CN110218804B - 用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其dna提取检测试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其快速检测试剂盒和方法；该试剂盒基于软腐病原菌特异性靶点单碱基差异现象，将样品核酸快速提取技术与环介导等温扩增技术相结合建立的细菌性软腐病原菌产品。该检测方法对软腐病原菌、植物组织、土壤样品均可进行快速检测，核酸提取在30s内即可完成，检测用时仅需30min‑40min，检测快速、准确，无需任何昂贵仪器、成本低，可直接用于田间实时实地检测，利于土壤中软腐病原菌的动态监测，利于开展软腐病的流行预测及早期预警工作，利于进行病害早期防治。

Description

用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其DNA提 取检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及核酸提取、基因检测诊断领域，具体涉及一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其快速检测试剂盒和方法。

背景技术

现阶段，随着保护地的发展、高附加值作物的连年栽培以及秸秆还田、免耕技术的推广等，土壤中病原菌大量积累，从而引起土传病害的发生。土传病害具有种类繁多，分布范围广，传播快，危害大，治理难等特点。病原菌可在土壤中越冬，来年继续侵害作物，如此循环，导致病害更加严重。一般情况下，土传病害危害植物的根茎，在作物生长前期，可导致幼苗根茎腐烂、死亡；在作物生长后期，可使作物严重减产，危害严重。通常情况下，作物栽种3-5年后，产量和品质均受到严重影响，可减产20％-40％，严重情况减产60％以上甚至绝收。

建立快速、准确、操作简便的土传病原菌检测方法，实地进行土传病害预测预报，为土传病害实时监测提供技术支持成为当前土传病害防治的重要内容之一。

常见的土传细菌性病害包括软腐病，青枯病等。细菌性软腐病是蔬菜上一类重要病害，该病害主要是由欧文氏菌属细菌引起的，主要为害十字花科作物、番茄、马铃薯、瓜类等植物，可使植物的组织或器官腐烂。除在植物的生长期外，在运输和贮藏期均容易发生病害。

田间病害调查发现，随着大白菜栽培面积的不断扩大及种植年限不断增加，软腐病等土传病害有加重发展的趋势，严重影响了大白菜的生产，且病害一旦发生，蔓延迅速，防治难度极大。大白菜软腐病是大白菜的主要病害之一，与霜霉病和病毒病统称为大白菜的三大病害。软腐病的发病范围广、周期长，处于生长期、储藏期和货架期的大白菜均可受害。适宜环境条件下，该病害可使大白菜减产50％以上，甚至造成个别地块绝产。2017年10月，河南省虞城县杜集镇发生大面积的大白菜软腐病病害，损失极大。Kazuhisa Tsuda等学者指出引起该病害的主要病原菌为Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum。2017年北京市农林科学院李晓颖等在北京房山区大白菜软腐发病样本中分离得到Pectobacterium aroidearum。在此之前，由P.aroidearum引发的软腐病害在国内尚未被报道。迄今为止，软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)仍是十字花科作物细菌性软腐病害的主要致病菌。

由于软腐病原菌可以在土壤中越冬，极难被杀死；且该病原菌寄主范围广泛，除为害大白菜外，其他十字花科作物、番茄、马铃薯、芹菜等均可受害。可见，病害一旦发生，治理难度大，对多种植物均存在威胁。土传病害防治过程中，土壤中病原菌的快速鉴定和检测可为病害的预测预报和早期防治提供参考。

目前，病原微生物检测通常采用形态学、生理生化等传统病原菌检测方法以及分子技术手段。传统检测方法原理简单、操作简便、成本低廉，但该类检测方法用时长，耗费精力大，且不能对植物组织、土壤直接检测。常用的分子检测方法包括PCR、qPCR、高通量检测等，这类检测方法需要昂贵的仪器设备，成本高且环境要求高，无法实现田间实地检测。

环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种恒温核酸扩增技术，该技术主要利用一套可识别靶基因六个特定区域的特异性引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，60℃-65℃恒温环境中发生自循环链置换反应，60分钟内即可完成反应，无需任何昂贵仪器设备且应用范围广。结果可通过琼脂糖凝胶电泳检测有无梯状条带、浊度检测判断，或者通过向反应体系中添加金属离子络合剂、金属离子指示剂等方法判断，通过其结合不同金属离子而呈现不同颜色的这一特性来判断反应情况。例如，羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，当溶液中存在Mg²⁺时，颜色为紫红色，随着反应的进行，大量生成的焦磷酸根离子与Mg²⁺结合，形成一种白色的焦磷酸镁沉淀副产物，消耗了溶液中的Mg²⁺，颜色会由紫红色变为天蓝色。

目前，公开号为CN 109207475A的中国发明专利申请公开了一种快速核酸提取方法，可在1分钟内完成核酸的提取，并将产物用于PCR、RPA法扩增。该方法快速、简便，但是专利申请中样本量少，缺少实地实时应用；核酸提取用时1分钟，与本专利申请中核酸提取用时30s相比，该方法用时更长，且在PCR、RPA核酸扩增方面无具体方法描述。

公开号为CN 105018631 A的中国发明专利申请公开了一种基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法。专利中以软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)的pmrA基因设计引物，可特异性检测Pectobacterium carotovorum。通过向反应管中添加钙黄绿素后，反应管有无荧光进行结果判断。专利中公开其特异性引物由以下组成：

正向内引物FIP：

5'-CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3'，

反向内引物BIP：

5'-CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3'；

正向外引物F3：5'-GCTGGATGACAAGCCAGTG-3'，

反向外引物B3：5'-CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3'；

环引物Loop：5'-ACCAGGCGGGACAGTATCG-3'

该方法只能特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌，并不能区分其亚种，但是实际病害调查及大量文献报道表明，软腐果胶杆菌不同亚种对不同植物的危害存在显著差异。而且，该方法仅对植物发病组织总DNA以及细菌悬液进行检测，但是对于土传病害的防治工作，实地实时对土壤含菌情况进行检测，更有助于病害预防工作的开展，专利中并未将所述方法用于田间实地检测。更重要的是，该方法在样本处理时，需使用细菌DNA提取试剂盒、离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，分别提取病原菌和植物组织的DNA用于LAMP检测，提取过程用时长且试剂盒的成本高，不利于在田间实地应用。

公开号为CN 107447049 A的中国发明专利申请公开了一种土壤中快速检测病原微生物的方法，基于环介导等温扩增技术，对镰刀菌、腐霉菌等土传病原微生物建立了检测方法。然而，专利申请中所述的检测方法，需要使用商品化试剂盒提取核酸，且未对申请中的引物进行灵敏性检测，在引物特异性检测中仅涉及了5种目标病原微生物及3组对照样本，样品量不足，其灵敏度和特异性存在争议。

为了更有利于解决当前土传病害防治难的实际问题，特异性强、灵敏度高、成本低、环境条件要求低的土传病原菌快速检测方法在土传病害预测预报过程中是不可或缺的技术手段。

目前，尚缺乏可应用于田间的土传病原菌核酸快速提取、检测一体化方法的设想和验证。

发明内容

本发明的第一目的是针对目前缺乏可特异性检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的方法这一现状，提供了一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum)的引物组。

本发明的第二目的是针对现有缺乏田间土传病原菌核酸快速提取、检测一体化方法的现状，提供了一种软腐病原菌快速检测试剂盒，该试剂盒为田间病害实地监测提供技术支持，其以软腐病原菌快速检测为模型，建立一种土传病原菌核酸快速提取、检测一体化方法及实现该方法的特异性引物和试剂盒。可应用于田间及其他艰苦环境中，操作简单，结果判定直观。可用于土传病原菌的动态监测，进行土传病害的流行预测及早期预警，对病害早期防治具有重要意义。

本发明的第三目的是提供了一种软腐病原菌快速检测试剂盒及其检测方法，该方法将将病原菌核酸提取与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)相结合的POCT快速诊断方法，可用于菌悬液、寄主植物等样本的软腐病原菌实时实地监测，进行软腐病害的流行预测预报，为土传病害流行预测提供技术支持。

为实现上述目的，本发明所设计一种用于检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)的引物组，所述引物组为特异性检测Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum的引物组，其为：

正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'；

本发明还提供了一种上述引物组在检查田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种中的应用。

本发明还提供了一种检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的试剂盒，即软腐果胶杆菌胡萝卜亚种快速DNA提取检测试剂盒，又称为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种POCT检测试剂盒。所述试剂盒包括核酸快速提取盒和检测盒，所述核酸快速提取盒包括裂解液、研磨球、核酸提取盘、洗涤液、洗脱液；所述检测盒包括权利要求1所述引物组、检测反应液；其中，Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum的引物组为

正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。

作为优选方案，所述检测试剂盒由引物组、检测反应液组成；检测反应液包括：10x等温扩增反应缓冲液，100mM MgSO₄，10mM dNTP Mix，5M甜菜碱，8 U/μL Bst 2.0 DNA聚合酶和羟基萘酚蓝(HNB)。

本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，该方法包括提取方法和检测方法，包括以下步骤：

1)样本核酸的提取：

a.将田间待测植株的组织表面消毒、剪碎，获得组织液进行病原菌富集培养，培养液即为待检测样品；

b.待检测样品与裂解液按样品与裂解液比1:3-5的比例混匀，加入2-3颗直径2mm-3mm钢珠，震荡，室温下孵育10s后，获得样本混合液；

c.取50μL-100μL的混合液缓慢滴加至核酸提取盘的点样区，静置5s；

d.吸取200μL-300μL的Washing buffer匀速滴加至点样区，去除点样区抑制剂；

e.当样品量大时，采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，得到切下的点样区核酸提取盘(切下的点样区核酸提取盘作为检测模板用于快速检测)；

或者，当待测样品珍贵、样品量少且需重复检测时，采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，将切下的核酸提取盘置于0.2mL洁净PCR管中，向该PCR管中加入3μL-5μL Elution Buffer浸没提取盘，洗脱盘上负载的核酸，获得核酸洗脱液(将该核酸提取液作为检测模板用于快速检测)；

2)检测方法

a.将上述切取的核酸提取盘或上述核酸洗脱液置于洁净PE管中待测；

b.向200μL洁净反应管中加入如下表所示LAMP基础反应液，向基础反应液中加入1-2片上述切取的核酸提取盘或1μL核酸洗脱液，无菌水补足至25μL，并以10μL石蜡油密封；将该反应管置于50℃-66℃水浴锅内，水浴40min；再将该管置于85℃水浴锅内，恒温水浴5min；

c.反应完毕后，观察反应管颜色变化进行结果判定：

当反应管呈现蓝色时，表示有扩增产物，反应呈阳性，即样本含有软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)；此时，可适当进行田间软腐病防治工作，例如清除发病植株和根际土壤，喷施适宜浓度的春雷霉素、链霉素，避免病害大面积发生；

当反应管呈现紫色时，表示无扩增产物，反应呈阴性，即样本不含软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)或所含病原菌未达到检测限。为避免漏检，可将反应结果呈阴性的检测样本再次进行病原菌富集，进行核酸提取、检测。

本发明试剂盒和检测方法的优点：

1.本发明采用的核酸快速提取方法在30s内完成核酸提取，产物可现提现用或置于-20℃环境条件下长期冻存；

2.本发明检测部分核酸扩增阶段最适温度50℃-66℃，时间30min-40min，保温杯、水浴锅等均可提供该反应条件；

3.本发明中，选用合适浓度的羟基萘酚蓝(HNB)作为显色剂，于反应前加入体系中，无需二次开盖，且采用石蜡油进行体系密封，有效避免了假阳性问题的产生。

4.本发明结果判断方法简单、直观。反应结束后，通过观察反应管的颜色进行结果的判断，并可以依据反应管颜色变化，准确进行软腐病预测预报，有效指导软腐病害防治工作。

与现有方法、技术相比，本发明的有益结果：

1.步骤简洁，操作简单：核酸提取过程无需复杂的过滤操作，无需涡旋机、离心机等设备；可通过如恒温水浴锅、保温杯等可提供稳定热源的设备进行核酸快速检测；可通过产物颜色的变化判定反应结果，无需昂贵的仪器设备和繁琐的电泳过程；全程步骤简便、易操作，对检测人员要求低。

2.高效快速：核酸提取在30s内即可完成，检测用时仅需30min-40min，全程用时不足一小时，与传统检测方法相比，该方法用时更短。

3.特异性强，灵敏度高：与传统PCR引物识别靶序列的两个独立区域相比，该方法可特异性识别靶序列的六个独立区域，特异性大大提高；依据病原菌特异性靶点的单碱基差异现象，设计并筛选特异性强的引物组，建立最佳反应体系，增强检测特异性。该方法对软腐病原菌基因组DNA的检测，检测灵敏度是4.145fg/μL，对接种病原菌的土壤样品进行检测，检测灵敏度为每克土壤接种量1.6×10⁴ CFU，上述样品检测灵敏度均是PCR检测法的100倍。

4.准确度高：该方法几乎不受蛋白、盐类物质的影响；检测过程中，反应管无需二次开盖，且采用石蜡油进行体系密封，可有效避免气溶胶污染；该显色剂颜色变化明显，显色度高，易识别，易于结果判断。

5.成本低廉：核酸提取、检测过程中无需商品化试剂盒、昂贵的仪器，所用材料成本低、稳定性好，使用的仪器、设备简单，大大降低了检测成本。

6.环境适应性广：无需大型的仪器、设备，扩增阶段反应条件温度50℃-66℃，反应时间30min-40min，保温杯、水浴锅等均可满足该反应条件，可适用于田间等非实验室场所直接检测。

7.本发明的试剂盒具有良好的特异性和敏感度，特异性检测试验表明：

①该方法及试剂盒可特异性检测软腐病原细菌；

②该方法及试剂盒可实现软腐果胶杆菌属两个亚种Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum和Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense的区分。对该检测方法和试剂盒的灵敏度试验结果如下：①对软腐病原菌DNA的检测表明DNA的检测灵敏度达到4.145fg/μL；②对人工接种目标病原菌的土壤进行检测表明土壤带菌样品的检测灵敏度为每克土壤样品带菌量1.6×10⁴CFU。

综上所述，本发明将软腐病原菌特异性靶点单碱基差异现象与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合，对软腐病原菌建立快速检测方法，可特异性检测Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum。将样品前处理与检测相结合，建立一体化方法，简单易操作，成本低，无需任何昂贵的实验仪器，环境适应性强，可满足田间等环境实地检测(POCT)。从样品制备至检测完成仅需约40分钟，通过目视反应管的颜色直接进行结果判断，结果判断方法简单直观，准确率高。

附图说明

图1为检测试剂盒优化过程中反应管颜色的变化图；

图2为检测试剂盒优化过程中各方案产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为检测结果判断方法的比较图；

图中，左图为向体系中添加适宜浓度的羟基萘酚蓝(HNB)，通过反应管颜色变化判断反应结果，右图为通过目视反应管浊度变化判断反应结果。

图4为试剂盒中检测结果的颜色变化图；

图中，1，2：Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum；3，4：Escherichiacoli；

图5为所述试剂盒的特异性检测扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果图和对应电泳图；

图中，M：2000bp Marker；1-20：Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum；21-23：Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense；24：Bacillus firmus；25：Bacillus subtilis；26：Citrobacter farmeri；27：Enterobacteraerogenes；28：Enterobacter sp.；29：Enterobacter asburiae；30：Klebsiella oxytoca；31：Klebsiella pneumoniae；32：Pseudomonas putida；33：Pseudomonasplecoglossicida；34-37：Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum；38：Raoultella terrigena；39：Raoultella ornithinolytica；40：Raoultella planticola；41-42：Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense；

图6为所述试剂盒的灵敏度检测扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果图和对应电泳图；

图中，M：2000bp Marker；1：41.45ng/μL；2：4.145ng/μL；3：4.145·10^-1ng/μL；4：4.145·10^-2ng/μL；5：4.145·10^-3ng/μL；6：4.145·10^-4ng/μL；7：4.145·10^-5ng/μL；8：4.145·10^-6ng/μL；9：4.145·10^-7ng/μL；10：4.145·10^-8ng/μL；11：4.145·10^-9ng/μL；

图7为所述试剂盒对植物组织直接检测的扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果图和对应电泳图；

图中，M：2000bp Marker；1-8：明显感病的大白菜组织样本；9-16：未出现明显病状的大白菜组织样本；

图8为所述试剂盒对含菌土壤样品检测的扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果图和对应电泳图；

图中，M：2000bp Marker；土壤样品中软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum)含量依次是1-8：1.6×10⁸CFU/g-16CFU/g；9：空白对照。

图9为所述试剂盒对田间土壤样品检测的扩增产物在自然光下颜色变化的观察结果图和对应电泳图；

图中，1-30：田间采集的大白菜根际土壤样品；31-32：空白对照土样。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

用于检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组为特异性检测Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum的引物组，其为：

正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。

基于上述引物组选取检测试剂盒的材料和反应条件的理论基础：

1.不同核酸吸附膜对快速检测试剂盒核酸提取效果的影响选取Whatman No.1滤纸、尼龙膜、玻璃纤维素膜、斯科特纸巾四种膜材料分别制作核酸提取盘，并按照专利申请中所述方法，使用上述四种核酸提取盘进行样本的核酸提取、检测，其他条件均保持一致。

表1不同核酸吸附膜对快速检测试剂盒核酸提取效果的影响

由表1可见，Whatman No.1滤纸、玻璃纤维素膜、斯科特纸巾三种材料制作的核酸提取盘，检测效果优于尼龙膜材料制作的核酸提取盘；且上述三种材料相比，玻璃纤维素膜的价格更低。在保证较高核酸提取率的前提下，为降低试剂盒成本，优先选取玻璃纤维素膜材料，通过阳离子高分子聚合物壳聚糖改性，制备核酸提取盘。

2.不同反应条件对快速DNA提取检测方法、试剂盒检测效果的影响

将田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum标准菌株CGMCC1.141作为待检测样本，按照专利申请中所述方法进行POCT快速检测，在其他因素一致的前提下，判断不同反应温度、时间对POCT快速检测的影响。

表2不同反应条件对快速检测试剂盒检测效果的影响

方案评价标准：

(1)优：反应管呈现蓝色，琼脂糖凝胶电泳结果显示清晰明亮梯状条带；

(2)良：反应管呈现蓝色或蓝紫色，琼脂糖凝胶电泳结果显示梯状条带，但条带亮度低；

(3)差：琼脂糖凝胶电泳结果显示无梯状条带。

结论：由表2可知，反应温度过高(68℃及以上)或温度过低(49℃及以下)均不利于反应的进行，检测效果较差；故反应温度需控制在50℃-66℃范围内，最佳反应时间40min。

实施例1用于检测田间软腐病原菌的引物组

基于病原菌特异性靶点单碱基差异现象，将目标病原菌特异性靶点单碱基差异现象与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合，借助NCBI在线数据库，采用DNAMAN进行软腐病原菌管家基因及ITS间隔区、pmrA基因等特征基因序列的分析、比较，确定可稳定遗传的差异位点，设计并筛选了用于特异性检测检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum)最佳引物组合。可特异性检测Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum的引物组合物由以下组成：

正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。

实施例2

基于上述实验筛选引物组制备得到田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的检测试剂盒，它包括核酸快速提取盒和检测盒，所述核酸快速提取盒包括裂解液、研磨球、核酸提取盘、洗涤液、洗脱液；所述检测盒包括权利要求1所述引物组、检测反应液；其中，田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum的引物组为

正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。

作为优选方案，所述检测试剂盒由引物组、检测反应液组成；检测反应液包括：10x等温扩增反应缓冲液，100mM MgSO4，10mM dNTP Mix，5M甜菜碱，8U/μL Bst 2.0 DNA聚合酶，羟基萘酚蓝(HNB)。

上述试剂盒的各物质的制作方法如下：

1)核酸提取盘的制备：采用切圆器切取直径35mm-60mm的圆形吸附膜，利用1.25％(W/V)阳离子高分子聚合物壳聚糖将吸附膜改性。

2)裂解液的制备：以1mL裂解液为例，主要包括：40mM Tris(pH8.0)，5mM EDTA，50mM Nacl，0.1％SDS，100mM NaOH。

3)洗涤液(Washing buffer)的制备：以1mL洗涤液为例，主要包括：5.5mM Tris(pH8.0)，0.06％Tween-20。

4)洗脱液(Elution Buffer)的制备：以1mL洗脱液为例，主要包括5mM Tris(pH8.0)，5mM EDTA。

其它物质购于市场。

上述检测试剂盒的具体检测方法如下：

1)样本核酸的提取：

a.将田间待测植株的组织表面消毒、剪碎，获得组织液进行病原菌富集培养，培养液即为待检测样品；

b.待检测样品与裂解液按样品与裂解液比1:3-5的比例混匀，加入2-3颗直径2mm-3mm钢珠，震荡，室温下孵育10s后，获得样本混合液；

c.取50μL-100μL的混合液缓慢滴加至核酸提取盘的点样区，静置5s；

d.吸取200μL-300μL的Washing buffer匀速滴加至点样区，去除点样区抑制剂；

e.当样品量大时，采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，得到切下的点样区核酸提取盘(切下的点样区核酸提取盘作为检测模板用于快速检测)；

或者，当待测样品珍贵、样品量少且需重复检测时，采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，将切下的核酸提取盘置于0.2mL洁净PCR管中，向该PCR管中加入3μL-5μL Elution Buffer浸没提取盘，洗脱盘上负载的核酸，获得核酸洗脱液(将该核酸提取液作为检测模板用于快速检测)；

2)检测方法

a.将上述切取的核酸提取盘或上述核酸洗脱液置于洁净PE管中待测；

b.向200μL洁净反应管中加入如下表所示LAMP基础反应液，向基础反应液中加入1-2片上述切取的核酸提取盘或1μL核酸洗脱液，无菌水补足至25μL，并以10μL石蜡油密封；将该反应管置于50℃-66℃水浴锅内，水浴40min；再将该管置于85℃水浴锅内，恒温水浴5min；

c.反应完毕后，观察反应管颜色变化进行结果判定：

当反应管呈现蓝色时，表示有扩增产物，反应呈阳性，即样本含有软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)；此时，可适当进行田间软腐病防治工作，例如清除发病植株和根际土壤，喷施适宜浓度的春雷霉素、链霉素，避免病害大面积发生；

当反应管呈现紫色时，表示无扩增产物，反应呈阴性，即样本不含软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)或所含病原菌未达到检测限。为避免漏检，可将反应结果呈阴性的检测样本再次进行病原菌富集，进行核酸提取、检测。

由图3所示：依据颜色变化判断结果的方法更直观，优于通过反应液浊度判断。

如图4所示：当模板为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种时，反应产物颜色为天蓝色；当模板为大肠杆菌时，反应产物为紫色。

上述检测试剂盒的验证试验：

1.上述检查试剂盒的特异性试验。

2017年10月至2018年11月期间，进行了大白菜软腐病病害发生情况的田间调查及发病组织、作物根际土壤样本的采集，将病组织、土壤中病原菌分离、纯化，以Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum、Pectobacterium carotovorum subspbrasiliense及其他常见的农作物病原菌、土传病原菌共42株作为检测样品，病原菌详情如下表所示，采用上述试剂盒进行样品检测，并将专利申请中所述试剂盒与商品化检测试剂盒(Tiangen快速DNA提取检测试剂盒KG203)相比较。

如图5可知：上述检测试剂盒与商品化检测试剂盒相比较，上述检测试剂盒用时更短，特异性更强，可特异性检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)。

表3检测样本详情

2.上述检测试剂盒的灵敏度试验

为确定上述试剂盒的检测方法的检测下限，采用Omega Bio-tek细菌DNA提取试剂盒提取、纯化Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum标准菌株CGMCC 1.141基因组DNA，以10倍梯度稀释。将上述梯度稀释的基因组DNA作为模板，分别采用上述试剂盒及常规PCR检测方法检测。

如图6所示，软腐果胶杆菌胡萝卜亚种快速DNA提取检测试剂盒最低检测限4.145fg/μL，常规PCR检测法最低检测限0.4145pg/μL。

由此可知：上述检测试剂盒的灵敏度是PCR检测方法的100倍。

实施例3上述检测试剂盒对植物组织直接检测

田间采集不同发病程度的大白菜组织样本(16个)，采用上述检测试剂盒进行快速检测：

对明显感病的大白菜组织样本(8个)和未出现明显病状的大白菜组织样本(8个)进行POCT检测和常规PCR检测。

如图7所示：明显感病的大白菜组织样本全部呈阳性，未出现明显病状的大白菜组织样本中25％呈阳性；常规PCR结果显示，明显感病的大白菜组织样本中62.5％呈阳性，未出现明显病状的大白菜组织样本全部呈阴性。

由此可知：(1)上述试剂盒可以直接检测病原菌外，还可以直接检测植物组织样品；

(2)上述试剂盒的灵敏度高于常规PCR检测；

(3)上述试剂盒，可用于植物生长期、储存期的软腐病害早期预测预报。

实施例4上述检测试剂盒检测人工接种病原菌的土壤样本

将Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum标准菌株CGMCC 1.141定量接种于土壤样品，并用无目标细菌的土壤以10倍梯度稀释；采用MP Bio土壤DNA提取试剂盒提取、纯化上述梯度稀释样品，并分别采用上述检测试剂盒进行检测。

如图8所示，上述试剂盒的检测限为每克土壤含菌量1.6×10⁴CFU，常规PCR的检测限为每克土壤1.6×10⁶CFU。由此可知：在检测土壤带菌样品时，该试剂盒的灵敏度比常规PCR高100倍。

实施例5采用上述检测试剂盒进行田间软腐病害早期诊断

在软腐病发病初期，对田间采集的32份土壤样品基因组DNA分别采用上述及常规PCR方法进行检测。

如图9所示：上述试剂盒检测结果显示，19份土壤样品呈阳性，11份土壤样品呈阴性，阳性检出率：63.33％；

常规PCR检测结果显示，5份土壤样品呈阳性，25份土壤样品呈阴性，阳性检出率：16.67％。

由此可知：

(1)对田间土壤样品检测，该试剂盒的灵敏度高于常规PCR检测法；

(2)该试剂盒更适于田间样品直接检测，更有利于田间病害的早期诊断。

由上述实施例可知：上述试剂盒特异型强、灵敏度高，可特异性检测Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum，适用于对菌悬液、植物组织的直接检测；将样品前处理步骤与检测相结合，简单易操作，成本低，环境适应性强，可满足田间等环境实地检测；从样品制备至检测完成仅需约40分钟，通过目视反应管的颜色直接进行结果判断，结果判断方法简单直观，准确率高，明显优于现有其他检测方法；将本发明检测试剂盒用于田间土壤样本的检测，检测限为每克土壤含菌量1.6×10⁴CFU，检测灵敏度是常规PCR方法的100倍；本发明适用于田间实地检测，更有利于进行田间病害早期诊断，为土传病害的预测预报提供方法和依据。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其DNA提取检测试剂盒和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccaaagaa gcagacgc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcttggcaa ggtaatcgt 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcccatcttc atccggtaag cccatcagca gcgcgcatta 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcattacca gcatcccgtg ctcgctgacg cgatcgttta 40

Claims (4)

1.一种用于检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组，其特征在于：所述引物组为特异性检测的引物组，其为：

正向外引物Pcc-F3：5'- GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'- GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。

2.一种权利要求1所示引物组在检查田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种中的应用。

3.一种检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的试剂盒，所述试剂盒包括核酸快速提取盒和检测盒，其特征在于：所述核酸快速提取盒包括裂解液、研磨球、核酸提取盘、洗涤液、洗脱液；所述检测盒包括权利要求1所述引物组、检测反应液；其中，所述引物组为：

正向外引物Pcc-F3：5'- GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，

反向外引物Pcc-B3：5'- GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；

正向内引物Pcc-FIP：

5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，

反向内引物Pcc-BIP：

5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'；所述检测反应液包括：10×等温扩增反应缓冲液、100mM MgSO₄，10mM dNTP Mix，5M甜菜碱，8 U/μL Bst 2.0 DNA聚合酶和羟基萘酚蓝。

4.一种权利要求3所述试剂盒的检测方法，该方法包括提取方法和检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）样本核酸的提取：

a.将田间待测植株的组织表面消毒、剪碎，获得组织液进行病原菌富集培养，培养液即为待检测样品；

b.待检测样品与裂解液按样品与裂解液比1:3-5的比例混匀，加入2-3颗直径2mm-3mm钢珠，震荡，室温下孵育10s后，获得样本混合液；

c.取50μL-100μL的混合液缓慢滴加至核酸提取盘的点样区，静置5s；

d.吸取200μL-300μL 的洗涤液匀速滴加至点样区，去除点样区抑制剂；

e.采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，得到切下的点样区核酸提取盘；

或者，采用3mm-5mm直径的打孔器切下核酸提取盘点样区，将切下的核酸提取盘置于0.2mL洁净PCR管中，向该PCR管中加入3μL-5μL洗脱液浸没提取盘，洗脱盘上负载的核酸，获得核酸洗脱液；

2）检测方法

a.将上述切取的核酸提取盘或上述核酸洗脱液置于洁净EP管中待测；

b.向200μL洁净反应管中加入如下表所示LAMP基础反应液，向基础反应液中加入1-2片上述切取的核酸提取盘或1μL核酸洗脱液，无菌水补足至25μL，并以10μL石蜡油密封；将该反应管置于50℃-66℃水浴锅内，水浴40min；再将该管置于85℃水浴锅内，恒温水浴5min；

c.反应完毕后，观察反应管颜色变化进行结果判定：

当反应管呈现蓝色时，表示有扩增产物，反应呈阳性，即样本含有软腐果胶杆菌胡萝卜亚种；

当反应管呈现紫色时，表示无扩增产物，反应呈阴性，即样本不含软腐果胶杆菌胡萝卜亚种或所含病原菌未达到检测限。

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