CN106957915A - 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法 - Google Patents

苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106957915A
CN106957915A CN201710238279.0A CN201710238279A CN106957915A CN 106957915 A CN106957915 A CN 106957915A CN 201710238279 A CN201710238279 A CN 201710238279A CN 106957915 A CN106957915 A CN 106957915A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fungus
primer
apple tree
disease bacterium
canker disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710238279.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106957915B (zh
Inventor
王树桐
郭永斌
曹克强
胡同乐
王亚南
张凤巧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baoding Baiguoyou Agricultural Technology Co ltd
Original Assignee
Hebei Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Agricultural University filed Critical Hebei Agricultural University
Priority to CN201710238279.0A priority Critical patent/CN106957915B/zh
Publication of CN106957915A publication Critical patent/CN106957915A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106957915B publication Critical patent/CN106957915B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物，具有如下核苷酸序列：VE‑F：5’‑AATGAAGTCAGCATCGTTT‑3’，正向引物；VE‑R：5’‑GCTTATCAAGGGCTTATCT‑3’，反向引物。该引物具有良好的特异性，能够对苹果树/梨树腐烂病菌基因组DNA进行特异性扩增，无引物二聚体产生和非特异性扩增。本发明还利用上述引物建立了对苹果树/梨树腐烂病菌的实时荧光PCR定量检测方法。

Description

苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法
技术领域
本发明涉及真菌分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、包含此引物的试剂盒以及借助此引物实施的苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法。
背景技术
苹果树腐烂病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）可侵害苹果树的主枝、主干、果实等多个部位，造成苹果树腐烂病。该病在我国各主要苹果产区普遍发生且危害严重。苹果腐烂病菌具有潜伏侵染特性，说明病菌的分布要远远大于病害的流行区域，田间植株普遍带菌。梨树腐烂病菌主要危害梨树的主枝和侧枝，导致梨树势衰弱，果实产量和品质下降。有研究者从我国15个省市梨产区采集腐烂病样品，通过79份梨腐烂病菌纯化分离株的rDNA-ITS核苷酸序列分析，证明我国梨树腐烂病病原菌均为Valsa mali var. pyri，为苹果黑腐皮壳梨变种。有效而精确地检测苹果树腐烂病菌，对深入研究该病菌的致病机制及进行科学防治均有重要意义，而合适的苹果腐烂病菌的检测体系也有可能特异性地检测梨树腐烂病菌。
目前，对苹果树腐烂病菌的检测通常有普通PCR（聚合酶链反应）和巢氏PCR两种方法，普通PCR是通过特异引物对苹果腐烂病菌的DNA特异片段进行PCR扩增，然后使扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，通过条带的荧光强度来定性判断病菌的有无和多少。该方法的可靠性对引物的性能依赖较大，引物选择不好，易出现假阴性或假阳性，无法得出正确的判断。巢式PCR是一种变异PCR，使用两对（而非一对）引物扩增完整的片段，第一对引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，这就极大提高了该方法的特异性。但是该方法操作复杂，不易掌握。同时，上述两种方法还都存在只能通过荧光强度定性判断病菌数量，无法进行较为精确的定量，操作时间普遍较长，无法彻底避免致癌的荧光染色剂对人体的侵害等弊端。
实时荧光定量（Real-time fluorescence quantitative）PCR是近几年来新发展的一种 PCR 技术，它是一种在 PCR 反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 的进程，最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法。如发明专利CN102312015A公开了一种检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法，首先提取白条病菌的DNA，然后利用特异引物扩增特定的基因片段，再通过载体进行克隆，然后提取质粒，通过吸光度换算成拷贝数浓度，进行梯度稀释后进行实时荧光PCR扩增，绘制标准曲线，然后以待测样品的DNA进行同样的实时荧光PCR扩增，利用得到的Cq值结合标准曲线进行定量。将实时荧光定量PCR用于不同病菌的定量检测，需要解决与各病菌DNA适合的PCR引物及反应条件等问题，虽然有许多经验规则指导着引物设计，但这并非一个“照方抓药”的过程，而是充满了不确定性，生物反应的复杂性很容易使设计出的引物最终无法实现能达到检测目的的PCR扩增。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物，该引物具有良好的特异性，能够对苹果树/梨树腐烂病菌基因组DNA进行特异性扩增，无引物二聚体产生和非特异性扩增，能够用来对苹果树/梨树腐烂病菌进行效果良好的实时荧光PCR定量检测。
通过以下技术方案来实现上述目的：
一种苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物，其特征在于具有如下核苷酸序列：
VE-F：5’-AATGAAGTCAGCATCGTTT-3’，正向引物；
VE-R：5’-GCTTATCAAGGGCTTATCT-3’，反向引物。
同时，本发明还提供一种含有上述引物的用于检测苹果树/梨树腐烂病菌的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，该方法借助上述引物实现了对苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测，灵敏度高，操作简单，避免荧光染色剂对人体的侵害。
通过以下技术方案来实现上述目的：
一种苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（a）提取苹果树/梨树腐烂病菌的基因组DNA；
（b）以苹果树/梨树腐烂病菌的基因组DNA为模板，利用上述引物VE-F和VE-R进行PCR扩增，扩增产物经琼胶糖凝胶电泳之后切胶回收，与质粒载体连接后转化到感受态细胞进行克隆，挑选阳性克隆进行增菌培养，再用质粒小提试剂盒提取后测序鉴定，经鉴定正确的阳性重组质粒作为阳性重组质粒标准品。本步骤中所用的琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶的质量百分比浓度通常为1%。
（c）测定阳性重组质粒标准品的吸光度，并计算阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度，然后进行梯度稀释，以稀释后的各阳性重组质粒标准品为模板，分别利用所述引物VE-F和VE-R进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Cq值，以各拷贝数浓度的对数值和对应的Cq值绘制标准曲线。标准曲线以阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，以Cq值为纵坐标。本步骤中所用的阳性重组质粒标准品的OD260/OD280比值通常在1.8~2.0之间，此比值范围内的在1.8~2.0之间的阳性重组质粒标准品纯度高，制成的标准曲线能够更加准确的反应Cq值与起始模板拷贝数浓度的关系。
（d）提取待测样品的DNA，并以待测样品的DNA为模板，利用所述引物VE-F/VE-R进行实时荧光定量PCR扩增，获得Cq值，并将此Cq值与步骤（c）中的标准曲线进行比对得到对应的拷贝数浓度的对数值，此拷贝数浓度的对数值即可定量表示待测样品中苹果树/梨树腐烂病菌的数目。
上述实时荧光定量PCR采用Roche LihgtCycler 96实时荧光定量PCR仪进行。
优选的，所述步骤（b）中，所述的质粒载体为pUC19质粒载体，所用的感受态细胞为大肠杆菌Trans 1-T1。
优选的，所述步骤（c）中，所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度范围设置在1.0×107 copies/μL~1.0×100 copies/μL之间，梯度稀释的稀释倍数为10倍，10倍稀释梯度的阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和其进行荧光定量PCR反应的Cq值的散点坐标均匀，更易获得高相关系数的标准曲线；而且1.0×107 copies/μL-1.0×100 copies/μL的检测范围大，提高了供试材料病毒检测的广泛性。
优选的，在所述步骤（c）（d）中，所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：FastStart Essential DNA Green Master 10 μL；引物VE-F和VE-R各 0.5 μL；模板1.0 μL；ddH2O 补齐至20 μL。
优选的，在所述步骤（c）（d）中，所述实时荧光定量PCR扩增的程序为：95℃预变性300 s；95℃变性12 s；58℃退火12 s；72℃延伸14 s；共40个循环。该扩增程序下，扩增特异性好。
上述步骤（a）（d）中，可以利用CTAB法提取DNA：取表面消毒后的样品0.15 g置于2mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入700 μL提取液，65℃恒温水浴1 h后再加入700μL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1，轻颠混匀后12000 rpm离心15 min，取400 μL上清液加入新1.5 mL离心管中，再加入重量比为24:1的氯仿:异戊醇混合液和40 μLCTAB-NaCl，轻颠混匀后12000 rpm离心10 min，取300 μL上清液加入另一个1.5 mL离心管中，再加等量的冰冻异戊醇，轻颠混匀后12000 rpm离心10 min即得DNA沉淀，倒去上清，70%酒精洗涤2遍后，用滤纸条吸干残余酒精，晾干，加80 μL ddH2O，-4℃保存备用。
本发明中的引物VE-F和VE-R能够针对苹果树/梨树腐烂病菌基因组DNA 的EF-1α延伸因子基因序列进行特异性PCR扩增，且无引物二聚体产生和非特异性扩增，引物特异性良好。借助上述引物，建立了针对供试材料中的腐烂病菌的定量检测方法，并且检测结果可直接通过电脑软件读出，不需要凝胶电泳以及成像检测等操作，避免了环境污染以及EB对操作人员造成的身体危害。另外，该检测方法整个检测过程仅需1小时左右，具有节约时间以及灵敏度高的优点，与常规PCR技术对比，其灵敏度是巢氏PCR检测技术的378倍。
附图说明
图1为引物VE-F和VE-R特异性扩增的电泳图；
其中，M为marker（DL2000）；1-6 泳道的模板分别是苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、链格孢、木霉、层出镰刀菌、青霉；7泳道为ddH2O空白对照。
图2为本发明引物对苹果腐烂病菌实时荧光定量PCR扩增溶解曲线图；
图3为本发明方法对阳性重组质粒标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图4为与图3对应的实时荧光定量PCR标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述。
所用到的主要材料和仪器来源如下；
FastStart Essential DNA Green Master（2x conc.）、八联管购自Roche公司；EASYDilution、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；
LightCycler96实时荧光定量PCR仪为Roche公司产品；紫外分光光度仪为eppendorf公司产品；PCR仪为ABI公司产品。
苹果树腐烂病菌41由河北农业大学植物病害流行与综合防治实验室提供。
实施例1 引物设计与筛选
通过对比苹果腐烂病菌基因组DNA ITS区、β-微管蛋白基因、EF-1α延伸因子基因序列，设计13对引物，交由上海生工生物有限公司合成。通过特异性筛选，得到特异性引物对VE-F和VE-R，该引物对的特异性扩增效果如图1所示。由图可见，引物VE-F和VE-R对苹果树腐烂病菌能够扩增出清晰且单一的条带，产物长度125bp，经测序比对，其序列与苹果树腐烂病菌基因序列高度一致。对苹果轮纹病菌、链格孢、木霉、层出镰刀菌、青霉均未发现扩增条带。通过对引物VE-F和VE-R进行实时荧光定量PCR复筛，得到对不同浓度的苹果腐烂病菌基因组DNA的扩增溶解曲线，如图2所示，该曲线波峰高低与模板浓度呈正相关，且只有一个溶解峰，证明无引物二聚体产生和非特异性扩增，引物特异性良好。该实验得出引物VE-F和VE-R的扩增效率为99.5%。引物VE-F和VE-R的核苷酸序列如表1所示。
表1 引物序列
实施例2 苹果树腐烂病菌41 基因组DNA提取
用刀片轻轻刮掉PDA上刚刚长满平皿的苹果腐烂病菌41的菌丝，经过液氮冷冻研磨，采用CTAB法提取其DNA：取表面消毒后的样品0.15 g置于2 mL离心管中，在液氮中研磨至粉末状后加入700 μL提取液，65℃恒温水浴1 h后再加入700 μL酚:氯仿:异戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:异戊醇的重量比为25:24:1，轻颠混匀后12000 rpm离心15 min，取400 μL上清液加入新1.5 mL离心管中，再加入重量比为24:1的氯仿:异戊醇混合液和40 μLCTAB-NaCl，轻颠混匀后12000 rpm离心10 min，取300 μL上清液加入另一个1.5 mL离心管中，再加等量的冰冻异戊醇，轻颠混匀后12000 rpm离心10 min即得DNA沉淀，倒去上清，70%酒精洗涤2遍后，用滤纸条吸干残余酒精，晾干，加80 μL ddH2O，-4℃保存备用。
实施例3 阳性重组质粒标准品的获取
利用引物VE-F和VE-R对菌株41的DNA进行PCR扩增，产物经过质量百分比浓度为1%琼脂糖凝胶电泳之后，采用DNA凝胶回收试剂盒对目标片段特异性条带进行切胶回收，纯化后连接至pUC19载体上，并转化至大肠杆菌Trans 1-T1感受态细胞，挑取阳性克隆进行培养，用质粒小提试剂盒提取后测序鉴定。经过鉴定正确的重组质粒作为阳性重组质粒标准品。
实施例4标准曲线的制作
用紫外分光光度仪测定重组质粒的OD260/OD280和其浓度，OD260/OD280值在1.8~2.0的质粒用于制作标准曲线。根据质粒的相对分子质量将其质量浓度换算为拷贝数浓度：
copies/μL=(ng/μL×10-9) ×(6.02×l023)/(DNA length×660)
再用Easy Dilution将其依次进行10倍梯度稀释，得到1.0×107copies/μL-1.0×100copies/μL共8个浓度梯度，并以此为模板建立20μL扩增体系：
FastStart Essential DNA Green Master（2x conc.） 10μL
引物VE-F/VE-R（20μM） 各0.5μL
模板（8个梯度） 1.0μL
ddH2O 8μL
在LightCycler 96实时荧光定量PCR仪上按照下列反应程序进行扩增：95℃预变性300s；95℃变性12 s；58.0℃退火12 s；72℃延伸14 s。共40个循环。实验的扩增曲线和标准曲线如图3和图4所示。阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为x轴，反应的Cq值为y轴，两者呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.9987，标准曲线方程为y= -3.62x+36.11。
实施例5 苹果树待测样品中腐烂病菌的检测
在河北蠡县苹果苗圃采集一年生枝条，经过表面消毒后，将韧皮部剥离，采用CTAB法分别提取供试样品DNA，利用本发明实验例的方法进行检测，结果请参考表2 。阴性对照（苹果轮纹病菌）和空白对照（ddH2O）的结果均为阴性，苹果树腐烂病菌为阳性对照，阳性对照Cq值为18.61。检测发现，待测的十个样品中有七个样品带菌，且给出了相应的模板带菌量（即以阳性重组质粒模板数衡量）。其余三个样品未发现携带苹果树腐烂病菌。
实施例6 梨树待测样品中腐烂病菌的检测
通过组织分离方法从采自新疆库尔勒的香梨腐烂病材料中分离获得香梨腐烂病菌，通过其rDNA-ITS序列比对，确定其为苹果黑腐皮壳菌梨变种（Valsa mali var. pyri）。材料经过表明消毒后采用CTAB法提取DNA，利用本发明实验例的方法进行检测，可特异性的检测出梨腐烂病菌，其平均Cq值为26.58，平均模板病菌含量为5.01×103 copies/μL。
本发明基于EF-1α基因序列设计苹果树腐烂病菌特异性引物，成功建立了实时荧光定量PCR检测体系。本发明建立的实时荧光定量PCR检测体系可精确定量到26.4 fg/μL浓度的DNA，比现有的巢氏PCR体系10pg的检测精度高378倍。
上述实施例只是对本发明构思和实现的一个说明，并非对其进行限制，在本发明构思下，未经实质变换的技术方案仍然在保护范围内。
表2 一年生苹果枝条韧皮部检测结果
其中，“+”为阳性，“-”为阴性。
序列表
<110> 河北农业大学
<120>苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法
<160> 2
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
Aatgaagtcagcatcgttt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
gcttatcaagggcttatct 19

Claims (7)

1.一种苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物，其特征在于具有如下核苷酸序列：
VE-F：5’-AATGAAGTCAGCATCGTTT-3’；
VE-R：5’-GCTTATCAAGGGCTTATCT-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测苹果树/梨树腐烂病菌的试剂盒。
3.一种苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（a）提取苹果树/梨树腐烂病菌的基因组DNA；
（b）以苹果树/梨树腐烂病菌的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物VE-F和VE-R进行PCR扩增，扩增产物经琼胶糖凝胶电泳之后切胶回收，与质粒载体连接后转化到感受态细胞进行克隆，挑选阳性克隆，提取质粒并鉴定，获得阳性重组质粒标准品；
（c）测定阳性重组质粒标准品的吸光度，并计算阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度，然后进行梯度稀释，以稀释后的各阳性重组质粒标准品为模板，分别利用所述引物VE-F和VE-R进行实时荧光定量PCR扩增，获得相应的Cq值，以各拷贝数浓度的对数值和对应的Cq值绘制标准曲线；
（d）提取待测样品的DNA，并以待测样品的DNA为模板，利用所述引物VE-F和VE-R进行实时荧光定量PCR扩增，获得Cq值，并将此Cq值与步骤（c）中的标准曲线进行比对得到对应的拷贝数浓度的对数值，此拷贝数浓度的对数值即可定量表示待测样品中苹果树/梨树腐烂病菌的数目。
4.如权利要求3所述的苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（b）中，所述的质粒载体为pUC19质粒载体，所用的感受态细胞为E.coli Trans 1-T1。
5.如权利要求3所述的苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于， 所述步骤（c）中，阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度范围设置在1.0×107 copies/μL~1.0×100 copies/μL之间，所述梯度稀释的稀释倍数为10倍。
6.如权利要求3所述的苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于，在所述步骤（c）（d）中，实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：FastStart Essential DNA GreenMaster 10 μL；引物VE-F和VE-R各 0.5 μL；模板1.0 μL；ddH2O 补齐至20 μL。
7.如权利要求3所述的苹果树/梨树腐烂病菌的定量检测方法，其特征在于，在所述步骤（c）（d）中，实时荧光定量PCR扩增的程序为：95℃预变性300 s；95℃变性12 s；58℃退火12 s；72℃延伸14 s；共40个循环。
CN201710238279.0A 2017-04-13 2017-04-13 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法 Active CN106957915B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710238279.0A CN106957915B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710238279.0A CN106957915B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106957915A true CN106957915A (zh) 2017-07-18
CN106957915B CN106957915B (zh) 2020-09-29

Family

ID=59484508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710238279.0A Active CN106957915B (zh) 2017-04-13 2017-04-13 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106957915B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110819734A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 西北农林科技大学 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒
CN112980977A (zh) * 2021-03-19 2021-06-18 天水师范学院 苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561387A (zh) * 2015-02-02 2015-04-29 河北科技师范学院 一种苹果茎痘病毒实时荧光定量pcr检测方法
CN104962662A (zh) * 2015-07-29 2015-10-07 河北农业大学 一种以内标为基础的苹果锈果类病毒rt-pcr检测技术
WO2017018467A1 (ja) * 2015-07-27 2017-02-02 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
CN106554985A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 李保华 一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561387A (zh) * 2015-02-02 2015-04-29 河北科技师范学院 一种苹果茎痘病毒实时荧光定量pcr检测方法
WO2017018467A1 (ja) * 2015-07-27 2017-02-02 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
CN104962662A (zh) * 2015-07-29 2015-10-07 河北农业大学 一种以内标为基础的苹果锈果类病毒rt-pcr检测技术
CN106554985A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 李保华 一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGYING FAN ET AL.: "Study on Interactions between the Major Apple Valsa Canker Pathogen Valsa mali and Its Biocontrol Agent Saccharothrix yanglingensis Hhs.015 Using RT-qPCR", 《PLOS ONE》 *
臧睿: "中国苹果树腐烂病菌的种群组成、分子检测及其ISSR遗传分析", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110819734A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 西北农林科技大学 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒
CN110819734B (zh) * 2019-11-28 2023-02-28 西北农林科技大学 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒
CN112980977A (zh) * 2021-03-19 2021-06-18 天水师范学院 苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法
CN112980977B (zh) * 2021-03-19 2022-11-25 天水师范学院 苹果树枝干腐烂病的致病菌鉴别引物及患病程度分级方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106957915B (zh) 2020-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gibb et al. Studies on sweet potato little-leaf phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in Northern Australia
CN101643788B (zh) 马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法
CN102676664B (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN109868324A (zh) 一种特异性引物及其检测方法
CN108893557A (zh) 一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法
CN104946760B (zh) 一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒
CN106957915A (zh) 苹果树/梨树腐烂病菌的检测用引物、试剂盒及定量检测方法
CN106480227A (zh) 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN104830984B (zh) 瓜炭疽病菌的荧光pcr检测方法及所用引物和探针
CN105603067A (zh) 基于多重pcr快速鉴定我国外来入侵福寿螺的特异引物对及其应用
CN106086211A (zh) 检测荷花腐败病菌的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN103045747A (zh) 甘薯黑腐病菌分子检测引物及其应用
CN106350598B (zh) 用于柑橘黄龙病早期预警的pcr引物对，试剂盒及方法
CN104293957B (zh) 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
CN102312016A (zh) 一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量pcr方法
CN104388577A (zh) 一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒
CN104531904B (zh) 一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量pcr检测方法
CN110894536B (zh) 用于杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的定性、定量检测方法
CN110714093B (zh) 一种香蕉枯萎病抗性相关的scar分子标记及其检测方法和应用
CN107236827A (zh) 猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法
CN106701968A (zh) 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用
CN106755392B (zh) 藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法
CN102492773B (zh) 筛查16SrI组植原体的芯片及其应用
CN105039331A (zh) 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用
CN113430296B (zh) 一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211019

Address after: 071000 a1107, Huakang building, No. 899, Chaoyang North Street, Baoding City, Hebei Province

Patentee after: Baoding baiguoyou Agricultural Technology Co.,Ltd.

Address before: Yu Ling Temple Street 071001 No. 289 Hebei city of Baoding Province

Patentee before: HEIBEI AGRICULTURAL UNIVERSITY