CN109868324A - 一种特异性引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一对用于检测胡萝卜果胶杆菌Pco亚种的引物及其检测方法，所述引物对包括上游引物srlE‑F1：5’‑TGACTGTGGTGGAACACTTCG‑3’和下游引物，srlE‑R1：5’‑CAGCCAGTGATAAACCAACCG‑3’，在所述引物基础上建立胡萝卜果胶杆菌种内P.carotovorum subsp.odoriferum亚种的检测方法。本发明所提供的引物及方法对胡萝卜果胶杆菌P.carotovorum subsp.odoriferum亚种进行检测具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，为田间蔬菜软腐病的早期诊断和病菌的监测技术发展奠定基础。

Description

一种特异性引物及其检测方法

技术领域

本发明属于植物保护领域，具体涉及从感病植物分离的软腐病原菌株的鉴定快速、灵敏和 特异的分子鉴定属于农作物病害病原微生物检测领域，更具体涉及植物细菌性软腐病原菌特异 性检测引物及其检测方法。

背景技术

胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum，Pc)是自然条件下普遍存在、寄主范围和地 理分布广泛的植物软腐病原菌(Ma B,Hibbing ME,Kim HS,et al.Host rangeand molecular phylogenies of the soft rot enterobacterial generaPectobacterium and Dickeya.Phytopathology. 2007；97(9):1150-1163.)。该病原菌在田间和贮藏过程中均可侵染植物，造成严重经济损失，被 列为世界范围内十大重要植物病原细菌之一(Davidsson PR,Kariola T,Niemi O,et al. Pathogenicity of and plantimmunity to soft rot pectobacteria.Front Plant Sci.2013；4:191；Mansfield J,Genin S,Magori S,et al.Top 10plant pathogenic bacteria in molecular plantpathology.Mol Plant Pathol.2012；13(6):614-629.)。P.carotovorum目前包含3个确定的亚种：P.carotovorum subsp. carotovorum(Pcc)、P.carotovorum subsp.odoriferum(Pco)和P.carotovorum subsp.brasiliensis (Pcb)(Nabhan S,de Boer SH,Maiss E,etal.Taxonomic relatedness between Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum,Pectobacterium carotovorum subsp.odoriferum andPectobacterium carotovorum subsp.brasiliense subsp.nov.J Appl Microbiol.2012；113(4):904-913)。其中，Pcc和 Pcb亚种因其对重要粮食作物马铃薯的危害性而一直被广泛关注和研究；Pco亚种最初报道仅能 侵染引起法国菊苣软腐病(Gallois A,Samson R,Ageron E,et al.Erwinia carotovora subsp. odorifera subsp.nov.,associated withodorous soft rot of chicory(Cichoriumintybus L.).Int J Syst Bacteriol.1992；42(4):582-588)，然而随着细菌系统分类研究的不断深入和诊断技术的发展，关于 Pco亚种菌株生态分布报道逐渐增多，目前Pco已知的天然寄主不仅包括芹菜、大白菜、卷心菜、 甜菜、韭菜、洋蓟和马铃薯等日常蔬菜作物，还包括风信子等具有重要经济价值的观赏植物(Waleron M,Waleron K,Lojkowska E.Characterization of Pectobacteriumcarotovorum subsp. odoriferum causing soft rot of stored vegetables.Eur JPlant Pathol.2014；139(3):457-469；Oskiera M, M,Kowalska B,etal.Pectobacterium carotovorum subsp.odoriferum on cabbage and Chinesecabbage:identification,characterization and taxonomic relatedness ofbacterial soft rot causal agents.J Plant Pathol.2017；99(1):149-160)。在我国，胡萝卜果胶杆菌Pco亚种已成为引发蔬菜细 菌性软腐病的重要病原菌(田宇,马亚丽,何付新,等.北京地区芹菜细菌性软腐病菌鉴定及其 致病力分析.植物病理学报.2016；46(4):433-442)，而随着设施种植模式的快速推广，该病原菌引 发的蔬菜细菌性软腐病发生日益频繁，严重制约了我国设施蔬菜产业的健康发展。

随着分子生物学技术的发展，应用聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)扩 增技术对植物病原菌进行特异、灵敏的快速分子鉴定的成功例子已越来越多。胡萝卜果胶杆菌 Pc传统的分类鉴定主要基于形态学、生理生化特征及致病性测定等，这种鉴定方法耗时较长、 程序繁琐、准确性低，而且还要求鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，难以满足病原菌鉴 定中快速、准确、稳定的检测要求；而基于分子生物学的基因序列分析，如鉴定细菌鉴定中常 用的16S rDNA序列BLAST分析，虽然可将Pc快速鉴定到种水平，但序列的高度保守性使其 无法在不同亚种间进行区分；其他分子鉴定方法包括基于pmrA完整基因序列的系统进化树分 析、ITS-RELP、多位点序列分析MLSA等虽可以将Pc进一步鉴定至亚种水平，但操作过程复 杂、耗时较长，成本较高，且对操作人员存在一定技术要求。相比之下，特异性引物PCR只要 求工作者有简单的分子操作技能，同时还兼具特异、灵敏、快速、简便、准确、易自动化等突 出的优点，现已被广泛应用并逐渐发展成为亚种水平上有效鉴定植物病原菌的主要手段。

国外已有研究人员利用细菌16S-23S基因间隔区基因为病原菌检测靶标，开发出了Pcb的 特异性检测引物BR1f/L1r(Duarte V,de Boer SH,Ward LJ,etal.Characterization of atypical Erwinia carotovora strains causing blacklegof potato in Brazil.J Applied Microbiology. 2004；96(3):535-545)，是目前国际上普遍认可和广泛使用的果胶杆菌属亚种特异性引物。此前也 报道了Pcc亚种特异性引物EXPCCF/EXPCCR(Kang HW,Kwon SW,Go SJ.PCR-based specific and sensitivedetection of Pectobacterium carotovorum ssp.carotovorum by primers generatedfrom a URP-PCR fingerprinting-derived polymorphic band.Plant Pathol.2003；52(2):127-133)，但随后研究 发现该引物不能鉴定出所有的Pcc亚种菌株(de Boer SH,LiX,Ward LJ.Pectobacterium spp. associated with bacterial stem rot syndrome ofpotato in Canada.Phytopathology. 2012；102(10):937-947)，也无法排除其他亚种菌株(田宇等，2016)。因此，Pcc特异性引物在 亚种特异性上仍具有局限性。目前，尚无有关Pco亚种特异性引物的报道。本发明通过前期对 2018年7月NCBI公布的来源于不同国家不同寄主的53个Pc亚种(9Pcc，29Pcb和15Pco) 基因组序列进行比较分析，获得了Pco特有的磷酸葡糖糖转移酶系统(phosphotransferase system， PTS)山梨醇转运蛋白亚基IIB编辑基因srlE序列(Xiaoying Li,Yali Ma,Shuqing Liang et al. Comparative genomics of 84Pectobacterium genomes reveals the variations related to a pathogeniclifestyle.BMC Genomics.2018；19:889)，但尚没有找到合适的检测引物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中对胡萝卜果胶杆菌Pc不同亚种检测和鉴定主要基于生理生 化和常规分子生物学特征，如ITS-RFLP，MLSA多位点序列分析，方法耗时长、程序繁琐、经 验性强，难以做到对病原菌进行快速有效鉴定，病害发生时及时监测和控制病原菌的传播、流 行的问题，提供了一种胡萝卜果胶杆菌Pco亚种特异性检测引物及其检测方法，利用本发明所 述的检测引物和检测方法可简单快速将胡萝卜果胶杆菌Pc中的Pco菌株检测出来，准确性高、 特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。

为实现上述目的，发明人通过试验前期对NCBI公布的Pc基因组序列(9Pcc，29Pcb和 15Pco)进行比较分析，通过大量筛选获得了Pco特有的磷酸葡糖糖转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)山梨醇转运蛋白亚基IIB编辑基因srlE序列，并以此为靶标， 设计和筛选对Pco具有特异性扩增作用的引物。本发明获得的引物可对胡萝卜果胶杆菌Pc中的 Pco亚种菌株特异性扩增出大小为674bp的产物片段，但无法在其他亚种(即Pcc和Pcb)菌 株中扩增出目标产物片段。

因而，本发明提供一种胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P.carotovorumsubsp.odoriferum)特异性的 分子检测引物，其特征在于：引物序列为：

上游引物srlE-F1：5’-TGACTGTGGTGGAACACTTCG-3’，

下游引物srlE-R1：5’-CAGCCAGTGATAAACCAACCG-3’。

同时，本发明还提供一种检测胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P.carotovorumsubsp.odoriferum)的 方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)提取待测生物样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对所述扩增的产物进行鉴定，如果能特异性地扩增出674bp的产物，即可判断所检的 病原菌株为P.carotovorum subsp.odoriferum。

其中，所述的扩增的反应体系以20μL计，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L 所述引物各1μL，待测生物样品基因组DNA 1μL，用无菌水补足至20μL。

优选地，所述的扩增参数为95℃预变性5min，95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸 1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

本发明中对所述扩增的产物进行鉴定的方法可以已知的方法，其中以琼脂糖凝胶电泳法为 便捷。

进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳法具体为：取5μL所述的扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行 电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40min后经GoldView染色于紫外定下观察，根据扩增产物 的有无及其片段大小对结果进行判断。

本发明适用分析的待测生物样品选自培养的细菌系，待测作物发病部分收集的细菌样品、 或胡萝卜果胶杆菌侵染后发病的植物软腐组织样品。

此外，本发明提供上述方法配套的检测胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P.carotovorumsubsp. odoriferum)的试剂盒，其特征在于，其包括如上所述的引物对。任选地，还包括用于PCR扩增 的试剂，进一步还可包括用于提取待测生物样品基因组DNA的试剂。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1、利用生物信息和生物学方法，通过大量的设计和筛选等工作，得到了在胡萝卜果胶杆菌 Pc内Pco亚种菌株特有且高度保守的磷酸葡糖糖转移酶系统(phosphotransferase system，PTS) 山梨醇转运蛋白亚基IIB编辑基因srlE，本发明在此基础上,基于该基因序列设计和筛选出一对 Pco具有特异扩增作用的引物，能准确的从胡萝卜果胶杆菌Pc不同亚种菌株中识别出Pco菌株， 且扩增得到的Pco菌株条带清晰，无杂带，可见本发明提供的引物特异性好，可对Pco菌株进 行准确地鉴定。

2、本发明对前期发表的，来源于北京市不同郊区县、不同寄主来源的117胡萝卜果胶杆菌 菌株(包括41Pco，28Pcc和48Pcb菌株)进行了亚种特异性引物特异性测试，结果显示有且 只有Pco菌株能特异性地扩增出大小一致的目的电泳条带，且所检测的41株Pco均扩增出大小 一致的目的电泳条带，检出率100％。说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性，可 快速、准确、简单地将病原菌株鉴定至Pco亚种水平，为软腐病原菌亚种的快速鉴定提供有效 手段，且成本低，检测方便，检测效果显著，在生产上有广泛的应用价值。

3、本发明设计的Pco特异性引物，灵敏性高，对Pco病菌的检测灵敏度在水平上可达到 10pg/μL。

4、本发明设计的Pco特异性引物实用性好，可用于蔬菜软腐病原菌的快速鉴定，具有重要 的实际应用价值。传统的软腐病原菌的检测方法一般是将病样上的病原菌进行分离、纯化，且 病原菌鉴定至亚种水平还需进行多基因序列克隆、测序及联合构建系统发育树等一系列繁琐的 过程，所需时间较长、成本较高，给快速而精确地检测病原物增加了难度。本发明可在携带Pco 病菌的蔬菜软腐组织中特异性地扩增出预期大小的电泳条带，说明本发明可为生产上蔬菜软腐 病的早期诊断、预防和病原菌的监测奠定基础，进而为病害防治策略的早期制定提供科学依据， 具有较好的实用性。

5、应用本发明方法，对待测样品基因组进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判 定结果，整个检测过程采用快速提取方法，操作简单，大大缩短了检测时间和成本，一般整个 检测过程可在5小时内完成。

附图说明

图1为12对引物的检测结果，其中，图1A为引物对srlA-F1/srlA-R1、srlA-F2/srlA-R2、srlE-F1/ srlE-R1、srlE-F2/srlE-R2的检测结果；图1B为引物对srlB-F1/srlB-R1、srlB-F2/srlB-R2、srlD-F1/srlD-R1、 srlD-F2/srlD-R2的检测结果；图1C为引物对srlM-F1/srlM-R1、srlM-F2/srlM-R2、srlR-F1/srlR-R1、 srlR-F2/srlR-R2的检测结果。

图2为本发明对采自北京不同郊区县、不同寄主来源的117胡萝卜果胶杆菌菌株特异性验 证结果图。图2-a为41株Pco菌株特异性验证结果图，图中泳道M为DL2000分子量标准，泳 道1-41为已报道的Pco菌株，泳道42为阳性对照(参考菌株Pco BCS7)，泳道43为阴性对照； 图2-b为28株Pcc菌株特异性验证结果图，图中泳道M为DL2000分子量标准，泳道1-28为 已报道的Pcc菌株，泳道29为阳性对照，泳道30为阴性对照；图2-c为48株Pcb菌株特异性验证结果图，图中泳道M为DL 2000分子量标准，泳道1-48为已报道的Pcb菌株，泳道49为 阳性对照，泳道50为阴性对照。

图3为本发明以Pco亚种参考菌株BCS7的DNA为模板的灵敏性检测扩增结果图，图中： 泳道M为DL2000分子量标准，泳道1为100ng/μL，泳道2为10ng/μL，泳道3为1ng/μL， 泳道4为100pg/μL，泳道5为10pg/μL，泳道6为1pg/μL，泳道7为100fg/μL，泳道8为10fg/μL， 泳道9为1fg/μL，泳道10为以ddH₂O为模板的阴性对照。

图4为本发明对发病白菜组织的PCR检测结果图，图中泳道M为DL2000分子量标准，泳 道1-5为受Pco侵染后发病的不同白菜植株，泳道6-7为不同的健康植株，泳道8为以Pco参考 菌株BCS7的DNA为模板阳性对照，泳道9为以ddH₂O为模板的阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实质并不限于下述实施例。

本发明使用的已发表117胡萝卜果胶杆菌株均为北京农业生物技术研究中心，农业基因资 源与生物技术北京市重点实验室保存。

采用细菌提取试剂盒(购买自北京天根公司)提取细菌基因组DNA，利用离心柱型植物基 因组提取试剂盒(购买自北京天根公司)由发病植株组织提取总DNA，提取DNA保存于-20℃ 备用。以上所提取的DNA样品经NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)测定 合格(OD260/OD280值处于1.8～2.0之间，DNA浓度处于200～400ng/μL之间)，可用于后续试 验；DNA Marker购自北京博迈德生物技术有限公司；引物由北京三博远志生物技术有限公司合 成；Premix Taq Version 2.0购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例1引物的设计与合成

本实施例提供引物设计和筛选过程。srl操纵子的详细信息首次报道于大肠杆菌，参与山梨 醇的利用和代谢；其后在梨火疫病原菌Erwinia amylovora也发现了该操纵子，且与病原菌的致 病性相关(Aldridge P,Metzger M,Geider K.Genetics of sorbitolmetabolism in Erwinia amylovora and its influence on bacterial virulence.MolGenet Genomics.1997；256:611-619)。该操纵子由六个 基因组成(srlAEBDMR)。由于有且只有Pco菌株具有srl操纵子，该该操纵子由六个基因组成。 由于并不清楚到底其中哪个基因能够设计出特异性引物，因此发明人分别根据这六个基因的序 列，每个基因设计2对序列不同的引物，共设计12对引物(表1，按顺序分别为SEQ ID NO:1 至24)；所有引物均由在线设计软件Oligo Calc:Oligonucleotide Properties Calculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)设计，且通过NCBI的Blast验证了所有引 物的特异性(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。

表1

利用本试验室前期收集、鉴定的不同地理来源和寄主的117株胡萝卜果胶杆菌(41株Pco，48株Pcb和28株Pcc菌株)(田宇等，2016；胡娜娜等，2015；Li et al，2018；李晓颖等，2018) (表4)，对上述12对引物进行特异性验证，PCR反应体系20μL，包括2×Taq PCRMaster Mix 10μL，10μmol/L上下游引物各1μL，菌株基因组DNA 1μL，用无菌超纯水补足至20μL；不 同引物的退火温度见表3。

分别取5μL上述扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40min 后经GoldView染色于紫外定下观察。除srlE-F1/srlE-R1可在所有Pco菌株中特异性扩增出清晰 得目的条带，且在其他菌株中无法扩增出条带，满足条件外，其他11对引物表现为非特异性扩 增或特异但条带不单一或特异但检出率未达100％。12对引物的检测结果如图1。

从图1可知：

srlA-F1/srlA-R1：Pcb、Pcc未扩增出条带，大部分Pco菌株扩增出一条非目的大小的条带， 少部分Pco菌未扩增出条带。

srlA-F2/srlA-R2：Pcc菌株未扩增出目的条带，3株Pcb菌株可扩增出目标条带，1株Pco 菌株未扩增出目标条带。

srlE-F1/srlE-R1：所有Pcb菌株和Pcc菌株均无法扩增出目标条带，所有Pco菌株均可扩 增出大小一致的目的条带，故该对引物符合要求，留作后续进一步研究。

srlE-F2/srlE-R2：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带。

srlB-F1/srlB-R1：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlB-F2/srlB-R2：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株扩 增出非特异性条带。

srlD-F1/srlD-R1：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlD-F2/srlD-R2：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlM-F1/srlM-R1：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlM-F2/srlM-R2：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，2株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlR-F1/srlR-R1：部分Pcb和Pcc菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌株未 扩增出目标条带。

srlR-F2/srlR-R2：部分Pcb、Pcc和Pco菌株扩增出目的条带和非特异性条带，1株Pco菌 株未扩增出目标条带。

结果：从12对引物中，选择出一对特异性最好的引物srlE-F1/srlE-R1，可在所有的Pco 菌株中特异性地扩增出大小一致的目的电泳条带(674bp)，且条带清晰，检出率100％；而所有 的Pcb和Pcc菌株中均无法扩增出目的条带，说明引物srlE-F1/srlE-R1具有很强的特异性和准 确性，可快速、准确、简单地将Pc病原菌株中的Pco菌株筛选出来。

实施例2

根据实施例1可知，发明人针对菌种胡萝卜果胶杆菌亚种Pco菌株特有且高度保守的srlE 基因，利用引物在线设计软件Oligo Calc:Oligonucleotide PropertiesCalculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)，设计出对Pco菌具有特异性强且灵敏性 高的一对特异性引物srlE-F1/srlE-R1，该上下游引物的Tm为60.47℃，59.53℃，GC含量均为 52.38％。本实施例是对该引物的亚种水平特异性检测进行验证。

使用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自北京天根公司)，提取以下各菌种的DNA。 利用表2中已发表的采自北京市不同郊区县和寄主的117株胡萝卜果胶杆菌(41株Pco，48株Pcb 和28株Pcc菌株)(田宇,马亚丽,何付新,等.北京地区芹菜细菌性软腐病菌鉴定及其致病力分 析.植物病理学报.2016；46(4):433-442)；胡娜娜,李超,王茜等.北京地区油菜软腐病病原菌的 鉴定.微生物学报.2015；55(10):1253-1263；李晓颖,田宇,赵亮,等.京郊快菜细菌性软腐病病原 鉴定.华北农学报.2018；33(3):63-70.Xiaoying Li,Yali Ma,Shuqing Liang et al.Comparative genomics of 84 Pectobacterium genomesreveals the variations related to a pathogenic lifestyle.BMC Genomics.2018；19:889)，对该特异性引物进行特异性验证，PCR扩增体系和反应条件同上。得 到如图2所示的电泳图。测试结果表明使用该引物进行胡萝卜果胶杆菌Pco亚种结果准确性高； 其中已发表的41株Pco菌株DNA的检测率为100％，其他48株Pcb和28Pcc菌株DNA未检出率也为100％。综上所述，该特异性引物检出胡萝卜果胶杆菌Pco亚种检测结果的准确率达到100％。本 发明设计的引物不仅可以将Pco与其它胡萝卜果胶杆菌亚种菌株区分开来，还在不同来源地、不 同寄主植物上的Pco菌株均可以得到大小相近的目的条带，说明该引物可以作为Pc种内Pco亚种 分子检测的特异性标记，用于软腐果胶杆菌亚种快速可靠的检测和鉴定。所涉及的已发表的采 自北京市不同郊区县和寄主的117株胡萝卜果胶杆菌的具体信息如表所示。

表2

实施例3引物对Pco病菌基因组的灵敏度检测

用无菌超纯水将Pco亚种参考菌株BCS7的初始模板DNA溶液分别稀释成浓度为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL和1fg/μL等9 个梯度，进行PCR扩增，评估该引物对Pco基因组检测的灵敏性，其中PCR的反应体系、反应 条件和凝胶电泳条件与实施例2相同，得到如图3所示的电泳图。结果显示10pg/μL以上浓度 皆可观察到电泳目的条带，说明本发明方法具有较好的灵敏度。

实施例4发病蔬菜组织中Pco病菌的检测

采用针刺法将Pco菌人工接种至健康的白菜植株上，待植株发病后，取发病植物组织采用 离心柱型植物基因组提取试剂盒(购买自北京天根公司)提取组织基因组DNA，利用本发明所 述引物srlE-F1/srlE-R1，按实施例2的方法进行检测。根据扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断 本发明设计的Pco特异性引物是否可以在植物软腐组织扩增到病原菌的目的条带。如果能在发 病植物组织中特异性地扩增出约674bp的目的条带，则该引物有望应用于生产上蔬菜软腐病的 检测。检测结果图4表明，植物细菌性软腐病发病症状典型的白菜组织中均可检测出Pco，而健 康白菜组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术具备蔬菜细菌性软腐组织中病原菌 的快速分子鉴定和检测的潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆 应属本发明的涵盖范围。

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 一种特异性引物及其检测方法

<160> 24

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 1

ATGATCGAAAGCATTACACACG 22

<210>2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 2

GTCAGGTTCGTTTATAAGAGC 21

<210>3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 3

TCGAAAGCATTACACACGGAGC 22

<210>4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 4

CCCTACCATCAAATAGCTCACG 22

<210>5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 5

TGACTGTGGTGGAACACTTCG 21

<210>6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 6

CAGCCAGTGATAAACCAACCG 21

<210>7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 7

GCGATTGTTGAGCGGTTAAAGG 22

<210>8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 8

AACAGCCCAGGCAAGAAGAACG 22

<210>9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 9

AGTCTCTGGATGACAACTTC 20

<210>10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 10

CTCTCTCCTGATTATTCAC 19

<210>11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 11

AATCCACGTTCATCGCTGTCG 21

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 12

CCTGGAAATTCAGCTCGGTCAG 22

<210>13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 13

ATGGATCAGGTTGCTGTAGTC 21

<210>14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 14

GACTGCCGGTTTCTTTATCAG 21

<210>15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 15

ATGCACAAAGTATTGCGGATGCC 23

<210>16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 16

GTGATTGTGTCAGTCCAACTCC 22

<210>17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 17

ATGGATCCTGTAAACACGCTG 21

<210>18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 18

CTCACTATCGCGAACGTTTC 20

<210>19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 19

ACAGATCGCGCTGGGATGGTTG 22

<210>20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 20

AGTGTCAGTGCCTGCCGAAGTG 22

<210>21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 21

ATGAAACCAGTTGAGCGTCAGG 22

<210>22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 22

TGTCTCCGGCCATAATAACCTC 22

<210>23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 23

TGCAAGTTCATGGCCGTACCACAG 24

<210>24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 24

CGCCTGGCTTACTGCAAACACTTC 24

Claims (10)

1.胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P. carotovorum subsp. odoriferum)特异性的分子检测引物，其特征在于：引物序列为：

上游引物srlE-F1：5’- TGACTGTGGTGGAACACTTCG - 3’，

下游引物srlE-R1：5’- CAGCCAGTGATAAACCAACCG - 3’。

2.一种检测胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P. carotovorum subsp. odoriferum)的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）提取待测生物样品的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；

（3）对所述扩增的产物进行鉴定，如果能特异性地扩增出674 bp的产物，即可判断所检的病原菌株为P. carotovorum subsp. odoriferum。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的扩增的反应体系以20 μL计，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L所述引物各1μL，待测生物样品基因组DNA 1 μL，用无菌水补足至20 μL。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的扩增参数为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述对扩增的产物进行鉴定的方法为：琼脂糖凝胶电泳法。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳法具体为：取5 μL所述的扩增的产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5 V/cm，电泳40 min后经GoldView染色于紫外定下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断。

7.如权利要求2至6任一项所述的方法，其特征在于：所述待测生物样品选自培养的细菌系，待测作物发病部分收集的细菌样品、胡萝卜果胶杆菌侵染后发病的植物软腐组织样品。

8.一种检测胡萝卜果胶杆菌亚种Pco(P. carotovorum subsp. odoriferum)的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物对。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR扩增的试剂。

10.如权利要9所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于提取待测生物样品基因组DNA的试剂。