CN109022599A - 检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs - Google Patents

检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs Download PDF

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Abstract

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs。该RFLP方法以奶牛基因组DNA为模板，PCR扩增奶牛CCL28基因片段，通过创造酶切位点消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果鉴定CCL28基因3个位点的单核苷酸多态性，并确定三个位点形成的单倍体型与奶牛乳腺炎的抗病性状相关。本发明利用在DNA水平上检测奶牛CCL28基因SNPs的RFLP方法简单、快速、成本低，且该试剂盒可用于中国荷斯坦奶牛乳腺炎抗病标记辅助选择，以便建立稳定的抗乳腺炎奶牛群。

Description

检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及 相关SNPs
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是由于单个核苷酸的突变而引起DNA序列的多态性，有单碱基的转换、颠换、缺失和插入等4种形式。SNP是目前被研究最多、前景最大的一种第三代分子标记技术，是物种遗传多样性的主要原因之一。该标记方法具有遗传稳定性、分布广泛性、功能普遍性、二态性、等位基因性、快速检测和自动化分析等特点。而且，SNP与包括奶牛在内的生物的众多表型性状密切相关，通过对候选基因的SNPS的筛选、单倍体组合的分析以及与相关生长、生产或者抗病性状进行关联分析得出育种方案，可以为奶牛的抗病育种前期工作奠定良好基础。
截至目前，经过大量探索和改进，形成了许多用于检测SNP的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术、高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、芯片法以及PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)。其中PCR-RFLP方法是一种有效的检测技术，该方法在发现SNP位点后，选用先天的或者创造酶切位点，使用限制性内切酶进行切割，然后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分析，准确鉴别不同个体该位点的不同基因型。该方法不仅具有测序法的准确性，又克服了其他费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。
抗病性的标记辅助选择(molecular mark-assist selection，MAS)就是预判疾病抗性的有或无、大或小，具体就是挖掘与生物体疾病相关的抗性基因的分子标记，然后借助DNA分子标记对群体资源进行选择，最终对不同个体的抗病性能进行预判，或者达到早期选种以及抗病育种的目的，从而在个体疾病防控或者畜禽抗病育种获得更大的遗传进展。
奶牛乳腺炎(Mastitis)是指奶牛乳腺组织受到物理、化学刺激，尤其是微生物的侵袭而发生的一种炎症反应，它不仅影响乳汁品质，而且降低产奶量，给奶业发展造成了严重的危害，是危害奶牛业发展的四大疾病之一，因此，及时准确预判奶牛个体未来乳腺炎发病情况就显得尤为重要了。而乳汁中的体细胞评分(SCS)和乳腺炎之间的平均遗传相关值为0.70，高的遗传相关使得人们可以通过候选基因多态性与SCS进行关联分析，最终得到显著影响奶牛乳腺炎抗性的分子标记。
趋化因子(Chemokinne，CK)指能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，其在肿瘤等疾病中发挥重要作用。CCL28是CC趋化因子中的一员，参与炎症反应，具有防御功能，转录组学分析CCL28在健康和患病乳腺组织中存在差异表达，预示其可以参与乳腺炎的发病过程。
目前，现有技术存在的问题是，缺乏检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的专用试剂盒。
发明内容
本发明提供的一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs，利用限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、SalⅠ可快简单、快速、成本低、精确地检测奶牛CCL28基因3个单核苷酸多态性位点，从而简单、快速、成本低、精确地检测奶牛CCL28基因单核苷酸的多态性。
本发明的第一个目的是提供一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒，包括引物对P1、P2、P3，2×Taq PCR Masster Mix，灭菌超纯水，限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、SalⅠ，10×Quick Cut Buffer；引物对P1的上游引物F1序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R1序列如SEQ ID NO.2所示；引物对P2的上游引物F2序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物R2序列如SEQ IDNO.4所示；引物对P3的上游引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物R3序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述的试剂盒检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，包括以下步骤：
S1，采集奶牛血样，提取并纯化奶牛基因组DNA
S2，设计合成扩增引物，PCR扩增反应
合成引物对P1、P2、P3；以S1得到的纯化后的基因组DNA为模板，分别以P1、P2、P3为引物对进行PCR扩增反应，分别得到相应的P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物；
S3，PCR产物酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
用限制性内切酶KpnⅠ酶切P1引物的PCR产物，酶切后得到第g.-601位酶切产物；用限制性内切酶HindⅢ酶切P2引物的PCR产物，酶切后得到第g.72位酶切产物；用限制性内切酶SalⅠ酶切P3引物的PCR产物，酶切后得到第g.14819位酶切产物；再分别对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳鉴定奶牛CCL28基因单核苷酸多态性位点的基因型。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述的RFLP方法检测出的与奶牛乳腺炎性状相关的奶牛CCL28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位的SNPs，，且第g.-601位的SNPs的基因型为GG、CC和CG，第g.72位的SNPs的基因型为GG、TT和TG，第g.14819位的SNPs的基因型为AA、GG和AG。
优选的，上述奶牛CCL28基因第g.-601位多态性检测结果为：GG基因型表现为226bp和25bp的条带，CC基因型表现为251bp的条带，CG基因型表现为251bp、226bp和25bp的条带；
奶牛CCL28基因第g.72位多态性检测结果为：GG基因型表现为250bp和25bp的条带,TT基因型表现为的条带为275bp，TG基因型表现为275bp、250bp和25bp的条带；
奶牛CCL28基因第g.14819位多态性检测结果为：AA表现为300bp和25bp的条带,GG基因型表现为325bp的条带，AG基因型表现为325bp、300bp和25bp的条带。
优选的，上述检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，S2中，引物对P1的PCR扩增反应体系25μL如下：2×Taq PCR MassterMix 12.5μL、灭菌超纯水9.5μL、10μmol/L上游引物F1 1μL、10μmol/L下游引物R1 1μL、50ng/μL DNA模板1μL；
引物对P2以及引物对P3的PCR扩增反应体系与引物对P1的PCR扩增反应体系相同，区别在于，引物对P2的PCR扩增反应体系采用的是上游引物F2和下游引物R2，引物对P3的PCR扩增反应体系采用的是上游引物F3和下游引物R3。
优选的，上述检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，S2中，引物对P1以及引物对P3的PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，53.2℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
引物对P2的PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
优选的，上述检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，引物对P1的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×Quick CutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶KpnⅠ0.5μL；
引物对P2的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×QuickCutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶HindⅢ0.5μL；
引物对P3的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×QuickCutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶SalⅠ0.5μL；
P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物的酶切条件均为37℃消化30-60min。
优选的，上述检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，S3中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量浓度8％的聚丙烯酰胺凝胶。
与现有技术相比，本发明的检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs，具有以下有益效果：
本发明通过PCR-RFLP法检测候选基因CCL28的三个SNPs，并通过单倍型组合与奶牛抗乳腺炎的相关性分析，检测不同奶牛个体乳腺炎的抗性，建立了一个行之有效、简单可行的检测试剂盒，筛选出与奶牛的乳腺炎性状相关的奶牛CCL28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位3个SNPs。
本发明提供的奶牛CCL28基因单核苷酸多态性检测方法，针对第g.-601位的启动子中C到G的突变，PCR扩增CCL28基因启动子区的基因片段后，当没有发生突变时，不能形成KpnⅠ识别位点，不能被切开；而由C突变G成时，则含有KpnⅠ识别位点，可以被酶切形成226bp和25bp大小的条带，见图3A。
本发明提供的奶牛CCL28基因单核苷酸多态性检测方法，针对第g.72位的启动子中T到G的突变，PCR扩增CCL28基因启动子区的基因片段后，当没有发生突变时，不能形成HindⅢ识别位点，不能被切开；而由T突变G成时，则含有HindⅢ识别位点，可以被酶切形成250bp和25bp大小的条带，见图3B。
本发明提供的奶牛CCL28基因单核苷酸多态性检测方法，针对第g.14819位的启动子中A到G的突变，PCR扩增CCL28基因启动子区的基因片段后，当由C突变G成时，不能形成SalⅠ识别位点，不能被切开；而没有发生突变时，则含有SalⅠ识别位点，可以被酶切形成300bp和25bp大小的条带，见图3C。
因此，本发明中利用限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、SalⅠ可快速鉴定奶牛CCL28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位3个多态位点，从而简单、快速、成本低、精确地检测奶牛CCL28基因单核苷酸的多态性，可用于奶牛乳腺炎的抗病育种中。
附图说明
图1是奶牛CCL28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位多态位点的测序图；
图2是奶牛CCL28基因片段及引物序列图；
其中图2A、图2B、图2C分别为第g.-601位、第g.72位、第g.14819位多态位点；
图3是奶牛CCL28基因酶切产物电泳结果图；
其中图3A、图3B、图3C分别为第g.-601位、第g.72位、第g.14819位多态位点PCR产物的酶切电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
本发明提供了一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒，包括引物对P1、P2、P3，2×Taq PCR Masster Mix(市售的2×Taq PCR Masster Mix，内含Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Buffer等)，灭菌超纯水；引物对P1的上游引物F1序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R1序列如SEQ ID NO.2所示；引物对P2的上游引物F2序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物R2序列如SEQ ID NO.4所示；引物对P3的上游引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物R3序列如SEQ ID NO.6所示。
基于同一种发明构思，本发明提供了一种利用所述的试剂盒检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，包括以下步骤：
S1，采集奶牛样本，提取奶牛基因组DNA
(1)采集奶牛样本
采集奶牛颈静脉血液(本发明所使用的荷斯坦牛颈静脉血液取自河南省规模化牛场，包括河南维尔牧业有限公司、原阳县富民奶牛养殖有限公司等，即本发明所用血样的直接来源和原始来源)，ACD抗凝。实验牛共86头，来自河南省内的规模化奶牛场。
(2)提取奶牛基因组DNA
以奶牛颈静脉血液为血样样本，利用百泰克全血基因组DNA提取试剂盒提取奶牛的基因组DNA，纯化，得到的基因组DNA样品被稀释成50ng/μL备用。
S2，设计合成扩增引物，PCR扩增反应
合成引物对P1、P2、P3，以S1得到的纯化后的基因组DNA为模板分别进行PCR扩增反应，分别得到相应的P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物；具体入如下：
(1)设计合成扩增引物
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.gov/)公布的牛CCL28基因序列(GenBankAccession No.NC_0373747.1(31371651-31408885))为参考，利用Primer Premier5.0设计引物分别扩增CCl28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位多态位点的目的片段，参见图1，“g.”表示该位点在该基因上的位置，由上海生工生物工程有限责任公司合成CCL28基因3对引物P1、P2、P3，引物对序列信息见表1。
图2是奶牛CCL28基因片段及引物序列图；其中图2A、图2B、图2C分别为第g.-601位、第g.72位、第g.14819位多态位点。上游引物F1中把原序列的AC突变成GT(表1中加框碱基)，引入KpnⅠ酶切位点G^GTACC，^表示切断点；上游引物F2中把原序列的CT突变成AA(表1中加框碱基)，引入HindⅢ酶切位点AAG^CTT，^表示切断点；上游引物F3中把原序列的G突变成CG(表1中加框碱基)，引入SalⅠ酶切位点GT^CGAC，^表示切断点；从而分别构建了KpnⅠ、HindⅢ、SalⅠ的酶切位点，可使用PCR-RFLP方法进行基因型的判定。
表1 PCR反应的引物信息
(2)PCR扩增反应
以个86头奶牛的基因组DNA为模版，分别用表1的引物对其进PCR行扩增，反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和次反应所需的反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2ml Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；P1、P2、P3引物的体系基本相同，见表2，只是具体的引物序列不同。
表2 PCR扩增反应体系
P1、P3引物的PCR反应程序见表3，P2引物的PCR反应程序见表4。
表3 P1和P3反应程序
表4 P2反应程序
经过P1、P2、P3引物的PCR扩增后，分别得到三种不同的PCR产物，即分别得到相应的P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物。
S3，PCR产物酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
(1)PCR产物酶切
用限制性内切酶KpnⅠ酶切P1引物的PCR产物，即酶切含奶牛CCL28基因第g.-601位单核苷酸多态位点的PCR产物，酶切后得到第g.-601位酶切产物；用限制性内切酶HindⅢ酶切P2引物的PCR产物，即酶切含奶牛CCL28基因第g.72位单核苷酸多态位点的PCR产物，酶切后得到第g.72位酶切产物；用限制性内切酶SalⅠ酶切P3引物的PCR产物，即酶切含奶牛CCL28基因第g.14819位的单核苷酸多态位点的PCR扩增产物，酶切后得到第g.14819位酶切产物；再分别对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定奶牛CCL28基因单核苷酸多态性。
P1引物的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×QuickCutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶0.5μL。
P2、P3引物的PCR产物酶切体系与P1引物的PCR产物酶切体系相同，区别在于分别使用的是P2引物的PCR产物和P3引物的PCR产物来替换P1引物的PCR产物。
P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物的酶切条件均为37℃消化30-60min。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
①制作8％的聚丙烯酰胺凝胶，点样后150V电压，电泳1h；
②待分子量不同的DNA片段分离清晰时，取出凝胶；
③根据凝胶成像系统分析结果,对各样品进行判型、记录其基因型。
第g.-601位酶切产物检测到的奶牛CCL28基因第g.-601位多态性为：GG基因型表现为226bp和25bp的条带，CC基因型表现为251bp的条带，CG基因型表现为251bp、226bp和25bp的条带。由于25bp的条带较小，故在聚丙烯酰胺凝胶中不易被观察到，但如果只检测到251bp和226bp依旧能准确的鉴别出GG基因型、CG基因型、CC基因型。
第g.72位酶切产物检测到的奶牛CCL28基因第g.72位多态性为：GG基因型表现为250bp和25bp的条带,TT基因型表现为的条带为275bp，TG基因型表现为275bp、250bp和25bp的条带。由于25bp的条带较小，故在聚丙烯酰胺凝胶中不易被观察到，但如果只检测到251bp和226bp依旧能准确的鉴别出GG基因型、TG基因型、TT基因型。
第g.14819位酶切产物检测到的奶牛CCL28基因第g.14819位多态性为：AA表现为300bp和25bp的条带,GG基因型表现为325bp的条带,AG基因型表现为325bp、300bp和25bp的条带。由于25bp的条带较小，故在聚丙烯酰胺凝胶中不易被观察到，但如果只检测到251bp和226bp依旧能准确的鉴别出GG基因型、AG基因型、AA基因型。
图3是奶牛CCL28基因酶切产物电泳结果图；其中图3A、图3B、图3C分别为第g.-601位、第g.72位、第g.14819位多态位点PCR产物的酶切电泳结果；图3A、图3B、图3C中泳道以基因型进行区分，M泳道是DNAmaker，GG、CG、CC、TG、TT、GG、AA、AG、GG泳道代表基因型。
为了进一步分析奶牛CCL28基因单核苷酸多态性，我们还进行了奶牛CCL28基因第.-660位、第g.72位和第g.14819位SNP的频率统计分析
(1)基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA从代表某一位点的AA基因型频率；NAA从表示群体中具有基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+……+NAan)/2N，式中PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量,NAai表示群体中具有基因型个体数量，a1—an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。
在奶牛CCL28基因第.-660位、第g.72位和第g.14819位SNP中，基因型频率及等位基因频率如表5所示。
表5奶牛CCL28基因SNP的基因型和等位基因频率
当P>0.05时，说明群体基因遗传平衡，由表可知3个SNP均符合群体遗传学Hardy-Weinberg平衡定律。
为了进一步分析奶牛CCL28基因单核苷酸多态性，我们还进行了奶牛CCL28基因SNP单倍型组合构建分析
运用Shesis软件计算统计SNPs位点间各种单倍型。在CCL28基因共发现8种单倍型，分别是H1(CGA)、H2(CGG)、H3(CTA)、H4(CTG)、H5(GGA)、H6(GGG)、H7(GTA)和H8(GTG)，单倍型频率分别为0.095、0.032、0.588、0.060、0.027、0.081、0.071和0.045，如表6所示。单倍型频率小于0.03时，数据将会被自动删除。对3个SNPs进行单倍型组合分析，共发现27种单倍型组合：H2H2(CCGGGG)、H1H2(CCGGAG)、H1H1(CCGGAA)、H4H2(CCTGGG)、H3H2(CCTGAG)、H3H1(CCTGAA)、H4H4(CCTTGG)、H3H4(CCTTAG)、H3H3(CCTTAA)、H2H6(CGGGGG)、H1H6(CGGGAG)、H1H5(CGGGAA)、H4H6(CGTGGG)、H3H6(CGTGAG)、H3H5(CGTGAA)、H4H8(CGTTGG)、H3H8(CGTTAG)、H3H7(CGTTAA)、H6H6(GGGGGG)、H5H6(GGGGAG)、H5H5(GGGAA)、H8H6(GGTGGG)、H7H6(GGTGAG)、H7H5(GGTGAA)、H8H8(GGTTGG)、H7H8(GGTTAG)、H7H7(GGTTAA)。
表6 CCL28基因单倍型组合频率
我们还证明了CCL28基因单倍型组合与奶牛乳腺炎抗性的相关
体细胞数(SCS)和乳腺炎之间的遗传相关从0.30到0.98，平均值为0.70，SCS与乳腺炎之间的高遗传相关使得SCS成为乳腺炎一个可行的遗传标记。人们通过功能基因多态性与SCS进行关联分析就可得到显著影响奶牛乳腺炎抗性的分子标记。
体细胞评分的测定：采集牛奶样40mL，加入重铬酸钾0.03g，轻轻混匀，然后送河南省奶牛生产性能测定中心(DHI)，用Foss 6000乳成分及体细胞联机分析系统FossMilkScan FT 6000和Fossmatic 5000测定体细胞数。根据公式SCS＝log2(SCC/100)+3，其中SCS-体细胞评分；SCC-体细胞数，单位千/mL，计算个体的体细胞评分。
最小二乘方差分析采用SAS 9.0(Statistical Analysis System)软件的ANOVA-Linear Models程序，建立下列模型，对体细胞评分与单倍型进行最小二乘分析和显著性检验，其模型为：
Yijkl＝μ+Gi+Ej+Sk+Pl+eijkl
公式中Yijkl为第i个个体表型的记录值，μ为群体平均值，Gi为第i个个体的基因效应值，Ej为环境效应值，Sk为季节的固定效应，Pl为胎次的固定效应，eijkl为随机位差。
在进行单倍型组合与体细胞评分的相关性分析中剔除掉样本数小于15的单倍型组合，结果显示，中国荷斯坦奶牛CCL28基因不同单倍型组合与体细胞评分间存在相关性，其中H3H3(AATTAA)单倍型组合体细胞评分极显著低于其他单倍型组合，P＜0.05，见表7，H2H2(AATTGG)为乳腺炎抗性组合。
表7 CCL28基因单倍型组合的体细胞评分的最小二乘均值及标准误
注：不同小写字母的平均值间差异极显著，P＜0.05。
由表7可知，具有CCL28基因H2H2单倍型组合的奶牛个体乳腺炎抗性显著高于具有其他单倍型组合的个体，P＜0.05。这在奶牛选育和品种改良上具有潜在的应用价值。通过对奶牛CCL28基因3个位点进行基因定型，若发现某个个体携带H3H3单倍型组合，则该个体与携带其他单倍型的个体相比期望有更优的乳腺炎抗性性状。据此，育种工作者可以指导牛的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。可见，奶牛CCL28基因单倍型组合在奶牛的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。
我们还进行了引物对比实验，引物对P1’(包括P1’-F和P1’-R)针对g.-601位点KpnⅠ单核苷酸多态位点设计，引物对P2’(包括P2’-F和P2’-R)针对g.72位点HindⅢ单核苷酸多态位点设计，引物对P3’(包括P3’-F和P3’-R)针对g.14819位点SacⅠ单核苷酸多态位点设计，P1’-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(与F1相同，为TATTCACAAAGCTGATCAGTGAC)，P1’-R核苷酸序列SEQ ID NO.7所示(CAGTTTCAACAAGCTACT)，P2’-F核苷酸序列SEQ ID NO.3所示(与F2相同，为ATCTTACAGACTCACCTCTGGCT)，P2’-R核苷酸序列SEQ ID NO.8所示(ACAGGAATATCAGTAATTTG)，P3’-F核苷酸序列SEQ ID NO.5所示(与F3相同，为CCAGAAGGCTTCTGGAAAGAGAC)，P3’-R核苷酸序列SEQ ID NO.9所示(TGATGCAGTGAAGGTGAAACGC)；对引物对P1’、P2’和P3’进行PCR扩增，引物对P1’与引物对P1、引物对P2’与引物对P2、引物对P3’与引物对P3的扩增条件相同；理论上，引物对P1’的扩增产物目的条带为276bp，引物对P2’的扩增产物目的条带为318bp，引物对P2’的扩增产物目的条带为300bp，但是我们将PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现P1’和P3’引物对扩增不出各自目的条带，参见图3A的P1’泳道和图3C的P3’泳道；P2’引物对在扩增出目的条带的同时还扩增出一条250bp左右的非特异性条带，参见图3B的P2’泳道(318bp和250bp两个条带)；因此引物对P1’、P2’和P3’不能用于后续检测，故将其舍去。
需要说明的是，当本发明给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒及RFLP方法及相关SNPs
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tattcacaaa gctgatcagt ggtac 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggacaaag gtggcaagt 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcttacaga ctcacctctg aagct 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgcctcttg gagatgaagg attga 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccagaaggct tctggaaaga gtcgac 26
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacgcacatt gtctggtgac taaaa 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagtttcaac aagctact 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acaggaatat cagtaatttg 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgatgcagtg aaggtgaaac gc 22

Claims (8)

1.一种检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，包括引物对P1、P2、P3，2×Taq PCR Masster Mix，灭菌超纯水，限制性内切酶Kpn Ⅰ、HindⅢ、Sal Ⅰ，10×QuickCut Buffer；引物对P1的上游引物F1序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R1序列如SEQ IDNO.2所示；引物对P2的上游引物F2序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物R2序列如SEQ IDNO.4所示；引物对P3的上游引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物R3序列如SEQ IDNO.6所示。
2.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，采集奶牛血样，提取并纯化奶牛基因组DNA
S2，设计合成扩增引物，PCR扩增反应
合成引物对P1、P2、P3；以S1得到的纯化后的基因组DNA为模板，分别以P1、P2、P3为引物对进行PCR扩增反应，分别得到相应的P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物；
S3，PCR产物酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
用限制性内切酶Kpn Ⅰ酶切P1引物的PCR产物，酶切后得到第g.-601位酶切产物；用限制性内切酶HindⅢ酶切P2引物的PCR产物，酶切后得到第g.72位酶切产物；用限制性内切酶Sal Ⅰ酶切P3引物的PCR产物，酶切后得到第g.14819位酶切产物；再分别对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳鉴定奶牛CCL28基因单核苷酸多态性位点的基因型。
3.一种利用权利要求2的RFLP方法检测出的奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的SNPs，其特征在于，所述SNPs是与奶牛的乳腺炎性状相关的奶牛CCL28基因第g.-601位、第g.72位和第g.14819位3个SNPs的基因型，且第g.-601位的SNP的基因型为GG、CC或者CG，第g.72位的SNP的基因型为GG、TT或者TG，第g.14819位的SNP的基因型为AA、GG或者AG。
4.根据权利要求3所检测出的奶牛CCL28基因单核苷酸多态性，其特征在于，奶牛CCL28基因第g.-601位多态性检测结果为：GG基因型表现为226bp和25bp的条带，CC基因型表现为251bp的条带，CG基因型表现为251bp、226bp和25bp的条带；
奶牛CCL28基因第g.72位多态性检测结果为：GG基因型表现为250bp和25bp的条带,TT基因型表现为的条带为275bp，TG基因型表现为275bp、250bp和25bp的条带；
奶牛CCL28基因第g.14819位多态性检测结果为：AA表现为300bp和25bp的条带,GG基因型表现为325bp的条带，AG基因型表现为325bp、300bp和25bp的条带。
5.根据权利要求2所述的检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于，S2中，引物对P1的PCR扩增反应体系25μL如下：2×Taq PCR MassterMix 12.5μL、灭菌超纯水9.5μL、10μmol/L上游引物F1 1μL、10μmol/L下游引物R1 1μL、50ng/μL DNA模板1μL；
引物对P2以及引物对P3的PCR扩增反应体系与引物对P1的PCR扩增反应体系相同，区别在于，引物对P2的PCR扩增反应体系采用的是上游引物F2和下游引物R2，引物对P3的PCR扩增反应体系采用的是上游引物F3和下游引物R3。
6.根据权利要求2所述的检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于，S2中，引物对P1以及引物对P3的PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，53.2℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
引物对P2的PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求2所述的检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于，引物对P1的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×Quick Cut Buffer1.5μL、1×Quick Cut酶Kpn Ⅰ 0.5μL；
引物对P2的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×Quick CutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶HindⅢ0.5μL；
引物对P3的PCR产物酶切体系为10μL：P1引物的PCR产物8μL、10×Quick CutBuffer1.5μL、1×Quick Cut酶Sal Ⅰ 0.5μL；
P1引物的PCR产物、P2引物的PCR产物、P3引物的PCR产物的酶切条件均为37℃消化30-60min。
8.根据权利要求2所述的检测奶牛CCL28基因单核苷酸多态性的RFLP方法，其特征在于，S3中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量浓度8％的聚丙烯酰胺凝胶。
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