CN101492739B - 奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法。所述基因芯片包括固相载体和固定在固相载体上的特异性检测探针，所述特异性检测探针包含以大肠杆菌16S rDNA保守区为基底序列设计的通用引物序列之间的6种奶牛乳房炎主要致病菌的可变区域内设计的特异性寡核苷酸杂交探针；所述6种奶牛乳房炎主要致病菌为无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌。本发明精确限定了PCR反应的退火温度、优化了PCR扩增的核酸片段和基因芯片进行杂交的条件，获得很好的杂交效果，最终得到准确的检测结果。本发明特异性好，准确率高，稳定性可靠，检测结果假阳性率低，同时操作步骤简单，易于推广使用。

Description

奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种快速检测技术，具体涉及奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片及检测方法。

背景技术

奶牛乳房炎不但严重影响乳的品质，造成奶牛生产力严重下降以至被淘汰，而且危害人类健康，奶牛乳房炎的流行已日益成为公认的公共卫生、社会和经济问题。引起奶牛乳房炎的致病菌种类众多，目前已知的致病菌大约有220多种，其中常见的就有20多种，而90％奶牛乳房炎致病菌主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌等。

中国专利申请200710166530.3中论述了奶制品中致病菌的检测基因芯片，荧光标记于探针，所述探针为16S-23S rDNA之间筛选得到，但所述区间只有二百多个碱基，要筛选出10个探针，实际操作十分困难，不能应用于奶牛乳房炎的主要致病菌的准确检测。现有的奶牛乳房炎致病菌的检测方法有常规的生理生化鉴定法、PCR、ELISA和实时荧光定量PCR技术等，常规的生理生化鉴定法操作复杂、检测周期长、费时费力、需要有很强的专业知识和专业操作能力；PCR和ELISA法应用到致病菌的检测中，虽然大大地缩短了检测的周期，但现有的PCR法只能对少数的几种致病菌进行同时鉴定，不能实现平行高通量的检测，ELISA检测方法中抗体存在交叉反应，蛋白质样品的保存问题也限制了其推广应用；实时荧光定量PCR技术的应用大大地提高了检测的准确性，但是由于荧光标记种类和仪器检测通道限制等原因，在一个PCR反应体系中只能对少数的几种致病菌进行同时鉴定。

综上所述，现有方法奶牛乳房炎致病菌的检测方法主要的缺陷是只能对少数病原菌进行鉴别，不能在短时间内快速地对多种致病菌进行平行检测和鉴定，其次还存在着操作复杂、检测周期长、费时费力、准确性不够等缺陷，不适合大量致病菌的快速平行检测。

而奶牛乳房炎致病菌感染能力强、传播途径广，同时由于抗生素的大量使用和药物残留的问题使人们在面对奶牛乳房炎的高发和群发时，时常束手无策，多种致病菌通过散发性、群体性发病对奶业造成重大的损失，进而给人们的奶制品消费造成很大影响，对消费者的正常生活质量、社会经济持续发展等方面带来不可估量的损失。因此对引起奶牛乳房炎的主要致病菌实现快速平行检测己迫在眉睫。

如何实现上述主要致病菌的快速有效检测，是长期困扰本技术领域的技术难题，各国政府都投入大量的人力和物力用于研究如何采取相应的措施预防、控制和快速检测这些主要致病菌，以期为奶牛乳房炎的临床治疗提供技术支持。但目前尚未见到相关的技术报道和解决方案。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片，所述基因芯片具有高度的特异性，并可实现奶牛乳房炎主要致病菌的平行快速检测。

本发明的另一个目的是提供所述基因芯片的制备方法。

本发明同时提供利用所述基因芯片进行奶牛乳房炎主要致病菌的快速检测的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种奶牛乳房炎主要致病菌的快速检测基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的特异性检测探针，所述特异性检测探针包含以大肠杆菌16S rDNA保守区为基底序列设计的通用引物序列之间的6种奶牛乳房炎主要致病菌的可变区域内设计的特异性寡核苷酸杂交探针，所述探针长度在24～50bp之间；所述6种奶牛乳房炎主要致病菌为无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌。

所述固相载体为常规使用的基因芯片片基。

本发明所述基因芯片，荧光标记于引物，所述通用引物为：

上游引物：

5‘-GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAG-3；

下游引物：

5‘-Cy3-CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG-3。

所述特异性寡核苷酸杂交探针为：

无乳链球菌：

5-AGACTGATGAGTTGCGAACGGGTG-3

停乳链球菌：

5-GGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAAC-3

大肠杆菌：

5-CGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTTCT-3

肺炎克雷伯氏菌：

5-GAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGAC-3

奇异变形杆菌：

5-CGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA-3

金黄色葡萄球菌：

5-ATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTAC-3

本发明提供了所述奶牛乳房炎主要致病菌的快速检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)制取样品株和标准株的DNA；

标准株的DNA的制备方法是：将标准菌株按常规方法用LB固体培养基在37℃条件下培养16～24小时，无菌挑取单个菌落接种LB液体培养基继续在37℃条件下培养16～24小时，使用DNA抽提试剂盒提取核酸，置于-20℃保存备用。

样品株的DNA的制备方法是，采集试验菌样品株，经常规生理生化测定鉴定后，用直接煮沸法提取DNA，离心，取上清作为PCR扩增模板。所述样品株为：无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌菌株。

(2)设计通用引物并进行荧光标记后对样品株和标准株的DNA进行PCR反应，扩增奶牛乳房炎主要致病菌的特异性核酸片段；

(3)在同一引物之间设计并筛选奶牛乳房炎主要致病菌的特异性检测探针，并进行点样，制备得到所述基因芯片。所述基因芯片室温放置18个小时后即可用于检测使用。

步骤(2)所述PCR反应的退火温度为57℃。

本发明同时提供了一种利用上述基因芯片进行奶牛乳房炎主要致病菌快速检测的方法：利用PCR扩增的奶牛乳房炎主要致病菌的特异性核酸片段和所述基因芯片进行杂交，利用芯片扫描仪对杂交结果进行扫描和分析得检测结果。

所述PCR扩增的特异性核酸片段和基因芯片进行杂交的杂交温度为：42℃。

本发明的有益效果是：通过制备得到引起奶牛乳房炎的主要致病菌的基因芯片，确定了奶牛乳房炎的主要致病菌的基因芯片快速检测方法，尤其是针对常见的6种致病菌，能够准确快速、高通量地检测出奶牛乳房炎感染的致病菌的种类。本发明精确限定了PCR反应的退火温度、优化了PCR扩增的核酸片段和基因芯片进行杂交的条件，获得很好的杂交效果，最终得到准确的检测结果。本发明特异性好，准确率高，稳定性可靠，检测结果假阳性率低，同时操作步骤简单，易于推广使用。

具体实施方式

下面结合具体实验例来进一步详细说明本发明。

实施例1奶牛乳房炎主要致病菌的快速检测实验

1、仪器及试剂为：

iCycler PCR仪(Bio-Rad公司)、GenePix 4000B扫描仪(Axon公司)、PixSys 5000点样仪(Cartesian公司)、8909型DNA合成仪(ABI公司)、DU640紫外分光光度计(Beckman公司)、Gel Doc1000凝胶成像仪(Bio-Rad公司)。DNA合成试剂均购自美国Glen Research公司，PCR相关试剂购自上海生物工程有限公司，基因芯片片基购自CEL Associates公司，Cy3荧光染料购自Amersham公司。兔血琼脂培养基，LB液体培养基，LB固体培养基，其他试剂均为Promega公司产品。

2、实验步骤

(1)制取样品株和标准株的DNA；

6种主要致病菌标准菌株的DNA的制备：

标准菌株从中国兽医监察所购买，按常规方法用LB固体培养基在37℃条件下培养16～24小时，无菌挑取单个菌落接种LB液体培养基继续在37℃条件下培养16～24小时。使用上海生物工程技术服务公司的DNA抽提试剂盒提取核酸。置于-20℃保存备用。

6种奶牛乳房炎主要致病菌的DNA的制备：

临床采集的6种奶牛乳房炎主要致病菌经生理生化测定进行检测鉴定后，用直接煮沸法提取DNA，离心，取上清作为PCR扩增模板。

(2)利用Primer premier 5.0软件以大肠杆菌(检索号：U00096)16S rDNA保守区为基底序列设计通用引物，进行荧光标记后对样品株和标准株的DNA进行PCR反应，扩增奶牛乳房炎主要致病菌的特异性核酸片段，扩增片段长度为495bp。PCR反应的退火温度为57℃。

表1PCR反应体系

组份	μL
		10×PCR反应缓冲液	2.5
25mM的MgCl2溶液	2
		dNTP	2
非荧光引物	0.5
		荧光引物	0.5
Taq DNA聚合酶	0.5
		模板DNA	2
加无菌去离子水至	25μL/反应管

所述通用引物为：

上游引物：

5‘-GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAG-3；

下游引物：

5‘-Cy3-CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG-3。

表2PCR反应程序

(3)在通用引物序列之间各自菌株的可变区域内设计各个细菌的多条备用特异性寡核苷酸杂交探针，长度在24～50bp之间。

6种特异性检测探针分别为：

无乳链球菌：

5-AGACTGATGAGTTGCGAACGGGTG-3

停乳链球菌：

5-GGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAAC-3

大肠杆菌：

5-CGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTTCT-3

肺炎克雷伯氏菌：

5-GAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGAC-3

奇异变形杆菌：

5-CGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA-3

金黄色葡萄球菌：

5-ATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTAC-3

利用PCR扩增的特异性核酸片段和制备的基因芯片进行杂交的杂交温度为：42℃。

(4)将合成的寡核苷酸探针冻干粉按照常规技术进行矩阵形式点样到玻片上，点样仪内温度保持在23℃，相对湿度大于85％。基因芯片制备完毕后，室温放置18个小时后即可用于杂交。

荧光标记的PCR产物与杂交液(5×SSC，2.5％甲酰胺，0.2％SDS)以1∶4的比例混匀，取10μl转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60分钟。

杂交后的芯片于室温条件下依次在洗液A、洗液B和洗液C中各洗涤40秒，置室温晾干，用芯片扫描仪GenePix 4000B对杂交芯片进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。所述洗液A、洗液B和洗液C的成份组成为：洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)。洗涤方法采用常规方法。

实施例2评价实验

为了评价本发明方法对临床样品检测的能力，分别对从广东增城奶牛场和广州市华美奶牛场采集分离到的78份临床样品，取8ul过夜培养上清液做模板进行PCR扩增和基因芯片杂交，并与常规分离、纯化、培养、菌属鉴定方法进行比较。结果见表3，表3显示与常规培养法相比较，其中有9例样品的常规方法检测结果与基因芯片方法不一致，1例为无乳链球菌，5例为大肠杆菌；其他3例为奇异变形杆菌，实验建立的基因芯片检测的符合率达到89.46％。

表3基因芯片和常规检测方法比较结果

Claims (1)

1.一种奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的特异性检测探针，其特征在于所述特异性检测探针包含以大肠杆菌16S rDNA保守区为基底序列设计的通用引物序列之间的6种奶牛乳房炎主要致病菌的可变区域内设计的特异性寡核苷酸杂交探针；所述6种奶牛乳房炎主要致病菌为无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌；所述通用引物序列为：

上游引物：

5‘-GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAG-3；

下游引物：

5‘-Cy3-CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG-3；

所述特异性寡核苷酸杂交探针为：

无乳链球菌：

5-AGACTGATGAGTTGCGAACGGGTG-3；

停乳链球菌：

5-GGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAAC-3；

大肠杆菌：

5-CGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTTCT-3；

肺炎克雷伯氏菌：

5-GAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGAC-3；

奇异变形杆菌：

5-CGGTAACAGGAGAAAGCTTGCTTTCTTGCTGA-3；

金黄色葡萄球菌：

5-ATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTAC-3。