CN108456729A - 用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用，所述引物组合包括8组，其中，第一组引物如序列表SEQ ID No.1‑3所示，第二组引物如序列表SEQ ID No.4‑6所示，第三组引物如序列表SEQ ID No.7‑9所示，第四组引物如序列表SEQ ID No.10‑12所示，第五组引物如序列表SEQ ID No.13‑15所示，第六组引物如序列表SEQ ID No.16‑18所示，第七组引物如序列表SEQ ID No.19‑21所示，第八组引物如序列表SEQ ID No.22‑24所示；上述8组引物组合依次用于检测奶牛遗传缺陷病CVM、BLAD、HH1、HH3、HH4、HH5、HCD和BY所对应的遗传缺陷基因位点。该引物组合能够快速、低成本、高灵敏度地同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点。
Description
技术领域
本发明是关于生物技术领域，特别是关于一种用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
奶牛生产中，人工授精技术被广泛应用，在提高种公牛使用效率的同时，也导致遗传缺陷(genetic defect)基因在群体内扩散风险增加。科学家们在过去20多年里，在荷斯坦牛中先后发现了多种遗传缺陷基因，包括白细胞黏附缺陷(bovine leukocyte adhesiondeficiency，BLAD；Shuster et al.1992)，脊柱畸形综合征(complex vertebralmalformation，CVM；Agerholm et al.2001)，短脊柱畸形综合征(Brachyspina，BY；Charlier et al.2012)等，其中，BLAD是一种牛的造血系统遗传性疾病，本病病因为白细胞表面的粘附分子(整合素)CDl8亚单位编码序列383位碱基由A突变为G所致，相应的位于胞外高度保守区的128位天门冬氨酸变成了甘氨酸，致使白细胞表面的CDl8整合素亚单位表达明显减少或缺乏，导致机体在炎症反应时外周血液中的白细胞不能通过自身整合素与血管内皮粘附分子相互作用而黏附到血管内皮上，最终无法穿过血管壁到达病原侵入部位和对病原体直接做出反应,进而导致机体发病。CVM是荷斯坦牛的一种由常染色体单基因控制的隐性遗传病，该病的发生是由于编码UDP-N-乙酰葡糖胺载体的溶质转运家族35-3(SLC35A3)基因第4外显子559处发生G→T突变，导致180处缬氨酸置换为苯丙氨酸，致使异常的核苷酸糖转运到高尔基体。牛短脊柱畸形综合征(Brachyspina syndrome，BS或BY)的分子遗传机制是牛21号染色体(BTA21)上FANCI(Fanconi anemia complementation-groupI)基因上的一段3329bp的缺失突变，导致25、26、27外显子的丢失，在877位氨基酸位点处发生了结构变化：原本C末端的451个氨基酸的肽链被仅含26个氨基酸的残肽所取代。
近年来，随着基因组检测技术发展，大量基因组数据分析显示，在荷斯坦牛群中存在一些频率较高但是从未纯合的单倍型，一旦纯合就会造成胚胎早期死亡或者初生犊牛死亡，其中在荷斯坦牛中就包括缺陷单倍型HH1、HH2、HH3(Holstein haplotype；VanRaden etal.,2011)，HH4(Fritz et al.,2013)，HH5(Cooper et al.,2013)和HCD(haplotype forcholesterol deficiency；Kipp et al.,2015)。随后，利用二代测序等基因组分析技术，这些遗传缺陷单倍型的致因突变被陆续发现。HH1单倍型纯合致死的原因是APAF1基因中出现无义突变(Adams et al.,2012)，HH3是由于8号染色体上SMC2基因存在T/C错义突变(Daetwyler et al.,2014,McClure et al.,2014)，HH4是由GART基因一个A/C错义突变导致的(Fritz et al.,2013)，HH5的致病机理是由于在9号染色体存在138Kb片段插入(Schütz et al.,2016)，HCD是由于APOB基因上存在插入(Charlier,2016；Menzi et al.,2016；Schütz et al.,2016)。
这些遗传缺陷基因都呈隐性遗传模式，携带者本身表现正常，但如果携带者公牛和携带者母牛交配，有1/4后代为缺陷基因纯合子，表现为胚胎早期死亡或者初生牛犊死亡，因此，为了实现牛群改良，需要及时检测和发现遗传缺陷携带者，逐步淘汰携带者，同时采用科学手段避免携带者之间的交配。
有关遗传缺陷位点的检测方法，已有相关报道。针对变异位点未知的遗传缺陷单倍型，VanRaden等(2011)报道了基于单核苷酸多态(SNP)单倍型推断的HH1、HH2和HH3检测方法。Adam(2016)提到了用24个SNP进行HH1单倍型检测的方法。这些基于单倍型的方法，需要首先对待检样本进行SNP芯片检测，然后通过统计学方法推断单倍型，进而判定个体携带HH1的概率。此方法不仅因依赖芯片检测而成本很高，同时还需事先建立参考群体的基因型数据库；另外，由于其本质上是利用周围SNP标记对致病突变位点基因型的间接推断，所以结果并非100％准确。
对于变异位点已知的遗传缺陷基因，可以设计直接检测方法。例如，有报道通过PCR产物电泳的方法检测BY遗传缺陷基因变异位点(Fang et al.2013)，用PCR-SSCP方法检测CVM(Chu et al.2008)，采用PCR-RFLP方法检测BLAD(Shuster et al.1992)和HH4(Fritzet al.,2013)，采用了高分辨溶解曲线方法(High-resolution melting，HRM)检测HH5和HCD(Schütz et al.2016)。
然而，目前已有的检测方法，都是针对单个致病位点检测，缺乏低成本高效率的多位点联合检测方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用，其能够快速、低成本、高灵敏度地同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合，所述引物组合包括8组，其中，第一组引物如序列表SEQ ID No.1-3所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如序列表SEQ IDNo.4-6所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如序列表SEQ ID No.7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如序列表SEQ ID No.10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如序列表SEQ ID No.13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如序列表SEQ ID No.16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如序列表SEQ ID No.19-21所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HCD所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如序列表SEQ IDNo.22-24所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征(BY)所对应的遗传缺陷基因位点，其中CVM、BLAD、HH1、HH3和HH4所对应的遗传缺陷基因位点的变异类型为单核苷酸多态(SNP)，而HH5、HCD和BY所对应的遗传缺陷位点为DNA片段缺失或插入。
本发明基于竞争性等位基因特异性PCR的原理，设计了用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合，利用这些引物能够实现多个位点同时检测，从而根据这些分子标记位点基因型，挑选非携带者种牛留种，淘汰携带者种牛，从而提高选种准确性和效率。
竞争性等位基因特异性PCR的基本原理是，对每一个基因位点，设计3条引物，包括上游引物2条和下游引物1条，其中2条上游引物是根据两个等位基因序列差异而设计的，分别加上不同的荧光基团(FAM和HEX)，然后经过3条引物复合扩增和PCR产物荧光检测，根据荧光信号进行基因型分型。
在一优选的实施方式中，每组引物包括两条上游引物和一条下游引物。
在一优选的实施方式中，每组引物中的三条引物在核苷酸序列表中按次序排列的第一条引物和第二条引物为上游引物，第三条引物为下游引物。
在一优选的实施方式中，所述上游引物携带有HEX或FAM荧光基团。
在一优选的实施方式中，第一条上游引物携带HEX荧光基团，第二条上游引物携带FAM荧光基团。
在一优选的实施方式中，所述下游引物为通用下游引物。
本发明还提供了一种用于同时检测8种奶牛遗传缺陷基因位点的试剂盒，所述试剂盒包含上述8组引物。
在一优选的实施方式中，所述试剂盒还包含模板DNA、PCR预混液和双蒸水，其中，所述PCR预混液中包含dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液。
在一优选的实施方式中，每组引物与模板DNA、PCR预混液以及双蒸水组成一个PCR反应体系，共组成8个PCR反应体系，每个PCR反应体系的体积为1uL，优选的，每组引物中的三条引物的体积比为1:1:1。
上述每个PCR反应体系配制如下：
其中，DNA模板的浓度为29-32ng/μL，PCR预混液(2×)购自Thermo ScientificTM，货号K0171。
上述8个PCR反应体系同时在微流控芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司，产品编号G020010)上进行扩增反应，扩增程序均为：95℃变性15min，之后为降落PCR(touchdownPCR)扩增10个循环，变性温度95℃，退火温度在10个循环中从61℃降落到55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；然后为常规PCR扩增26个循环，变性温度95℃，退火温度55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；最后37℃延伸60sec。
本发明还提供了上述引物组合或试剂盒在制备用于检测奶牛遗传缺陷疾病试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所涉及的引物在设计时经过了一系列优化过程，第一，为了确保引物特异性，在引物设计时以及引物设计后对引物进行分析，与基因组序列比对，保证设计的引物只和目标序列完全匹配，在基因组上没有相似扩增产物；第二，为了实现8对引物在相同条件下扩增，引物设计时综合考虑引物长度、GC含量、引物二级结构和引物之间互补性等因素，使8对引物在扩增时具有相似的退伙温度(Tm值)和扩增效率；第三，针对大片段缺失或插入类型的三个位点(BY、HH5、HCD)，设计引物难度较大，发明人在详细分析缺失或插入片段的序列以及其插入位点两侧序列的基础上，通过多次尝试和优化，才获得效果良好的引物组合。
(2)现有技术思路往往需要独立检测8个位点，这样操作复杂、耗时较长，同时DNA模版需要量较大。与现有技术相比，根据本发明的用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合，这些引物经过了优化设计，具有相似的退火温度，能够实现8个标记在相同的PCR扩增条件下同时扩增，每个PCR反应体系的体积只有1uL，DNA模板只需5～10ng，大大增加了检测效率和反应灵敏度；应用该引物组合进行检测，具有速度快、成本低、灵敏性高及易于实现多位点联合检测等优点。
(3)此外，本发明所设计的8个位点的引物，可以同时检测8个位点，也可以只挑选其中部分位点进行检测，体现了极大的灵活性。这样在实际应用中，可以根据实际需求结合系谱信息，只检测部分位点，从而节约检测成本。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛脊柱畸形综合征(CVM)所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图2是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图3是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图4是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图5是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛白细胞粘附缺陷(BLAD)所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图6是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛短脊柱畸形综合征(BY)所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图7是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图；
图8是根据本发明一实施方式的检测荷斯坦牛390个样本中奶牛缺陷单倍型HCD所对应的遗传缺陷基因位点的结果散点图。
主要附图标记说明：
1-野生型纯合子，2-遗传缺陷基因携带者。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1引物设计
1.挑选荷斯坦牛遗传缺陷病CVM、BLAD、HH1、HH3、HH4、HH5、HCD和BY所对应的遗传缺陷基因位点；其中CVM、BLAD、HH1、HH3和HH4所对应的遗传缺陷基因位点的变异类型为单核苷酸多态(SNP)，而HH5、HCD和BY所对应的遗传缺陷基因位点为DNA片段缺失或插入。
2.基于竞争性等位基因特异性PCR的原理，对SNPs或者特定位点上DNA片段缺失插入(InDels)进行精准的双等位基因判断，实现基因型分型。
1)针对每个遗传缺陷基因变异位点的两个等位基因，分别设计两个上游PCR引物，它们分别特异性地与两个等位基因的模板序列结合，这两个引物分别携带HEX或FAM荧光基团，此外，设计1个通用下游引物(如表1所示)。
2)将这些引物用于竞争性等位基因特异性PCR扩增，最后对PCR产物进行荧光信号检测，根据荧光信号分组即可对样本进行基因型分型。
表1引物序列
实施例2遗传缺陷基因位点检测
1.采集390头荷斯坦牛血液，提取基因组DNA；
2.基于竞争性等位基因特异性PCR的原理进行SNP分型，其中PCR反应在微流控芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司，产品编号G020010)上完成，方法步骤为：
1)在一个专用的微流控芯片上，在芯片孔中注入特定位点的扩增引物和待检测的基因组DNA；
2)配置PCR扩增反应混合液，其中包含dNTPs和扩增缓冲液，用移液器将配置的混合液从微流控芯片孔注入到芯片里，并密封进出口；
其中，每个芯片孔中所加入的每组引物的PCR反应体系配制如下：
其中，DNA模板的浓度为30ng/μL，每组引物中的三条引物的体积比为1:1:1，PCR预混液(2×)购自Thermo ScientificTM，货号K0171。
3)将芯片放入到离心机中4000rpm离心1min；
4)放入芯片热封仪中进行热封1sec；
5)放入平板PCR仪上进行扩增反应，PCR扩增程序为：首先95℃变性15min，之后为降落PCR(touchdown PCR)扩增10个循环，变性温度95℃，退火温度在10个循环中从61℃降落到55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；然后为常规PCR扩增26个循环，变性温度95℃，退火温度55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；最后37℃延伸60sec。
6)PCR扩增程序运行结束后，将芯片放入荧光信号扫描仪，进行扫描，生成图像文件，通过软件转换成数据信号值，然后进行分型。
检测结果如表2，共检测390头母牛，除了遗传缺陷基因位点HH4之外，其它7个位点都检测出杂合子，即遗传缺陷基因携带者母牛。
表2检测结果
| SNP ID | 检测样品数 | 分型检出率 | 正常纯合子 | 隐性纯合子 | 杂合子 |
| CVM | 390 | 100％ | 349 | 0 | 41 |
| HH1 | 390 | 100％ | 351 | 0 | 39 |
| HH3 | 390 | 100％ | 380 | 0 | 10 |
| HH4 | 390 | 100％ | 390 | 0 | 0 |
| BLAD | 390 | 100％ | 388 | 0 | 2 |
| BY | 390 | 100％ | 382 | 0 | 8 |
| HH5 | 390 | 100％ | 387 | 0 | 3 |
| HCD | 390 | 100％ | 385 | 0 | 5 |
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 中国农业大学
北京市畜牧总站
北京博奥晶典生物技术有限公司
<120> 用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用
<130> P180900DD1F
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacaatttgt aggtctcatg gcag 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggatcacc gaaacggcaa g 21
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<211> 28
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aaggcagctg tcaaatttat tgttgttt 28
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<210> 20
<211> 26
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<400> 20
gtaaagtaga acttgcttgc cttcat 26
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtacgacct caagctggct gtt 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggaggacacg gatagaaagg tga 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaggacacgg atagaaaggt gg 22
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cacacctatc ttacggtaca cccat 25
Claims (10)
1.一种用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括8组，其中，第一组引物如序列表SEQ ID No.1-3所示，用于检测奶牛脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点；第二组引物如序列表SEQ ID No.4-6所示，用于检测奶牛白细胞粘附缺陷所对应的遗传缺陷基因位点；第三组引物如序列表SEQ ID No.7-9所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH1所对应的遗传缺陷基因位点；第四组引物如序列表SEQ ID No.10-12所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH3所对应的遗传缺陷基因位点；第五组引物如序列表SEQID No.13-15所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH4所对应的遗传缺陷基因位点；第六组引物如序列表SEQ ID No.16-18所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HH5所对应的遗传缺陷基因位点；第七组引物如序列表SEQ ID No.19-21所示，用于检测奶牛缺陷单倍型HCD所对应的遗传缺陷基因位点；第八组引物如序列表SEQ ID No.22-24所示，用于检测奶牛短脊柱畸形综合征所对应的遗传缺陷基因位点。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，每组引物包括两条上游引物和一条下游引物。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于，每组引物中的三条引物在核苷酸序列表中按次序排列的第一条引物和第二条引物为上游引物，第三条引物为下游引物。
4.如权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述上游引物携带有HEX或FAM荧光基团。
5.如权利要求4所述的引物组合，其特征在于，第一条上游引物携带HEX荧光基团，第二条上游引物携带FAM荧光基团。
6.如权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述下游引物为通用下游引物。
7.一种用于同时检测8种奶牛遗传缺陷基因位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的8组引物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含模板DNA、PCR预混液和双蒸水，其中，所述PCR预混液中包含dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，每组引物与模板DNA、PCR预混液以及双蒸水组成一个PCR反应体系，每个PCR反应体系的体积为1uL，优选的，每组引物中的三条引物的体积比为1:1:1。
10.权利要求1所述的引物组合或权利要求7所述的试剂盒在制备用于检测奶牛遗传缺陷疾病试剂中的应用。
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