CN106554985A - 一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法，涉及病菌的检测技术。本方法适合检测苹果或梨树枝条组织内是否潜伏有具有侵染活性的腐烂病菌，及病菌的潜伏部位，检测所使用的基本材料为苹果树或梨树健康枝条的皮层。具体方法为：将苹果或梨树组织的待检部位，切成0.1~10cm组织块，浸沾未冷凝的PDA后，接种到苹果或梨树枝条健康皮层的内面，在适宜的温湿下培养3~5天，观测皮层是否发病，依此推断待检材料中是否潜伏有具侵染性的腐烂病菌。本发明的优点在于：方法简便，容易操作，材料容易获得，结果准确可靠，克服组织分离法和分子生物学方法的缺陷，为腐烂病的研究和防治提供了一套简便可靠的检测技术。

Description

一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法

技术领域

本发明涉及腐烂病菌的活体检测技术，尤其适用检测苹果枝干、皮层等部位是否潜伏有具有侵染活性的腐烂病菌，以及腐烂病菌的潜伏部位。

背景技术

腐烂病是苹果和梨树的重要病害，主要造成死枝、死树和毁园。腐烂病是苹果树上的第一大病害，而且难于防治，被认为苹果树的“癌症”。自上世纪50年代，苹果树腐烂病在中国已大规模流行4次，几乎毁灭了新中国成立以来新栽植的所有苹果树，目前正面临第五次病害大流行的威胁。腐烂病也是梨树上的重要病害，在西洋梨、新疆库尔勒梨等感病品种上危害严重，常导致毁园。

腐烂病具有潜伏侵染现象。目前研究认为，腐烂病菌主要从剪锯口、伤口、皮孔、芽眼、枝干表层等部位侵染，病菌侵染后并不能马上致病，而是潜伏于伤口死组织、枝干表层死组织、木质部等部位，当树势衰弱，或者树体遭受冻害后，潜伏病菌才能扩展致病。病菌的潜伏侵染导致了腐烂病发病的不确定性，研究者难以根据病害的发生时间和发生程度推知病菌的侵染时间和侵染数量，从而制约腐烂病的研究与防治。目前，对腐烂病的侵染规律、发病与流行条件、病菌的致病机制等，认识还十分有限，更难以提出防治腐烂病的有效措施。因此，腐烂病的为害一直未得到有效控制。

潜伏腐烂病菌的检测是研究和认识腐烂病发生规律的关键。如果能够快速检测潜伏在寄主组织内的腐烂病菌，及其潜伏部位，就可以通过人工接种等方法研究病菌的侵染条件、侵染部位和致病条件，认识病菌潜伏原因和致病机制，评估杀菌剂对的防治效果，等等。

组织分离法是检测树体内潜伏腐烂病菌的主要技术。组织分离是切取待检测枝干组织，经表面消毒后转接至PDA（马铃薯+葡萄糖+琼脂）培养基中培养3~5天。若所分离组织内潜伏有活的腐烂病菌，PDA培养基中就有腐烂病菌的菌落产生。根据培养基中腐烂病菌菌落的有无，就可以判定待检测的组织中是否存在腐烂病菌。然而，组织分离方法污染率高，腐烂病菌的菌落难以辨认，从而影响了腐烂病菌检测的准确率。而且，组织分离方法需无菌操作，步骤繁琐，对仪器设备要求较高。

分子生物学检测也是目前检测腐烂病菌的另一种常规方法。分子生物学方法主要通过特异性探针，扩增寄主组织内腐烂病菌的DNA片段，根据扩增DNA片段的有无，判断寄主组织内是否存在腐烂病菌。由于寄主组织内病菌的DNA含量低，难以提取，检测结果可靠性差，从检测结中也无法判病菌是否具有侵染活性，而且分子生物学检测技术对仪器设备和操作人员的技术要求较高，在实际检测中难以应用。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一套快速检测苹果、梨树枝干内外是否潜带具有侵染活性的腐烂病菌，以及病菌潜伏部位的技术与方法，为腐烂病发病规律、流行条件、致病机制、药效评估和田间病菌检测等，提供一套快速而可靠的检测方法。

本发明采用的技术原理如下：腐烂病菌侵染苹果或梨树枝干皮层的活组织，很快致病，并表现典型的腐烂病症状。

本项发明采用的技术方案：切取待检测的寄主组织，在PDB（马铃薯+葡萄糖）浸泡或在未冷凝的PDA（马铃薯+葡萄糖+琼脂）浸沾后，直接接种健康苹果或梨树枝条皮层的内面，使待检测寄主组织紧密接触皮层活体组织，包扎后，置于相对湿度95%以上，温度为15℃~30℃的环境中培养3~5天。如果待检测组织内潜伏有腐烂病菌，接种皮层会发生腐烂病，表现典型的症状，并在皮层内面产生大量腐烂病菌的菌丝。根据接种皮层是否发病，可以判断被检测的寄主组织是否潜带具有侵染活性的腐烂病菌。

腐烂病菌生物学检测的具体步聚如下：

（1）取样及预处理：剪取苹果或梨树枝条，切取待检测的寄主组织，或直接从树体上剪取待竺检测的寄主组织。待检测组织可以是皮层、木质部，也可以是整个枝段，最小可以切成1mm见方的组织块，最大可以切成10cm长的枝段。将待检样品在PDB（马铃薯+葡萄糖）浸泡1~2小时，或浸沾未冷凝的PDA（马铃薯+葡萄糖+琼脂）后，备用；

（ 2 ）剥取苹果或梨枝条皮层：剪取苹果或梨树新鲜枝条，剪成5cm~20cm长的茎段，用小刀从枝段的一边切口，从切口沿形成层剥取完整健康皮层，备用；

（ 3 ）接种与培养：将预处理的待检样品，直接放到苹果或梨的皮层上，让待检测样品与枝条皮层的内面紧密接触，并用PE拉伸膜包紧；将接种并包扎好的材料，转入一个相对湿度大于95%保湿缸或保湿盒中，转入10℃~30℃的培养箱中培养3~5天；常用培养温度为20℃，相对湿度为100%，培养时间为5天；

（ 4 ）症状检查：培养时间结束，取出培养材料，用肉眼直接检查枝条皮层上是否有典型的腐烂病症状。典型的腐烂病的症状为，皮层内面红褐色、腐烂、变软、表面密生灰白色菌丝层、有酒糟味，腐烂斑超过待检材料外缘0.5cm以上。典型的腐烂病症状如图1所示。

本发明的优点在于：本检测方法简便，容易操作，所使用材料容易获得，不需要复杂的仪器设备，检测结果灵敏可靠，检测所需时间仅3~5天。克服了组织培养污染严重，杂菌干扰，分子生物学检测结果可靠性差，技术难以掌握等问题。

应用实例之一，腐烂病菌在不同龄期枝条木质部内扩展速度：2015年8月份，剪取当年生（当年新生长的枝条）、一年生和三年生富士苹果的枝条，剪成15cm的枝段，每个龄期的枝条10个枝段。剥除枝段表皮，将木质部在80℃的液体石蜡浸没5~10秒后取出。待石蜡凝固后，剪除上部0.5cm的茎段，用于接种腐烂病菌。取在PDA中生长3天的腐烂病菌，沿菌落边缘打取直径0.5cm的菌饼，接种到浸蜡枝段的剪口处，菌丝面对准枝条木质部中央，用PE拉伸膜包严，转入温度为25℃，相对湿度为75%的恒温箱中培养。7天后，取出培养枝段，自接种端开始，每隔1cm剪取一个茎段，共剪取10个茎段，对所剪取的茎段从上到下顺序编号。将茎段的基部在未冷凝的PDA中浸沾1分钟，用于接种皮层。剪取当年生、基部直径为0.5~1cm富士苹果的枝条，剪成3cm长的茎段，用小刀沿一侧切口，从切口处沿形成层剥取完整的皮层。把在PDA中浸沾过的茎段，直接接种到新剥取苹果枝条皮层的中央，让接种茎段基部紧贴皮层的内面，并用PE拉伸膜扎紧，每个茎段接种一个皮层。将接种皮层放入在直径15cm的培养皿中，用湿润滤纸保持100%的相对湿度，将培养皿密封后转入温度为20℃恒温箱中培养。5天后，取出培养皿，检查皮层是否出现腐烂病症状，根据皮层是否发病判断每一个接种茎段内是否潜伏有腐烂病菌，计算在7天的培养时间内，腐烂病在不同龄期枝条木质部内的生长扩展距离。结果表明，接种到不同龄期枝条木质部上的腐烂病菌经7天的培养，在当年生枝条的木质部内生长扩展最大距离为5cm，在一年生枝条内生长扩展最大距离也为5cm，而在三年生的枝条上生长扩展最大距离为4cm，如表1所示。

附图说明：图1用潜带有腐烂病菌茎段接种当年生富士苹果枝条的健康皮层，接种后在20℃，相对湿度为100%的环境中培养5天后，皮层发生腐烂病后的症状。

Claims (2)

1.一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法，其特征在于：可用于检测苹果或梨树枝条组织内是否潜伏有具有侵染活性的腐烂病菌，所使用的材料为苹果和梨树健康枝条的皮层，具体过程包括取样及预处理、剥取苹果和梨树枝条的皮层、接种与培养和症状观察四个步骤；

所述苹果树或梨树枝条为苹果或梨树上的任何枝条，包括生长枝条和枯死枝条，一年生枝条和多年生枝条，生长枝条和果苔枝，等等；

所述枝条组织为枝条上的任何组织，包括枝条表皮组织、周皮、皮孔、芽、芽眼、枝条皮层、韧皮部、木质部或整个枝段；

所述具有侵染活的腐烂病菌是指能够侵染苹果和梨树的健康皮层，并导致皮层发病的腐烂病菌；

所述苹果和梨树的健康枝条为任何粗度的苹果或梨树的枝条，但要求枝条的皮层健康无病，表面光滑，能够剥取完整皮层；

所述枝条皮层为从苹果和梨树枝条上剥取的皮层，厚度大于2mm，宽度大于1cm，长度大于3cm，具体大小需根据检测材料确定；

所述预处理是指把待检测的样品置于PDB（马铃薯+葡萄糖）浸泡1~2小时，或浸沾未冷凝的PDA（马铃薯+葡萄糖+琼脂），使待检测的样品上有腐烂病菌生长所需要的营养物质；

所述剥取皮层一般是先将枝条剪成3cm~20cm枝段，用刀片在枝段的一侧切口，然后从切口处沿形成层剥取完整的皮层；

所述接种是将预处理后的待检材料接种到苹果或梨树枝条年皮层上，使待检测材料与皮层紧密接触，用PE拉伸膜扎紧，让待检测材料中的病菌生长扩展至健康的皮层，使皮层发病；

所述培养是把将接种并包扎好的材料，转入一个相对湿度为95%以上培养皿、保湿缸或保湿盒中，转入10℃~30℃的培养箱中，培养3~5天；其中，常用的培养温度为20℃，培养湿度为100%，培养时间为5天；

所述症状观察是指检查接种后培养的皮层是否发生腐烂病，是否出现典型的腐烂病症状；

典型的腐烂病的症状为皮层内面红褐色、腐烂、变软、表面密生灰白色菌丝层、有酒糟味，腐烂斑超过待检材料外缘0.5cm以上。

2.权利要求1所述的一种快速检测树体内潜伏腐烂病菌的生物学方法，其特征是：腐烂病菌检测使用的基本培养基质为苹果树或梨树健康枝条的皮层，其中苹果枝条皮层更适合检测苹果树腐烂病菌，梨树枝条皮层更适合检测梨树腐烂病菌。