGluAlaAlaProAlaGluGlyAspGluValGlnSerAlaLeuArg
113AlaAlaAspAspProProProThrValArgValAlaValThrAlaAla
129GlnValAspLeuArgThrLeuGlyTyrSerGlnGlnGlnGluLysIle
145LysProAsnValArgSerThrValAlaGlnHisHisGluAlaLeuVal
161GlyHisGlyPheThrHisAlaHisIleValAlaLeuSerArgHisPro
177AlaAlaLeuGlyThrValAlaValLysTyrGlnAspMetIleAlaAla
193LeuProGluAlaThrHisGluAspIleValGlyValGlyLysGlnCys
209SerGlyAlaArgAlaLeuGluAlaLeuLeuThrValAlaGlyGluLeu
225ArgGlyProProLeuGlnLeuAspThrGlyGlnLeuValLysIleAla
241LysArgGlyGlyValThrAlaValGluAlaValHisAlaSerArgAsn
257AlaLeuThrGlyAlaProLeuAsnLeuThrProAlaGlnValValAla
273IleAlaSerAsnSerGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArg
289LeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProGluGlnVal
305ValAlaIleAlaSerAsnGlyGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrVal
32lGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAla
337GlnValValAlaIleAlaSerAsnSerGlyGlyLysGlnAlaLeuGlu
353ThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThr
369ProAspGlnValValAlaIleAlaSerHisAspGlyGlyLysGlnAla
385LeuGluThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGly
401LeuThrProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsnIleGlyGlyLys
417GlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAla
433HisGlyLeuThrProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsnGlyGly
449GlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProMetLeuCys
465GlnAlaHisGlyLeuThrProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsn
481AsnGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProVal
497LeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProGluGlnValValAlaIleAla
513SerAsnGlyGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeu
529ProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAspGlnValValAla
545IleAlaSerHisAspGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArg
561LeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAlaGlnVal
577ValAlaIleAlaSerAsnIleGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrVal
593ArgArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAla
609GlnValValAlaIleAlaAsnAsnAsnGlyGlyLysGlnAlaLeuGlu
625ThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThr
641ProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsnGlyGlyLysGlnAlaLeu
657GluThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeu
673ThrProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsnIleGlyGlyLysGln
689AlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHis
705GlyLeuThrProGluGlnValValAlaIleAlaSerAsnAsnGlyGly
721LysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProValLeuCysGln
737AlaHisGlyLeuThrProAspGlnValValAlaIleAlaSerHisAsp
753GlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuProValLeu
769CYsGlnAlaHisGlyLeuThrLeuGluGlnValValAlaIleAlaSer
785AsnGlyGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGlnArgLeuLeuPro
801ValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAlaGlnValValAlaIle
817AlaCysAsnIleGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValArgArgLeu
833LeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAlaGlnValVal
849AlaIleAlaAsnAsnAsnGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrValGln
865ArgLeuLeuProValLeuCysGlnAlaHisGlyLeuThrProAlaGln
881ValValAlaIleAlaSerAsnGlyGlyLysGlnAlaLeuGluThrVal
Claims (3)
1.一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，包括：
(1)将水稻白叶枯病菌BAI3R的基因组DNA和含有avrBs3/pthA家族基因的BAI3Rcosmid文库质粒分别用限制性内切酶BamHI完全消化，所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离；以avrBs3/pthA家族基因avrXa7中的第122至842碱基片段为探针，对分离得到的DNA片段进行Southern杂交，确定cosmid文库质粒中携带的avrBs3/pthA家族基因与基因组中avrBs3/pthA家族基因的对应情况，同时估计该avrBs3/pthA家族基因含有重复单元数目n；
(2)将cosmid文库质粒中与Southern杂交中条带对应的BamHI条带切下，并回收DNA片段；将该BamHI条带中DNA片段克隆到用BamHI消化过的载体pWEB-TNC中，得到pWEB-tal质粒；
(3)将pWEB-tal与EZ-Tn5TMTransposase混合，其中pWEB-talC2μg，EZ-Tn5TMTransposase1U，10X反应缓冲液1μl，37℃下反应两个小时；反应结束时加入1μl反应中止液，70℃下温浴10分钟以中止反应；
(4)取1/10上述反应液，用化学转化方法转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并筛选其中缺乏氯霉素抗性且有氨苄青霉素抗性的克隆；
(5)提取上述克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全消化，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱；有单一或两个外源片段的克隆均可用于测序分析；
(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB-TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，即用位于pWEB-TNC上的引物5′TGTGAAATTTGTGATGCTATTGCT3′进行测序；对每个克隆测一个反应；
(7)将含有两个外援片段的克隆的测序结果进行反向互补转化，然后与含有单一外源片段克隆的测序结果综合，依据序列间的相似性将测序结果排序、组装，最终得到BamHI片段的完整序列；
(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物5′TGCAGATCGTGGGGTGTCTG3′，在其3′端设计正向引物5′GGCTGTCGAGGTGCGCGTTC3′，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终得到avrBs3/pthA家族基因的全长序列。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，具体是指：
选取酶切图谱中25个含有一个或两个外源片段的克隆，提取质粒。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离，即在30V电压下电泳分离20小时。
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| Title |
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| TAL effectors: finding plant genes for disease and defense;Adam J Bogdanove et al.;《Current Opinion in Plant Biology》;20101231;第13卷;394-401 * |
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