CN112111589B - 一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。本发明通过对蔬菜软腐果胶杆菌P.polaris及其近缘种和其他病原菌等138个细菌菌株进行了基因聚类分析，得到四个P.polaris特异基因。本发明基于得到的P.polaris特异基因设计了PCR和qPCR引物，并且经实验验证，PCR和qPCR引物均具备高度的灵敏度和特异性，最低可以检测1pg的样品。本发明提供的PCR和qPCR引物可以准确鉴别出早期蔬菜软腐病样是否携带P.polaris，在蔬菜软腐病的早期诊断中具有重要意义。

Description

一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及 方法和应用

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。

背景技术

由软腐果胶杆菌Pectobacterium spp.引起的细菌性软腐病是蔬菜上普遍发生的一类毁灭性病害，主要危害叶柄、叶片，产生水渍状病斑，严重时导致整棵植株腐烂死亡并散发恶臭气味，严重影响了蔬菜产品的产量和质量，制约着我国蔬菜产业的发展。

Pectobacterium属目前包含19个种：P.atrosepticum,P.wasabiae,P.betavasculorum,P.carotovorum,P.cacticidum,P.parmentieri,P.aroidearum,P.peruviense,P.polaris,P.punjabense,P.fontis,P.zantedeschiae,P.aquaticum,P.odoriferum,P.versatile,P.brasiliense,P.actinidiae,P.polonicum and P.parvum(Portier et al.2019；Pasanen et al.2020).病原菌种类的准确鉴定对于蔬菜软腐病防治措施的制定非常重要。目前对于软腐果胶杆菌分类鉴定方法主要包括两类：一类是主要基于形态学、生理生化特征等的传统鉴定方法，这些鉴定方法耗时较长、程序繁琐、准确性低，而且还要求鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，难以满足病原菌鉴定中快速、准确、稳定的检测要求；第二类是分子生物学鉴定手段，如保守基因如16S rDNA、pmrA等序列进化分析、ITS-RELP、多位点序列分析MLSA等，但操作过程复杂、耗时较长，成本较高，且对操作人员存在一定技术要求。除此之外，第二类方法还包括兼具特异、灵敏、快速、简便、准确、易自动化等突出优点的特异PCR/qPCR鉴定方法，其只要求工作者有简单的分子操作技能，现已越来越多地用于鉴定植物病原菌的工作中。

目前已有一些Pectobacterium spp.特异引物的报道，如Pectobacterium属特异引物Y1/Y2，P.atrosepticum特异引物Eca1f/Eca2，P.wasabiae特异引物PhF/PhR，P.brasiliense特异引物BR1f/L1r以及P.odoriferum特异引物srlE-F1/srlE-R1(Li etal.2020)。但是目前尚未有针对P.polaris的特异性引物。

发明内容

为了至少解决现有技术中的一个技术问题，本发明提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用。

第一方面，本发明提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris(缩写为P.polaris)的特异性PCR引物，包括如下引物：

30452-S:5’-TTCATTTTACCTGCGGCCCT-3’，

30452-AS:5’-GCCCCTTCCGTAGACATCAG-3’。

本发明同时提供一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性qPCR引物，包括如下引物：

98123-qS:5’-ACCCTGAAATTGTGTCGAAATGG-3’，

98123-qAS:5’-TGACCAGTTCACAAAGCCCT-3’。

自Dees et al.(2017)提出将P.polaris确立为一个新种以来，尚未见到关于其特异引物的报道，本研究分别开发了可用于特异PCR/qPCR鉴定P.polaris的特异引物，并明确了其使用方法，为P.polaris的快速准确鉴定奠定了基础。

本发明进一步提供包含所述特异性PCR引物，和/或，所述特异性qPCR引物的试剂盒。

本发明进一步提供所述特异性PCR引物、所述特异性qPCR引物或所述试剂盒在鉴定蔬菜软腐病的应用。

进一步地，所述应用为在未表现出蔬菜软腐病发病症状的的早期鉴定中的应用。

第二方面，本发明提供一种鉴别蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的方法，包括：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)通过所述特异性PCR引物对所述DNA进行PCR检测，和/或，通过所述特异性qPCR引物进行qPCR检测，根据检测结果判定所述待测样品中是否含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris。

进一步地，所述根据检测结果判定所述待测样品中是否含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris为：

若所述PCR检测得到771bp的条带，或所述qPCR检测得到153bp的条带，则判定所述待测样品中含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris。

进一步地，所述PCR检测的程序为：94℃4min；94℃30s，68.5℃30s，72℃48s，35循环；72℃10min，或所述qPCR检测的程序为：95℃30s；95℃5s，68.5℃30s，40循环。

进一步地，所述PCR检测的体系为：20μL：1×Taq PCR Master Mix，上下游引物各4pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至20μL，或所述qPCR检测的程序为：25μL：1×TBGreen^TMPremix Ex Taq^TMII，上下游引物各10pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至25μL。

本发明具备如下有益效果：

本发明通过对蔬菜软腐果胶杆菌P.polaris及其近缘种和其他病原菌等138个细菌菌株进行了基因聚类分析，得到四个P.polaris特异基因，并基于这些特异基因设计了PCR和qPCR引物。经实验验证，本发明提供的PCR和qPCR引物均具备高度的灵敏度和特异性，最低可以检测1pg的样品。本发明提供的PCR和qPCR引物可以准确鉴别出早期蔬菜软腐病样是否携带P.polaris，在蔬菜软腐病的早期诊断中具有重要意义。

本发明提供的PCR和qPCR引物可以直接检测蔬菜软腐病样是否携带P.polaris，甚至在未显症时的潜伏期，也可以很好的诊断P.polaris，在蔬菜软腐病的早期诊断方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的特异性PCR和qPCR引物的灵敏度检测示意图；其中A为PCR检测，B为qPCR检测，10倍梯度稀释的P.polaris基因组DNA(浓度为100ng/μL至1fg/μL)作为模板用于PCR/qPCR检测；CK-为阴性对照；M:为DNA Marker；

图2为本发明实施例3提供的Brassica rapa发病组织中P.polaris的PCR/qPCR检测结果；其中A为PCR检测，B为qPCR检测，泳道1和2分别代表接种P.polaris部位发病组织和接种P.polaris部位周围未发病组织DNA检测，CK-为阴性对照，CK+为P.polaris gDNA，M为DNA Marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1特异性引物的开发过程

为了更为有效地开发P.polaris的特异引物，不同于常规单一比较基因组学的特异基因筛选方法，本实施例采取了特异基因三重筛选方法(正向筛选+反向比对+Nr数据库验证)，提高了筛选基因和引物的特异性。首先通过高通量比较基因组学的蛋白聚类方法挖掘了P.polaris的特异基因。收集138个细菌菌株的142个基因组序列，这些细菌菌株包括11株P.polaris，98株P.polaris近缘种(79株Pectobacterium spp.+8株Dickeya spp.+11株Erwinia spp.)和29株其他病原细菌或土传细菌。将所有142个基因组的基因氨基酸序列使用CD-HIT软件进行基因聚类，参数设置为比对区域大于基因序列的60％，且比对相似性大于70％，获得6个仅在P.polaris基因组中出现而未在其他菌株基因组中出现的基因聚类，此为第一轮正向筛选。随后，将获得的6个候选P.polaris特异基因重新比对到142个细菌基因组序列进行比对分析(此为二次反向比对)，剔除2个非P.polaris特有基因后，筛选获得4个P.polaris特异基因(表1)。最后将这4个特异基因比对拥有海量基因数据的GenBank Nr数据库(比对阈值设为相似性大于70％)，进一步验证基因在P.polaris中的特异性，结果发现4个基因均为P.polaris特有基因(此为第三重Nr数据库特异性验证)，至此确认4个筛选获得的P.polaris候选特异基因的高度特异性。

表1 P.polaris的特异基因

针对其中的两个特异基因cluster30452和cluster98123，本实施例设计了普通PCR和荧光定量PCR(qPCR)特异引物，分别为：

PCR引物：

30452-S:5’-TTCATTTTACCTGCGGCCCT-3’

30452-AS:5’-GCCCCTTCCGTAGACATCAG-3’；

qPCR引物：

98123-qS:5’-ACCCTGAAATTGTGTCGAAATGG-3’；

98123-qAS:5’-TGACCAGTTCACAAAGCCCT-3’。

实施例2特异性PCR/qPCR引物的灵敏度和特异性

2.1、特异性验证

本实施例利用收集的61株不同地理来源和寄主的细菌菌株(共包含5株P.polaris，7株P.aroidearum，10株P.carotovorum，14株P.brasiliense，13株P.odoriferum，5株P.versatile，1株P.atrosepticum和6株其他植物病原细菌)(表2)对实施例1得到的PCR引物和qPCR引物进行特异性验证。

用TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN,China)将每株菌提取DNA后进行PCR和qPCR反应。

PCR反应体系：

20μL：1×Taq PCR Master Mix，上下游引物各4pm，20ng细菌DNA，用无菌超纯水补足至20μL；PCR程序：94℃4min；94℃30s，68.5℃30s，72℃48s，35循环；72℃10min。

qPCR反应采用SYBR方法通过CFX Connect^TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad,Germany)进行，反应体系25μL：1×TB Green^TMPremix Ex Taq^TMII(Tli RNaseHPlus)(Takara,Japan)，上下游引物各10pm，20ng细菌DNA，用无菌超纯水补足至25μL；PCR程序：95℃30s；95℃5s，68.5℃30s，40循环。

本实施例用无菌超纯水作为阴性对照模板，扩增产物通过琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如表2所示：两对引物均可以在P.polaris扩增出目的带(PCR和qPCR预期片段分别为771bp和153bp)，而其他所有非P.polaris菌株均无法扩增出目的条带，说明设计的PCR引物30452-S/AS和qPCR引物98123-qS/qAS具有很强的特异性和准确性，可快速、准确、简单地将P.polaris菌株鉴定出来。

表2 PCR/qPCR检测P.polaris的特异性

注:+,扩增出目的条带；-,未扩增出目的条带

2.2、灵敏度验证

本实施例将P.polaris WBC1菌株基因组DNA10倍梯度稀释为100ng/μL至1fg/μL，每浓度的DNA样品取1μL采用上述反应体系和条件进行PCR/qPCR检测，实验重复三次。结果如图1所示，PCR和qPCR对P.polaris的检测灵敏度分别为≥1pg和≥100pg基因组DNA。

实施例3特异性PCR/qPCR引物在发病植物中检测P.polaris的应用

本实施例提供实施例1得到的特异性PCR引物和qPCR引物在发病植物中检测P.polaris的方法，具体流程如下：

(1)人工接种P.polaris WBC1于6-8叶期白菜，置于28℃、≥95％湿度、14h光/10h暗条件下使其发病，同时接种无菌水作为阴性对照。24h后植株接种P.polaris部位呈现软腐状，而周围组织未呈现软腐状。

(2)分别取200mg接种P.polaris部位的发病组织和周围未发病的组织，用kit ofDNAquick Plant System(TIANGEN,China)提取DNA，取1μL为模板进行PCR/qPCR检测(方法同实施例2)。实验重复三次，并以接种无菌水的植物组织DNA作为阴性对照，以P.polaris基因组DNA作为阳性对照。

结果如图2所示，无论是发病的植物组织还是未呈现软腐状的植物组织均能扩增出目的条带，而阴性对照未扩增出目的带，表明本研究开发的PCR/qPCR检测方法可直接检测蔬菜软腐病样是否携带P.polaris，甚至在未显症时的潜伏期，也可以很好的诊断P.polaris，为蔬菜软腐病的早期诊断提供方便。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 一种检测蔬菜软腐果胶杆菌的特异性PCR引物和qPCR引物及方法和应用

<130> KHP201115990.8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcattttac ctgcggccct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccccttccg tagacatcag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accctgaaat tgtgtcgaaa tgg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaccagttc acaaagccct 20

Claims (10)

1.一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性PCR引物，其特征在于，包括如下引物：

30452-S:5’-TTCATTTTACCTGCGGCCCT-3’，

30452-AS:5’-GCCCCTTCCGTAGACATCAG-3’。

2.一种检测蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的特异性qPCR引物，其特征在于，包括如下引物：

98123-qS:5’-ACCCTGAAATTGTGTCGAAATGG-3’，

98123-qAS:5’-TGACCAGTTCACAAAGCCCT-3’。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性PCR引物，和/或，权利要求2所述的特异性qPCR引物。

4.权利要求1所述特异性PCR引物或权利要求2所述特异性qPCR引物或权利要求3所述试剂盒在鉴定蔬菜软腐病的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为在未表现出蔬菜软腐病发病症状的的早期鉴定中的应用。

6.一种鉴别蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris的方法，其特征在于，包括：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)通过权利要求1所述特异性PCR引物对所述DNA进行PCR检测，和/或，通过权利要求2所述特异性qPCR引物进行qPCR检测，根据检测结果判定所述待测样品中是否含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根据检测结果判定所述待测样品中是否含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris为：

若所述PCR检测得到771bp的条带，和/或，所述qPCR检测得到153bp的条带，则判定所述待测样品中含有蔬菜软腐果胶杆菌Pectobacterium polaris。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的程序为：94℃4min；94℃30s，68.5℃30s，72℃48s，35循环；72℃10min，和/或，所述qPCR检测的程序为：95℃30s；95℃5s，68.5℃30s，40循环。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的体系为：20μL：1×TaqPCR Master Mix，上下游引物各4pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至20μL，和/或，所述qPCR检测的程序为：25μL：1×TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II，上下游引物各10pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至25μL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的体系为：20μL：1×Taq PCRMaster Mix，上下游引物各4pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至20μL，和/或，所述qPCR检测的程序为：25μL：1×TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II，上下游引物各10pm，20ng样品DNA，用无菌超纯水补足至25μL。

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