CN101921843B - 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 - Google Patents
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，本方法通过两对引物同时对检测样本的DNA模板进行PCR反应扩增得到PCR产物，然后PCR产物与基因芯片上设置的特异性探针杂交，根据杂交结果阳性与否，来判断出检测样本是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌或甘蓝黑腐病菌；本发明能一次性对4种细菌完成检测，检测速度快，并且检测结果直观明了，容易判断。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的快速检测技术。
背景技术
黄单胞菌属Xanthomonas种类繁多，致病性多样，第2版的《伯杰氏系统细菌学手册》收录了20个种，70个分类地位已经确定的致病变种和70个分类地位尚不确定的致病变种。现行的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中收录了14个检疫性黄单胞菌。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola，Xooc)是水稻上重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌可造成水稻减产10％～30％，严重时可达50％以上。水稻细菌性条斑病菌可造成水稻减产5％～10％，严重时可达20％。柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri，Xac)能够侵染为害绝大多数柑桔栽培品种，是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病菌。以上三者都是我国重要的检疫性细菌。甘蓝黑腐病菌(X.campestris pv.campestris，Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，在世界范围内，尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物如甘蓝、花椰菜和大白菜等发生黑腐病，对蔬菜生产造成严重的经济损失。
若要有效防止上述4种黄单胞菌进境，就必须要有快速准确的诊断方法。鉴定黄单胞菌的方法主要有生理生化方法、基于PCR技术的分子生物学方法等。生理生化方法，操作步骤繁琐，一股鉴定一种菌需要15天左右的时间，太耗时，而且相关人员需要丰富的经验。基于PCR技术的分子生物学，对黄单胞菌检测主要有普通PCR、双重PCR、实时荧光PCR和滚环扩增等方法；这些方法存在易污染、灵敏度低，而且每次只能检测一种致病菌等不足。
发明内容
本发明的目的是克服以上技术缺陷，提供一种快速检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌的方法。
水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
c、杂交：将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
d、采集杂交结果；
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其具有如下序列，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG；
步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck具有如下序列，
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
步骤e还包括将探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2杂交结果与阳性定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
进一步地，所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其具有如下序列，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC。
进一步地，步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
进一步地，步骤a之前还包括菌种的培养的步骤；具体地，菌种的培养是指30℃下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。
本发明的再一目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增，
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
本发明的第三目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第四目的是提供一种用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第五目的是提供一种用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明的第六目的是提供一种用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
本发明提供的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，通过采用引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物同时对检测样本潜在的4种病菌的DNA模板进行PCR反应，因此速度快。通过基因芯片上设置的特异性探针与PCR产物杂交，能快捷准确得出反应结果阳性与否，这种杂交方法不易污染、灵敏度高；采用基因芯片杂交结果判断检测结果，技术人员无需丰富的形态学知识和经验，检测结果直观明确。
附图说明
图1是基因芯片杂交结果一；
图2是基因芯片杂交结果二；
图3是基因芯片杂交结果三；
图4是基因芯片杂交结果四；
图5是基因芯片杂交结果五；
图6是基因芯片杂交结果六。
具体实施方式
实施例1
检测样本A是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：在30℃下、将检测样本A在营养琼脂培养基上培养2-3天；提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
细菌基因组DNA的提取是公知技术，本实施例中具体操作如下：1)1.5mL菌液，室温13000r/min离心5min，去上清；2)取沉淀加浓度为50g/L的溶菌酶100μL，悬浮菌液，37℃，放置2h；3)加入TE 385μL，20％SDS 15μL，煮沸10min；4)用等体积的酚氯仿抽提，充分振荡混匀，4℃13000r/min离心5min，将上清移至灭菌离心管；5)加1mL冰无水乙醇，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；6)4℃13000r/min离心10min，弃上清，冰无水乙醇洗涤1次，75％乙醇洗涤2次，溶解于100μL ddH2O，-20℃保存备用。
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；
引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰；
PCR反应体系为：0.25mmol/L 10×Buffer(Mg2+free)(大连宝生物)、2.0mmol/L MgCl2(大连宝生物)、0.2mmol/L CY5-dNTPs(Amersham Biosciences公司)、正向引物(XrpoD-F，PSRG-F)和反向引物(XrpoD-R，PSRG-R)各0.2μmol/L、1U Taq酶(大连宝生物)、模板DNA 10～20ng，总体积25μL。标记PCR扩增在T3PCR仪(德国Biometra公司)上进行，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃10min。
c、杂交：将PCR产物、互补链探针AntiPos-ck与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，基因芯片上的探针包括特异性探针Xoo-S1、特异性探针Xooc-S1、特异性探针Xac-A1、特异性探针Xcc-S2、阳性定位点探针Pos-ck和阴性质控探针Neg-CK，各探针分别具有如下序列：
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC，
互补链探针AntiPos-ck是阳性定位点探针Pos-ck的互补链探针，该探针可与阳性定位点探针Pos-ck杂交并使得阳性定位点探针Pos-ck显示阳性；探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
基因芯片上还设置有空白对照，基因芯片上各特异性探针、阳性定位点探针、阴性质控探针和空白对照具有表1所示的布局：
表1
芯片基片选择晶芯光学级醛基基片(北京博奥生物有限公司)；探针用TE缓冲液(pH 8.0)稀释至终浓度40μmol/L，将50％DMSO加入384孔板中，再加入等量的探针溶液，轻轻混匀，并按表1设计的探针顺序，用芯片点样仪(德国GeSim公司)将探针点至基片上；点样后基片经37℃水合12h，用0.2％SDS溶液漂洗5min；去离子水分别漂洗3次，每次2min；再将基片放入0.2％NaBH4封闭液中漂洗15min，前5min搅拌，中间5min静置，后5min搅拌；去离子水漂洗3次，每次2min；2000r/min室温离心2min，4℃避光保存；用激光共聚焦扫描仪GenePix 4200A(美国Axon公司)对基片进行预扫描质检；
杂交过程如下：分别取杂交液7μL(2％SDS和5％SSPE等体积混合)、PCR产物6μL和互补链探针AntiPos-ck 1μL，混匀后95℃变性5min，立即于冰水中放置5min。将变性后的混合物加入基因芯片点样区，盖上盖玻片置于湿盒中50℃避光杂交3h。杂交后的基因芯片依次在洗液I(0.3×SSC，0.2％SDS)和洗液II(0.06×SSC)中各清洗2min，室温2000r/min离心2min。
d、采集杂交结果；用激光共聚焦扫描仪扫描基因芯片，用GenePix 5.0软件分析扫描得到的图像，杂交结果如图1所示。
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，同时参照基因芯片上的阳性定位点探针Pos-ck杂交结果、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，判断探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2的杂交结果阳性与否，来判断检测样本A中是否含有探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2对应的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
在本实施例中探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阳性，因此检测样本A含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌。
实施例2
检测样本B是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图2所示，即探针Xoo-S1为阳性，因此检测样本B含有水稻白叶枯病菌，不含水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例3
检测样本C是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图3所示，即探针Xooc-S1为阳性，因此检测样本C含有水稻细菌性条斑病菌，不含水稻白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例4
检测样本D是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图4所示，即探针Xac-A1为阳性，因此检测样本D含有柑桔溃疡病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌。
实施例5
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图5所示，即探针Xcc-S2为阳性，因此检测样本E含有甘蓝黑腐病菌，不含水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和柑桔溃疡病菌。
实施例6
检测样本F是否含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，与实施例1具有检测方法完全相同，杂交结果如图6所示，即探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2均为阴性，因此检测样本F不含有水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种病菌。
实施例7
用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物和特异探针，PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，分别具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；引物PSRG-F/PSRG-R根据水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌的DNA进行PCR扩增；并且引物XrpoD-F/XrpoD-R与引物PSRG-F/PSRG-R不相互干扰。
特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，分别具有如下序列：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的，探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
实施例8
用于检测水稻白叶枯病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xoo-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌DNA进行PCR扩增，探针Xoo-S1是根据水稻白叶枯病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例9
用于检测水稻细菌性条斑病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xooc-S1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG。
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据水稻白叶枯病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻细菌性条斑病菌DNA进行PCR扩增，探针Xooc-S1是根据水稻细菌性条斑病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例10
用于检测柑桔溃疡病菌的引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探针Xac-A1具有如下序列，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
引物XrpoD-F/XrpoD-R根据柑桔溃疡病菌的RNA多聚酶西格玛因子DNA序列设计，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对柑桔溃疡病菌DNA进行PCR扩增，探针Xac-A1是根据柑桔溃疡病菌DNA在引物XrpoD-F/XrpoD-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例11
用于检测甘蓝黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探针Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探针探针Xcc-S2具有如下序列，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC。
引物PSRG-F/PSRG-R根据甘蓝黑腐病菌的铁载体受体DNA序列设计，引物PSRG-F/PSRG-R能对甘蓝黑腐病菌DNA进行PCR扩增，探针Xcc-S2是根据甘蓝黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下扩增得到的PCR产物设计的。
实施例12～28采用已知样本病菌作为检测样本，并采用实施例1完全相同的检测方法进行检测，以验证引物、探针的有效性和特异性；各实施例具体数据如表2所示。
表2
由表1可知，引物XrpoD-F/XrpoD-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌四种黄单胞菌有效扩增，引物PSRG-F/PSRG-R能对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和甘蓝黑腐病菌三种黄单胞菌有效扩增，探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2具有特异性。
实施例1～6、12～28均设置了用于质控杂交、方便判断杂交结果阳性与否的阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照；阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照，不是本发明中所必需的，熟练的检测人员可以在不设置阳性定位点探针Pos-ck、阴性质控探针Neg-CK和空白对照的情况下做好杂交质控、判断杂交结果阳性与否。
Claims (8)
1.水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，包括如下步骤：
a、提取DNA：提取检测样本的基因组DNA，制得DNA溶液；
b、DNA模板PCR反应：以DNA溶液作为模板，用引物进行PCR反应，扩增得到PCR产物；其中，
引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，序列分别如下，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT；
c、杂交：将PCR产物与基因芯片上的特异性探针杂交；其中，特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，序列分别如下：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌；
d、采集杂交结果；
e、分析判断：根据采集到的杂交结果，分析杂交结果是否为阳性，如果特异探针呈阳性，则检测样本中含有该特异探针对应的病菌，反之阴性则不含有该特异探针对应的病菌。
2.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：所述基因芯片上的探针还包括阳性定位点探针Pos-ck，其序列如下，
阳性定位点探针Pos-ck：NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG；
步骤c还包括阳性定位点探针Pos-ck与检测阳性定位点探针的互补链探针AntiPos-ck杂交的步骤，互补链探针AntiPos-ck序列如下，
互补链探针AntiPos-ck：Cy5-CCAAATTGATCCCACCC；
步骤e还包括将探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1、探针Xcc-S2杂交结果与阳性定位点探针Pos-ck杂交结果进行比较的步骤，杂交结果相同则为阳性。
3.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝 黑腐病菌的检测方法，其特征是：所述基因芯片上的探针还包括阴性质控探针Neg-CK，其序列如下，
阴性质控探针Neg-CK：NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC。
4.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：步骤d采用激光共聚焦扫描仪扫描、软件分析得到。
5.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：步骤a之前还包括培养检测样本的步骤。
6.根据权利要求1所述的水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的检测方法，其特征是：培养检测样本是指30℃下、将检测样本在营养琼脂培养基上培养2-3天。
7.用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的PCR引物，其特征是：PCR引物包括引物XrpoD-F/XrpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R两对引物，序列分别如下，
正向引物XrpoD-F：CGGCTTCAACGACCTGATY，
反向引物XrpoD-R：GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，
正向引物PSRG-F：GAATATCAGCATCGGCAACAG，
反向引物PSRG-R：TACCGGAGCTGCGCGTT
。
8.用于检测水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的特异探针，其特征是：特异性探针包括探针Xoo-S1、探针Xooc-S1、探针Xac-A1和探针Xcc-S2，序列分别如下：
探针Xoo-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，
探针Xooc-S1：NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，
探针Xac-A1：NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，
探针Xcc-S2：NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，
探针Xoo-S1对应水稻白叶枯病菌；探针Xooc-S1对应水稻细菌性条斑病菌；探针Xac-A1对应柑桔溃疡病菌；探针Xcc-S2对应甘蓝黑腐病菌。
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