CN105754872A - 一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：1)从甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板置于20～30℃进行培养；2)待PDA培养基平板长出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养；3)将所述纯化的菌株在20～30℃条件下培养2～4d后，将菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，以PDA块作为空白对照，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，出现茎枝腐烂的现象确认为甘薯白绢病菌；4)接着对甘薯白绢病菌进行菌核培养，然后将菌核干燥并存放。本发明所述的方法，可实现甘薯白绢病菌的快速分离鉴定保存菌种过程简单，工作量小，效率高，保藏菌种易管理，保存的菌种存活时间长，可达4年以上。

Description

一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物的分离鉴定和保存技术领域，尤其涉及一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法。

背景技术

甘薯白绢病是由齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的，从甘薯育苗期至收获期均可能发生，发病田块甘薯产量损失达20％以上，严重者甚至绝收。甘薯储藏或销售时，白绢病菌常导致薯蒂和薯尾腐烂，影响甘薯的品质和商品性。现阶段甘薯白绢病的危害已成为甘薯产业的一个重要限制因素，对甘薯白绢病的发生规律，病原菌的生物学性状、对杀菌剂的敏感性和对甘薯的致病性等进行研究，寻找理想的防控方法成为甘薯产业防治病害的重中之重。

然而，开展病害所有研究的最基础最根本工作是病原菌的分离鉴定与保存，可靠的病原菌分离鉴定和保存技术是病害防控技术研究的保证。目前甘薯白绢病菌通常的分离步骤包括：首先用水将病样表面的泥沙冲洗干净，在室内晾干后，选择病样病健交界部位作为分离材料，在超净台用接种刀切成小块，经酒精或者升汞消毒后，用无菌水清洗2-3次后，用灭菌的镊子将切块放在PDA上置于25℃培养，待长出菌落后，对长出真菌进行纯化，纯化后还需要接种鉴定进行确认。作为常用的分离方法在病原菌的分离起到了极大的作用，然而通常存在，选取病健交界处材料具有一定不确定性，选择不好则分离不到病原菌；此外不同的材料所需消毒时间不同，消毒时间太长容易将病原菌杀死或者消毒时间太短分离后出现大量的细菌或其他真菌，导致分离不到病原菌或需要大量的纯化鉴定工作。因此，该分离方法需要有一定经验、步骤较多、存在分离不到病原菌的风险。

白绢病病原菌最常用的保存方法是将接种到PDA斜面上或者PDA培养基平板上白绢病菌放置在4℃冰箱进行低温保存，该保存方法简单有效，不需要特殊处理，但是一般只能保存2-3月，因此需要对白绢病菌不断重新转接培养保存。然而，多次转接培养保存易导致菌种的污染和致病性减弱，当菌种数量较多时，菌种保存的工作量较大，易造成菌种的错乱甚至丢失。因此，

有必要建立一种简单的快速分离和保存甘薯白绢病菌的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简单的快速分离鉴定和保存甘薯白绢病菌的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

1)在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝和/或菌核接种于PDA培养基平板，在20～30℃条件下进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯薯块或茎枝；

2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，然后将纯化的菌株培养8～12天，得到具有油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；

3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，以PDA培养基块作为空白对照，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。

优选的，步骤1)中所述的PDA培养基平板包括链霉素。

优选的，_步骤1)中所述PDA培养基平板中链霉素的终浓度为15～25mg/L。

优选的，链霉素是在步骤1)中所述的PDA培养基冷却至50～60℃间加入的。

优选的，所述的链霉素与PDA培养基的质量比为(0.05～0.2):100。

优选的，步骤3)中所述的菌丝块取自菌落边缘0～20mm范围内。

优选的，所述的菌丝块的直径为4～8mm。

优选的，步骤3)中所述的健康甘薯茎枝的长度为10～15cm，所述的健康甘薯茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内。

优选的，步骤3)中所述的接种是将菌丝块的有菌面贴住健康甘薯茎枝接种。

本发明还提供了一种保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

将甘薯白绢病菌转接到新的PDA培养基平板上，20～30℃培养至平板上长出棕褐色的菌核，在无菌条件下，收集棕褐色的菌核；菌核干燥后放入-30℃～-20℃保存。

本发明的有益效果：本发明所述的方法不需要进行酒精或升汞消毒，提高了病原菌分离效率，减少了有害物的处理；分离鉴定不需要特殊的仪器设备；鉴定速度快，接种两天内就可确认是否为致病白绢病。

本发明还提供了甘薯白绢病菌的保存方法，通过保存干燥的菌核可实现保存的菌种存活时间长，可达4年以上；本发明提供的保存方法工作量小，保藏菌种易管理。

附图说明

图1为本发明实施例1中甘薯白绢病菌培养3天的菌落状态；

图2为本发明实施例中甘薯白绢病菌培养10天的菌落状态。

具体实施方式

本发明提供了一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

1)在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板20～30℃进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯；

2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，然后将纯化的菌株培养8～12天，得到具有油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；

3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，以PDA培养基块作为空白对照，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。

本发明优选在分离鉴定甘薯白绢病菌之前制备PDA培养基，本发明中所述的PDA培养基为本领域技术人员所熟知的PDA培养基，本发明对此没有特殊的限制。本发明所述的PDA培养基优选的经过高温灭菌，所述的高温灭菌采用本领域所熟知的湿热高温灭菌即可，无其他特殊要求。

本发明优选在对PDA培养基高温灭菌后冷却，优选在所述冷却的过程中加入链霉素。优选的所述链霉素在PDA培养基冷却至50～60℃，更优选的在PDA培养基冷却至55℃时添加。在本发明中，所述PDA培养基中链霉素的

浓度优选的为15～25mg/L，更优选的为20mg/L；所述链霉素与PDA培养基的质量比优选的为(0.05～0.2):100，更优选的为0.1:100。

本发明在PDA培养基制备完成后，进行甘薯白绢病菌的分离：在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯，所述甘薯白绢病病样采集部位为甘薯植株茎叶或甘薯块根，本发明对于所述挑取菌丝的部位没有特殊要求，只要存在白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核即可，可为病健交界处也可以为病患部位。本发明对所述挑取菌丝和/或菌核采用的工具没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的接种针即可；本发明优选的使用消毒过的接种针进行挑取。

在本发明中，所述的甘薯白绢病菌的分离过程可在无菌的超净台中分离，也可直接在空气清洁静止的房间中进行分离。本发明优选的将病样中挑取的菌丝和/或菌核接种至PDA培养基平板上进行培养，所述培养的温度为20～30℃，优选的为25℃。

本发明在PDA培养基平板长出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养。在本发明中，所述纯化培养的温度优选的为20～30℃，更优选的为25℃；待所述纯化培养长出新的菌丝后，本发明重新挑取纯化培养得到的新的菌丝至新的PDA培养基再次进行纯化培养，多次重复挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上进行纯化培养，得到纯化的菌株；本发明中重复纯化的次数优选的为3～15次，更优选的为10次。本发明优选的通过观察重复传代的PDA培养基上菌落性状的一致性来判断菌株的纯化情况，若重复传代的PDA培养基上菌落性状一致，则可以确定为纯化的菌株，将纯化的菌株培养8～12天，能够观察到油菜籽状菌核的菌株即确定为纯化的疑似甘薯白绢病菌。

得到纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株后，本发明将所述纯化的菌株进行培养。在本发明中，所述培养的温度为20～30℃，优选的为25℃，所述培养的时间优选的为2～4d，更优选的为3d；

本发明从培养好的菌株中切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝。在本发明中，所述菌丝块优选使用打孔器切取，所述的菌丝块的直径优选的为0.4～0.8mm，更优选的为0.6mm；所述的菌丝块优选取自菌落边缘0～20mm

范围内，更优选为取自菌落边缘5～15mm范围内；

以同样大小的空白的PDA培养基块作为对照，分别将切取的菌丝块和空白PDA培养基块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。在本发明中，所述的健康甘薯茎枝的长度优选的为10～15cm，更优选的为12cm，所述的健康甘薯茎枝优选的平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内。本发明将菌丝块的有菌面贴住健康甘薯茎枝接种，空白的PDA培养基块贴住健康甘薯茎枝作为对照，在密封条件下进行培养；所述培养的温度为20～30℃，优选的为25℃；所述培养的时间优选的为1～3天，更优选的为2天；观察甘薯茎枝，出现茎枝腐烂的现象即可确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。

本发明所述的分离鉴定方法可实现甘薯白绢病菌的快速分离鉴定，无需特殊的仪器设备，对环境要求低。

本发明还提供了一种保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

将甘薯白绢病菌转接到新的PDA培养基平板上，20～30℃培养至平板上长出棕褐色的菌核，在无菌条件下，收集棕褐色的菌核；菌核干燥后放入-30℃～20℃保存。

在本发明中转接到新的PDA培养基平板上的甘薯白绢病菌优选的是经过本发明上述技术方案所述的分离鉴定过程得到的甘薯白绢病菌，在本发明中优选的将接种致病的菌株转接到新的PDA培养基平板上，置于20～30℃培养至平板上长出棕褐色的菌核。在无菌条件下，用镊子夹取棕褐色的菌核，收集到无菌的保存管内进行干燥，本发明所述的保存管为本领域常用的无菌保存管；

本发明中所述的干燥优选的将装有菌核的保存管放置硅胶干燥器中进行，所述干燥的时间优选的为1～4天，更优选的为2～3天，在干燥过程中装有菌核的保存管的盖子优选的为半紧状态；

本发明在菌核干燥完成后将保存管的盖子拧至全紧，放于-30℃～-20℃保存，更优选的将保存管放于-25℃。

本发明所述的甘薯白绢病菌的保存方法快速高效，保存的菌种存活时间长。

下面结合实施例对本发明提供的快速分离鉴定与保藏甘薯白绢病菌的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

2011年3月从广东省农科院白云基地甘薯育苗地采集了典型的甘薯白绢病病样，薯苗萎蔫、茎基部地表有大量的白色至棕褐色的油菜籽状菌核，挖起种薯薯块上布满白色菌丝和白色至棕褐色的菌核；按照常规方法配制PDA培养基平板，冷却至60℃加入PDA培养基1/1000质量的链霉素。

在超净台，用消毒的接种针挑取菌丝或者用消毒的镊子夹取菌核到PDA培养基平板上，置于25℃光照培养箱培养，2天后，菌核长出白色菌丝，如图1所示，挑取的菌丝在培养两天后即长出大量新的菌丝，在白色菌丝的边缘用接种针挑取带菌丝的培养基块，放入新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，观察到20个菌株能够产生油菜籽状菌核。

将纯化的20个菌株在25℃培养3d后，用打孔器在菌落边缘15mm打取直径0.6mm的菌丝块作为接种体。将长12cm的健康甘薯茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，将菌丝块菌面贴住茎枝接种，以PDA块作为空白对照，接种后将塑料盒盖好密封，置于25℃室内培养，2天后有15个菌株茎枝腐烂，确认为致病白绢病菌。

实施例2

2011年12月从广东省农科院白云基地甘薯品质比较试验田采集了典型的甘薯白绢病病样，收获的甘薯薯块上布满白色菌丝和白色至棕褐色的菌核；按照常规方法配制PDA培养基平板，冷却至50℃间加入1/1000的链霉素。

在超净台，用消毒的接种针挑取菌丝或者用消毒的镊子夹取菌核到PDA培养基平板上，置于25℃光照培养箱培养，3天后，菌核长出白色菌丝，在白色菌丝的边缘用接种针挑取带菌丝的培养基块，放入新的PDA培养基平板上，进行纯化，观察到15个菌株能够产生油菜籽状菌核。

将纯化的15个菌株25℃培养3d后，用打孔器在菌落边缘10mm打取直径0.5mm的菌丝块作为接种体。将长10cm的健康甘薯茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内，将菌丝块菌面贴住茎枝接种，以PDA块作为空白对照，接种后将塑料盒盖好密封，置于28℃室内培养，2天后有12个

菌株茎枝腐烂，确认为致病白绢病菌。

实施例3

将实施例1中确认的致病的15个菌株接种到新的PDA培养基平板上，置于25℃培养10天至平板上长出成熟的棕褐色的菌核，如图2所示，然后在超净台条件下，用镊子挑取棕褐色的菌核，集中到无菌的保存管内；将装有菌核的保存管拧至半紧状态，放置在硅胶干燥器中干燥3天后，将保存管的盖拧紧，直接放入-20℃保存，保存时间为2011年8月。2015年10月将保存在-20℃的菌株保存管取出，在无菌条件下，用灭菌的镊子夹取菌核放置PDA培养基平板上，2天即可长出新的菌落。

实施例4

将实施例2中确认的致病的12个菌株接种到新的PDA培养基平板上，置于25℃培养12天至平板上长出成熟的棕褐色的菌核，然后在超净台条件下，用镊子挑取棕褐色的菌核，集中到无菌的保存管内；将装有菌核的保存管拧至半紧状态，放置在硅胶干燥器中干燥2天后，将保存管的盖拧紧，直接放入-25℃保存，保存时间为2012年1月。2016年1月将保存在-25的菌株保存管取出，在无菌条件下，用灭菌的镊子夹取菌核放置PDA培养基平板上，2天即可长出新的菌落。

由以上实施例可知，本发明所述的分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，可实现甘薯白绢病菌的快速分离鉴定，不需要特殊的仪器设备；鉴定速度快，菌种保存安全，接种两天内就可确认是否为致病白绢病；本发明所述的甘薯白绢病菌的保存方法保存菌种过程简单，工作量小，保藏菌种易管理，保存的菌种存活时间长，可达4年以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

1)从甘薯白绢病的病样中挑取菌丝和/或菌核接种于PDA培养基平板，在20～30℃条件下进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯薯块或茎枝；

2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，将所述纯化的菌株培养8～12天，得到具油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；

3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，以PDA培养基块，作为空白对照，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。

2.根据权利要求1所述快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，其特征在于：步骤1)中所述的PDA培养基平板包括链霉素。

3.根据权利要求2所述的快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，其特征在于：步骤1)中所述PDA培养基平板中链霉素的浓度为15～25mg/L。

4.根据权利要求2所述的快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，其特征在于：链霉素是在PDA培养基灭菌后冷却至50～60℃间加入的。

5.根据权利要求2所述的甘薯白绢病菌的快速分离与保存的方法，其特征在于：所述的链霉素与PDA培养基的质量比为(0.05～0.2):100。

6.根据权利要求1所述的甘薯白绢病菌的快速分离与保存的方法，其特征在于：步骤3)中所述的菌丝块取自菌落边缘0～20mm范围内。

7.根据权利要求6所述的甘薯白绢病菌的快速分离与保存的方法，其特征在于：所述的菌丝块的直径为4～8mm。

8.根据权利要求1所述的甘薯白绢病菌的快速分离与保存的方法，其特征在于：步骤3)中所述的健康甘薯茎枝的长度为10～15cm，所述的健康甘薯茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内。

9.根据权利要求1所述的甘薯白绢病菌的快速分离与保存的方法，其特征在于：步骤3)中所述的接种是将菌丝块的有菌面贴住健康甘薯茎枝接种。

10.一种保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：

将甘薯白绢病菌转接到新的PDA培养基平板上，20～30℃培养至平板上长出棕褐色的菌核；

在无菌条件下，将所述棕褐色的菌核干燥后在-30℃～-20℃温度下保存。