CN117587168B - LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法 - Google Patents
LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了LAMP‑CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法，属于病原微生物检测技术领域。本发明建立了针对RHDV1和RHDV2的LAMP‑CRISPR/Cas12a快速检测试剂盒和方法，该平台表现出较高的灵敏度，能够检测到10拷贝/μL的核酸样本，具有良好的特异性，能够特异性鉴别RHDV1和RHDV2型毒株，且与兔其他常见病原体无交叉反应。进一步利用侧流层析试纸条和可视化荧光，在1.5h内得到肉眼可见的结果。本发明所述试剂盒为便携式平台，具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势，可供偏远农村和资源受限地区的临床使用。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法。
背景技术
兔出血症是一种急性、烈性、高度接触性传染病，由兔出血症病毒（RHDV）引起，该疾病死亡率极高，严重危害养兔业的发展。相较于经典RHDV称为兔出血症病毒1型（RHDV1），毒株兔出血症病毒2型（RHDV2）宿主范围更广，传播途径多，在自然环境下抵抗力强，对养殖业造成巨大经济损失，高效、准确且能鉴别二者的诊断工具对防控兔出血症疫情尤为重要。
目前已有PCR、荧光定量PCR、血凝实验、ELISA等检测方法。免疫学检测方法如血凝实验、ELISA实验检测的准确性较差，且存在窗口期难检出等不足，病原学检测方法如RT-PCR、荧光定量PCR需要专业的仪器，一般是实验室检测，无法做到现场的快速检测，无法满足基层养殖场的检测需求。目前基于LAMP和CRISPR-Cas12a快速可视化鉴别兔出血症病毒的研究未见相关报道，且该方法应用到区分兔出血症病毒1型和兔出血症病毒2型的快速鉴别也未见相关报道。
发明内容
本发明提供了LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法，该试剂盒和方法可精确鉴别出RHDV1和RHDV2病毒，具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系；所述LAMP扩增体系中包括外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP；针对RHDV1的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQID No.13-14所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.15-16所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.24-25所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.26-27所示；所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括gRNA；针对RHDV1的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.37；针对RHDV2的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示。
优选的，所述LAMP扩增体系中还包括环引物LF和LB；针对RHDV1的LAMP扩增体系中环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID No.28-29所示。
优选的，所述LAMP扩增体系中还包括LAMP/RT-LAMP 2X预混液、待检核酸和无酶水。
优选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括LAMP扩增产物、RNA酶抑制剂、NEBuffer 2.1、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子和无酶水。
优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
本发明提供了所述试剂盒在制备鉴别RHDV1和RHDV2产品中的应用。
本发明提供了基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV1和RHDV2的非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：（1）提取待检测样本的RNA；（2）以步骤（1）提取的RNA为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增；（3）将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测；或将得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行侧流层析试纸条检测。
优选的，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μL LAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水；针对RHDV1的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP、BIP的终浓度分别为1200nM，环引物LB的终浓度为600nM；针对RHDV2的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为800nM，环引物LF和LB的终浓度分别为600nM。
优选的，当进行荧光检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μLLAMP扩增产物、1μL RNA酶抑制剂（终浓度0.5U/μL）、2μL gRNA（终浓度500nM）、2μLNEBuffer 2.1、1μL Cas12a蛋白（终浓度125nM）、1μL荧光猝灭ssDNA报告分子（终浓度250nM）和11μL无酶水。
优选的，当进行侧流层析试纸条检测时，所述CRISPR/Cas12a检测总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μL RNA酶抑制剂（终浓度0.5U/μL）、2μL gRNA（终浓度500nM）、2μLNEBuffer 2.1、1μL Cas12a蛋白（终浓度125nM）、1μL生物素ssDNA报告分子（终浓度100nM）和11μL无酶水。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明为了快速、便捷、特异性检测RHDV1和RHDV2病毒，建立了针对RHDV1和RHDV2的LAMP-CRISPR/Cas12a快速检测方法，该平台表现出较高的灵敏度，能够检测到10拷贝/μL的核酸样本，具有良好的特异性，能够特异性鉴别RHDV1和RHDV2型毒株，且与兔其他常见病原体无交叉反应。
本发明进一步利用侧流层析试纸条和可视化荧光，在1.5h内得到肉眼可见的结果。此外，用针对RHDV1和RHDV2的检测系统分别检测74个临床样本，与荧光定量PCR检测的符合率分别为97.30%和97.30%，敏感性高于荧光定量PCR。本发明制备的试剂盒和构建的检测方法具有快速、高灵敏、高特异、可视化和低设备要求的优势，可供偏远农村和资源受限地区的临床使用。
附图说明
图1 LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与LFA（侧流层析试纸条）结合以及与蓝光仪结合的示意图。
图2 利用荧光LAMP分别检测和筛选RHDV1和RHDV2的三种引物组；其中A：RHDV1引物组Set 1、Set 2、Set 3，B：RHDV2引物组Set 1、Set 2、Set 3。
图3 用LAMP扩增RHDV1和RHDV2的交叉验证实验结果；其中A：核酸胶电泳检验交叉实验结果，B：用荧光LAMP进行交叉实验的终点荧光值，n=3，****P<0.0001。
图4 利用荧光LAMP分别对RHDV1和RHDV2的检测反应温度筛选结果；其中A：RHDV1筛选结果，B：RHDV2筛选结果。
图5 利用荧光LAMP分别对RHDV1和RHDV2的检测内外引物比筛选结果；其中A：RHDV1筛选结果，B：RHDV2筛选结果。
图6 利用荧光LAMP分别对RHDV1和RHDV2的检测环引物浓度筛选结果；其中A：RHDV1筛选结果，B：RHDV2筛选结果。
图7 可视化LAMP分别对RHDV1和RHDV2的检测结果。
图8 LAMP联用CRISPR/Cas12a检测方法结果；其中A：RHDV1检测体系CRISPR阶段gRNA的筛选与Cas12a蛋白浓度优化的正交实验的荧光值变化曲线图，B：RHDV2检测体系CRISPR阶段gRNA的筛选与Cas12a蛋白浓度优化的正交实验的荧光值变化曲线图；C：正交实验终点荧光值的比较(三个重复)；D：Cas12a蛋白的反式切割活性验证与RHDV1/RHDV2检测方法在CRISPR阶段的交叉实验；E：反式切割活性验证与交叉实验在蓝光下结果。
图9 LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性评估结果；其中A和B：通过终点荧光值来评估LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测平台的特异性结果（n=3，****P<0.0001)，C和D：通过蓝光下的成像结果评估LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测平台的特异性结果，E和F：基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFA检测平台的特异性结果。A、C、E对应的是RHDV1检测体系，B、D、F对应的是RHDV2检测体系。
图10 LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的敏感性评估结果；其中A和B：通过终点荧光值来评估LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测方法的敏感性结果（n=3，****P<0.0001），C和D：通过蓝光下的成像结果评估LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测方法的敏感性结果，E和F：基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFA检测方法的敏感性结果。A、C、E对应的是RHDV1检测体系，B、D、F对应的是RHDV2检测体系。
图11 LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的临床实用性评估结果；其中A和B：LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测方法检测74份临床样品的终点荧光值（临界值分别为55482，57905），C和D：LAMP-CRISPR/Cas12a荧光检测方法检测74份临床样品的蓝光照射结果，E和F：基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFA检测方法检测74份临床样品的结果；G和H：用qPCR方法检测74份临床样品的结果，带圈编号表示该样品的检测结果与本实验建立的方法不一致。A、C、E对应的是RHDV1检测体系，B、D、F对应的是RHDV2检测体系。
具体实施方式
本发明提供了基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系；所述LAMP扩增体系中包括外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP；针对RHDV1的外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.15-16所示；针对RHDV2的外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.24-25所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ IDNo.26-27所示；所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括gRNA；针对RHDV1的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.37；针对RHDV2的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示。本发明试剂盒LAMP扩增体系中还包括环引物LF或/和LB；针对RHDV1的环引LB的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对RHDV2的环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID No.28-29所示。
在本发明中，分别针对RHDV1(分离株WF2007，GenBank登录号：FJ794180)和RHDV2(分离株SC2020/04，GenBank登录号：MT383749)设计了保守片段VP60的多组引物，然后进行引物的筛选，选出效率最高的引物组，并且确保RHDV1和RHDV2体系之间没有交叉反应。本发明所述环引物是在外内引物的基础上设计的。
在本发明中，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μL LAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水。本发明所述引物混合物中包括外引物对F3和B3以及内引物对FIP和BIP，还包括环引物LF或/和LB。
在本发明中，针对RHDV1的引物混合物的配置包括如下步骤：将各引物稀释到100μM；加入FIP/BIP各12μL，F3/B3各2μL，LB 6μL，再加入无酶水至总体积为100μL，即得RHDV1的引物混合物。
在本发明中，对RHDV2的引物混合物的配置包括如下步骤：将各引物稀释到100μM；加入FIP/BIP各8μL，F3/B3各2μL，LF/LB各6μL，再
加入无酶水至总体积为100μL，即得RHDV2的引物混合物。
在本发明中，针对RHDV1的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP、BIP的终浓度分别为1200nM，环引物LB的终浓度为600nM；针对RHDV2的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为800nM，环引物LF和LB的终浓度分别为600nM。
在本发明中，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括LAMP扩增产物、RNA酶抑制剂、NEBuffer 2.1、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子。本发明所述LAMP扩增产物是样品中提取的RNA在所述LAMP扩增体系中扩增出的产物，所述LAMP扩增产物的用量为1~3μL。本发明所述RNA酶抑制剂的浓度为0.2~0.8U/μL，用量为0.5~1.5μL。本发明所述gRNA浓度为450~550nM，用量为1.5~2.5μL。本发明所述NEBuffer 2.1用量为1~3μL。本发明所述Cas12a蛋白用量为0.5~1.5μL，浓度为50~250nM。本发明所述ssDNA报告分子用量为0.5~1.5μL，浓度为50~300nM。本发明针对LAMP扩增出的片段设计gRNA（由间隔序列和重复序列组成，间隔序列一般为PAM序列后20-21个碱基）和ssDNA探针（5’FAM-TTATT-BHQ1 3’或5’6-FAM-TTATT-Biotin 3’）。本发明通过CRISPR/Cas12a切割实验产生荧光的情况筛选gRNA和优化Cas12a蛋白浓度。
在本发明中，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。本发明所述侧流层析试纸条为适应于兔出血症病毒检测的试纸条。本发明所述试纸条优选为CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(购自沃博生物公司（中国南京），JY0301)，该试纸条的加样垫加胶体金标记的小鼠抗FAM抗体，C线标记链霉亲和素，T线标记抗小鼠IgG抗体。本发明试剂盒中含有试纸条时，所述ssDNA探针为生物素ssDNA探针（5’6-FAM-TTATT-Biotin 3’）。本发明利用试纸条判断结果的原理为：当所述ssDNA报告分子未被切开时，质控线的链霉亲和素与ssDNA上的生物素结合将其捕获，此时C线显色；当ssDNA报告分子由于Cas12a被激活的反式切割能力被切开时，断开的FAM端继续向上涌动，检测线上的抗小鼠IgG抗体与结合在FAM上的胶体金标记的小鼠抗体结合，捕获带有胶体金的FAM端，此时T线显色；只有C线显色时为阴性，只有T线显色时为阳性。
本发明还提供基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV1和RHDV2的非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：（1）提取待检测样本的RNA；（2）以步骤（1）提取的RNA为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增；（3）将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测。本发明将LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与LFA结合，实现可视化，构建出便携式检测平台，本发明还可对酶切完成后的CRISPR/Cas12a检测体系进行蓝光仪检测实现荧光可视化，示意图见图1。本发明对RHDV 1型和RHDV 2型设定在两个不同的体系中检测，即RHDV 1型检测体系和RHDV 2型检测体系。
在本发明中，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μL LAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水。本发明所述引物混合物中包含外引物对、内引物对和/或环引物。本发明针对RHDV1，外引物对：内引物：环引物对体积比为1：6：1.5或1：6：3；针对RHDV2，外引物对：内引物对体积比为1：4：3。本发明针对RHDV1，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP、BIP的终浓度分别为1200nM，环引物LB的终浓度为600nM；针对RHDV2，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为800nM，环引物LF和LB的终浓度分别为600nM。
在本发明中，所述LAMP扩增反应条件为65~69℃反应25~35min，优选为67℃反应30min。
在本发明中，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μLRNA酶抑制剂（0.5U/μL）、2μL gRNA（500nM）、2μL NEBuffer 2.1、1μL Cas12a蛋白（125nM）、1μL ssDNA报告分子（250nM荧光猝灭探针/100nM生物素探针）。
在本发明中，所述CRISPR/Cas12a检测体系中反应条件为35~38℃孵育25~35min。
在本发明中，所述LAMP即环介导等温扩增技术是目前应用最广的等温扩增技术，用水浴锅即可在短时间内完成扩增，且扩增效率比普通PCR更高2~5，搭配染料能使检测结果可视化；所述CRISPR/Cas12a技术可以用于基因编辑，也可以用于病原检测，是最常见与等温扩增技术耦联以增加特异性的检测方法，Cas12a蛋白与gRNA结合后进一步与靶序列结合，激活切割活性，不仅可以特异性地切割靶标核酸，还能不加区分地切割附近的ssDNA探针，如果给ssDNA两端加上荧光素和猝灭剂，被切割后，荧光基团发光，即可指向阳性结果。本发明在LAMP结合CRISPR/Cas12a技术基础上，与侧向层析试纸条关联，更加直观的检测结果。
本发明还提供所述试剂盒和所述检测方法在鉴别RHDV1和RHDV2中的应用。
在本发明中，若无特殊说明，所有的组分或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、LAMP引物的设计
LAMP引物包括两个外引物F3和B3，两个内引物FIP和BIP以及可能存在的环引物LF和LB。分别针对RHDV1(分离株WF2007，GenBank登录号：FJ794180)和RHDV2(分离株SC2020/04，GenBank登录号：MT383749)设计了保守片段VP60的多组引物，针对RHDV1和RHDV2分别设计了引物组1（Set 1）、引物组2（Set 2）、引物组3（Set 3），如表1。引物序列均合成自金斯瑞生物科技公司（中国南京）。
表1 LAMP引物序列
| 病毒引物 | 序列 |
| RHDV1（Set 1）F3 | TCCCTGACATGTCATTCGTG（SEQ ID No.1） |
| RHDV1（Set 1）B3 | GGTTTGTGCCGGTTACCAC（SEQ ID No.2） |
| RHDV1（Set 1）FIP | CGGGGGCACCGTTGTTACTGTTAACAGCCCCAACATTCCG（SEQ ID No.3） |
| RHDV1（Set 1）BIP | AGTTAGGTTTTGCCACTGGGGCCAGTCTGTGCACCTGAAGTG（SEQ ID No.4） |
| RHDV1（Set 1）LF | ACCACCAAACCCGACCCAC（SEQ ID No.5） |
| RHDV1（Set 1）LB | AACAGCCTCCAGCCCACCA（SEQ ID No.6） |
| RHDV1（Set 2）F3 | GCATGCAGTTCCGCTTCA（SEQ ID No.7） |
| RHDV1（Set 2）B3 | ACTAGTGTGGGGACAAGGC（SEQ ID No.8） |
| RHDV1（Set 2）FIP | CTCCAACCCTGGCCCAATCTCGTGTGTTTGGTGGGCGAC（SEQ ID No.9） |
| RHDV1（Set 2）BIP | CGCCCGTTCACTCGAACCTGCAGGGTCACCAGTTGGATG（SEQ ID No.10） |
| RHDV1（Set 2）LF | CCTGGTGGTATCACAGCCGC（SEQ ID No.11） |
| RHDV1（Set 2）LB | TCACCATGCCAGACTTGCGT（SEQ ID No.12） |
| RHDV1（Set 3）F3 | AACGGCAGCACATATGGC（SEQ ID No.13） |
| RHDV1（Set 3）B3 | GCTGTTAAAGGGCACGAATG（SEQ ID No.14） |
| RHDV1（Set 3）FIP | ACGTTGGTGGAGTTGTTCCCAGTTTGCCGACATTGACCATCG（SEQ ID No.15） |
| RHDV1（Set 3）BIP | GGTACGCTAATGCTGGGTCTGCATGTCAGGGAAGCCGTCT（SEQ ID No.16） |
| RHDV1（Set 3）LB | GATTGACAACCCTATCTCCCAGGTT（SEQ ID No.17） |
| RHDV2（Set 1）F3 | ACCACCGGGCATTGAGAT（SEQ ID No.18） |
| RHDV2（Set 1）B3 | TCGTGGATCCACCAAATGG（SEQ ID No.19） |
| RHDV2（Set 1）FIP | TGACTGGTTCGAGTGAACGAGCTGGGCCAGGTTTGGAAGT（SEQ ID No.20） |
| RHDV2（Set 1）BIP | GCGCCCCAACATGTACCACCAACGCTCAGGACCAACGT（SEQ ID No.21） |
| RHDV2（Set 1）LF | TGACAACATGAGGGAATTGTCTG（SEQ ID No.22） |
| RHDV2（Set 1）LB | CAACAGGCAACCCTGGC（SEQ ID No.23） |
| RHDV2（Set 2）F3 | ATGCTAGTGCCGGGTCTG（SEQ ID No.24） |
| RHDV2（Set 2）B3 | GTTGCTCGGTACTCCAGTG（SEQ ID No.25） |
| RHDV2（Set 2）FIP | GGTAGGGATGGTGATACCGCTGAACCCCATCTCCCAAATTGC（SEQ ID No.26） |
| RHDV2（Set 2）BIP | GGTCGGGTTCGGTGGGATCTTAAGCCTGCATGGTCGTGA（SEQ ID No.27） |
| RHDV2（Set 2）LF | TGACATGTCAGGGAAACCATCTGG（SEQ ID No.28） |
| RHDV2（Set 2）LB | AACAGCAGTAATGGTGCCCCC（SEQ ID No.29） |
| RHDV2（Set 3）F3 | CATGTACCACCCAACAGGC（SEQ ID No.30） |
| RHDV2（Set 3）B3 | GTGAGAACTGGGGTTGTGAG（SEQ ID No.31） |
| RHDV2（Set 3）FIP | CTCGTGGATCCACCAAATGGGTGTTCCCACGTTGGTCCTG（SEQ ID No.32） |
| RHDV2（Set 3）BIP | AGTTTGTGATGATCCGTGCCCCGAGATCTGCGGGCGAGAT（SEQ ID No.33） |
| RHDV2（Set 3）LF | TGATGAGGTTGTTGTAAACGCT（SEQ ID No.34） |
| RHDV2（Set 3）LB | TCCAGTAAGACCGTTGACTCG（SEQ ID No.35） |
2、RNA模板的提取
利用RNA提取试剂盒（购自诺唯赞生物公司（中国南京））分别提取RHDV1和RHDV2毒株（本实验室保存）的RNA，RHDV1病毒株中提取的RNA浓度为218.6ng/μL，RHDV2病毒株中提取的RNA浓度为158.8ng/μL，用于后续实验。
3、针对RHDV1和RHDV2建立LAMP扩增方法并进行引物和反应条件的优化
（1）LAMP扩增步骤：以步骤2中提取的RNA为模板，用设计的引物按表2中的反应体系加样后混匀，于恒温振荡箱67℃反应30min。其中，针对RHDV1的引物混合物的配置包括如下步骤：将各引物稀释到100μM；加入FIP/BIP各12μL，F3/B3各2μL，LB/LF各6μL或LB 6μL，再加入无酶水至总体积为100μL，即得RHDV1的引物混合物。针对RHDV2的引物混合物的配置包括如下步骤：将各引物稀释到100μM；加入FIP/BIP各8μL，F3/B3各2μL，LF/LB各6μL，再加入无酶水至总体积为100μL，即得RHDV2的引物混合物。针对RHDV1和RHDV2的LAMP扩增体系以及各引物体积和终浓度见表2~表4。
表2 LAMP扩增体系
| 体系组分 | 体积 | 初始浓度 |
| LAMP/RT-LAMP 2X预混液 | 12.5μL | / |
| 引物混合物 | 2.5μL | / |
| 提取的RNA | 2μL | RHDV1 218.6ng/μL或RHDV2 158.8ng/μL |
| 无酶水 | 8μL | / |
表3 针对RHDV1的LAMP扩增体系中各引物体积和终浓度
| 引物 | 初始浓度 | 体积 | 终浓度 |
| FIP | 100μM | 0.3μL | 1.2μM |
| BIP | 100μM | 0.3μL | 1.2μM |
| F3 | 100μM | 0.05μL | 0.2μM |
| B3 | 100μM | 0.05μL | 0.2μM |
| LB/LF或LB | 100μM/100μM或100μM | 0.15μL/0.15μL或0.15μL | 0.6μM/0.6μM或0.6μM |
表4 针对RHDV2的LAMP扩增体系中各引物体积和终浓度
| 引物 | 初始浓度 | 体积 | 终浓度 |
| FIP | 100μM | 0.2μL | 0.8μM |
| BIP | 100μM | 0.2μL | 0.8μM |
| F3 | 100μM | 0.05μL | 0.2μM |
| B3 | 100μM | 0.05μL | 0.2μM |
| LF | 100μM | 0.15μL | 0.6μM |
| LB | 100μM | 0.15μL | 0.6μM |
（2）引物筛选：基于步骤1设计的引物和步骤3（1）LAMP扩增步骤，设定在LAMP体系中加入核酸染料SYTO9（终浓度250nM），在Quant Studio 1系统的监测下通过荧光值的变化选出效率最高的引物组，并且确保RHDV1和RHDV2体系之间没有交叉反应。实验过程以水为阴性对照。结果见图2。
由图2可知，扩增效率最高的引物为RHDV1的引物组3，RHDV2的引物组2。
用选出的针对RHDV1的引物组3和针对RHDV2的引物组2分别扩增RHDV1和RHDV2的核酸，进行交叉实验。对扩增后的结果进行凝胶电泳分析和荧光值分析。结果见图3。
由图3可知，用凝胶电泳检验交叉实验，用选出的针对RHDV1的引物组3扩增RHDV1时可得到与预期相符的梯形条带，扩增RHDV2时无条带，用选出的针对RHDV2的引物组2分别扩增RHDV1和RHDV2的核酸，扩增RHDV1时无条带，扩增RHDV2时可得到与预期相符的梯形条带；用荧光LAMP进行交叉实验，结果显示只有用针对RHDV1的引物组扩增RHDV1核酸，用针对RHDV2的引物组扩增RHDV2核酸时，荧光值才有明显的上升。以上结果说明所选出的两个引物组有较好的专一性。
（3）反应温度、内外引物浓度比、环引物浓度的筛选
基于筛选出的引物组和上述扩增步骤、LAMP扩增体系，通过荧光值的变化趋势选出最优反应温度、外内引物浓度比、环引物浓度的反应条件。其中筛选的反应温度设定为：61℃、63℃、65℃、67℃、69℃；筛选的外内引物浓度比设定为：200nM:400nM、200nM:800nM、200nM:1200nM、200nM:1600nM、200nM:2000nM；筛选的环引物浓度分别为200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM。实验过程以水为阴性对照。结果如图4-7。
由图4-7可知，针对RHDV1的最佳反应条件为67℃、外引物：内引物=1:6（200nM:1200 nM）、环引物浓度为600nM，针对RHDV2的最佳反应条件为67℃、外引物：内引物=1:4（200nM:800 nM）、环引物浓度为600nM。在LAMP体系中加入中性红染料后可以实现结果的可视化，阴阳性结果之间有明显的颜色差别。
4、针对RHDV1和RHDV2建立CRISPR/Cas12a检测方法并进行反应体系的优化
（1）gRNA和ssDNA探针设计
分别以优选LAMP阶段扩增出的RHDV1和RHDV2的目的片段设计gRNA，分别设计两个gRNA（gRNA1和gRNA2）（由间隔序列和重复序列组成，间隔序列一般为PAM序列后20-21个碱基），设计ssDNA探针（5’FAM-TTATT-BHQ1 3’）。gRNA和ssDNA探针序列均合成自金斯瑞生物科技公司（中国南京），见表5，该表序列中的U在相应序列表中为T。
表5 gRNA序列
| 病毒 | PAM | 序列 |
| RHDV1的gRNA1 | TTTG | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCGACAUUGACCAUCGAAGA（SEQ ID No.36） |
| RHDV1的gRNA2 | TTTG | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUACGCUAAUGCUGGGUCUG（SEQ ID No.37） |
| RHDV2的gRNA1 | TTTG | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUACCCUUCAGCGGUAUCACCA（SEQ ID No.38） |
| RHDV2的gRNA2 | TTTC | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCUGACAUGUCAUUUGUACCC（SEQ ID No.39） |
（2）CRISPR/Cas12a检测步骤：以选出的最优LAMP扩增体系和扩增条件扩增出的片段为模板，按表6中的反应体系加样后混匀，37℃孵育30min，得反应物溶液。
表6 CRISPR/Cas12a检测体系
| 体系组分 | 体积 | 终浓度 |
| LAMP扩增产物 | 2μL | / |
| RNA酶抑制剂 | 1μL | 0.5U/μL |
| gRNA | 2μL | 500nM |
| NEBuffer 2.1 | 2μL | / |
| Cas12a蛋白 | 1μL | 125nM |
| ssDNA报告分子 | 1μL | 250nM |
| 无酶水 | 11μL | / |
（3）通过CRISPR/Cas12a切割实验产生荧光的情况筛选gRNA和优化Cas12a蛋白浓度：基于步骤4（1）中的引物gRNA和步骤4（2）检测步骤，使用QuantStudio 1记录荧光值的变化以及蓝色荧光灯照射，通过荧光曲线图和是否发荧光进行结果判断，并且确保RHDV1和RHDV2体系之间没有交叉反应。验证产生的荧光是由gRNA引导Cas12a蛋白与目标片段结合激活其反式切割活性，非特异地切割周围的ssDNA产生。实验过程以水为阴性对照，LAMP阶段以无酶水为模板扩增的产物为LAMP-NC。
分别对RHDV1和RHDV2的gRNA1和gRNA2进行优化筛选，同时设置3个Cas12a蛋白浓度（50nM、125nM、250nM）进行正交实验，结果见图8。由图8可知，在三个不同的Cas12a浓度下，针对RHDV1设计的gRNA中，gRNA2均显示出更高的切割产生荧光的效率，针对RHDV2设计的gRNA中，gRNA2均显示出更高的切割产生荧光的效率；当Cas12a浓度从50nM提升到125nM时，产生的荧光值显著提高（P<0.05），再将Cas12a浓度进一步提升到250nM时，产生的荧光值相较于125nM时差异不显著（P>0.05），故将Cas12a蛋白的反应浓度定为125nM。
用选出的gRNA进行Cas12a蛋白反式切割活性验证和RHDV1反应体系与RHDV2反应体系之间的交叉实验。分别用以选出的最优LAMP扩增体系和扩增条件扩增出的产物作为RHDV1和RHDV2体系CRISPR/Cas12a切割实验的模板，以无酶水为模板作为阴性对照，用QuantStudio 1系统检测产生的荧光。结果见图8。结果显示只有当模板为RHDV1引物扩增RHDV1核酸和RHDV2引物扩增RHDV2核酸的产物时，体系中有明显的荧光值增加，在蓝光下观测也是一样的结果，该结果表明RHDV1和RHDV2体系在CRISPR/Cas12a切割实验阶段产生的荧光是在相应的gRNA的引导下，Cas12a蛋白与目标片段结合而激发的反式切割活性产生的，并且在该阶段，RHDV1与RHDV2体系之间也无交叉反应。
实施例2 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒1
该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系。
LAMP扩增体系总体积为25μL，含有12.5μL LAMP/RT-LAMP 2X预混液，2.5μL引物混合物，2μL提取的RNA和8μL无酶水。针对RHDV1的LAMP扩增体系中，所用引物组见表1中RHDV1引物组3；外引物对F3和B3终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP终浓度分别为1200nM，环引物LB终浓度为600nM；针对RHDV2的LAMP扩增体系中，所用引物组见表1中RHDV1引物组2；外引物对F3和B3终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP终浓度分别为800nM，环引物LF和LB终浓度分别为600nM。
CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，含有2μL LAMP扩增产物、1μL RNA酶抑制剂（终浓度0.5U/μL）、2μL gRNA（终浓度500nM）、2μL NEBuffer 2.1、1μL Cas12a蛋白（终浓度125nM）、1μL ssDNA报告分子（终浓度250nM荧光猝灭探针/100nM生物素探针）。其中，针对RHDV1，所用gRNA见表5中RHDV1 gRNA2；针对RHDV2，所用gRNA见表5中RHDV2 gRNA2。
实施例3 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒2
试剂盒除含有实施例2所述的体系外，还含有侧流层析试纸条。所述侧流层析试纸条为CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条(购自沃博生物公司（中国南京），JY0301)。LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系与实施例2相同，其中荧光猝灭ssDNA探针替换成生物素ssDNA探针（5’6-FAM-TTATT-Biotin3’）。
实施例4
基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的的方法，包括如下步骤：
（1）用RNA提取试剂盒（购自诺唯赞生物公司（中国南京））提取待检测样本的RNA溶液；
（2）将提取的RNA溶液加入到实施例2或3所述的LAMP扩增体系中混合均匀，于恒温振荡箱67℃反应30min，得到LAMP扩增产物；
（3）将得到的LAMP扩增产物加入到实施例2或3所述的CRISPR/Cas12a检测体系中混合均匀，37℃孵育30min进行酶切反应，得酶切后的反应物溶液；
（4）将反应物溶液使用蓝光仪(LABGIC兰杰柯，中国北京)照射，当反应物溶液有荧光，表明为阳性，当反应物溶液无荧光，表明为阴性；
还可以将实施例3所述的侧流层析试纸条按照如下操作放于反应物溶液中，仅T线显色时为阳性，仅C线显色时为阴性。操作步骤包括：取反应溶液5μL，加入45μL无酶水，插入侧流层析试纸条显色。
实施例5 对建立的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法进行方法学评价
（1）特异性实验：采用实施例4所述方法提取RHDV1、RHDV2、大肠杆菌（E.coli）、伤寒沙门氏菌（S.typhi）、肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、轮状病毒（RV）7种病原体（由本实验室保存）的核酸进行LAMP-CRISPR/Cas12a检测，验证建立的检测方法的特异性。实验过程以水为阴性对照。结果见图9。结果表明，用针对RHDV1的检测方法进行检测时，只有RHDV1为阳性，其他病原体为阴性；用针对RHDV2的检测方法进行检测时，只有RHDV2为阳性，其他病原体为阴性；在蓝光下看到的结果与试纸条显示的结果一致。这表明针对RHDV1和RHDV2建立的检测方法均具有高度特异性。
（2）敏感性实验：用RHDV 1分离株WF2007、RHDV 2分离株SC 2020/04 VP60基因全长引物克隆目的基因，将扩增到的基因序列连接到pMD18-T载体上，筛选并测序后获得阳性pMD18-T-WF2007-VP60、pMD18-T-SC2020-VP60重组质粒。将重组质粒用Nano drop进行浓度测定并计算拷贝数，用dd H2O将重组质粒稀释至1×1010 copies/μL，作为模板标准品。使用10倍比稀释（1×106拷贝/μL-1×100拷贝/μL）的RHDV1和RHDV2的VP60全长质粒作为检测模板，采用实施例4所述方法（将提取的RNA溶液更换为重组质粒）进行检测。实验过程以水为阴性对照。结果见图10。结果表明，所建立的针对RHDV1和RHDV2的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法最低可检测出1×101拷贝/μL的dsDNA模板，在蓝光下看到的结果与试纸条显示的结果一致。
实施例6临床样品检测
用qPCR方法和LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法对来自不同地区和养殖场的74份临床样品进行检测，比较qPCR方法和建立的LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的符合率和敏感性。水作为阴性对照（NC），浓度为1×105copies/μL标准阳性质粒（RHDV1或RHDV2）为阳性对照（PC）
LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法同实施例4。
qPCR检测步骤包括：按照Vazyme FastPure Cell/Tissue Total RNA IsolationKit V2说明书要求，对74份临床样本进行RNA提取，以qPCR引物进行qPCR扩增。在QuantStudio 1荧光定量PCR仪中检测各组织样品中病毒RNA的绝对表达量，进而确定不同组织样品中病毒含量。每个样品均进行三次重复检测。TaqMan探针实时荧光定量PCR方法阳性对照品Ct值≤35且扩增曲线有明显对数增长期；同时阴性对照扩增曲线无对数增长期的情况下，检测样品的Ct值≤35.0，且出现标准的S形扩增曲线，判定样品中存在RHDV1或/和RHDV2核酸；无Ct值或Ct值＞38，且无标准扩增曲线，则判断为RHDV1或/和RHDV2核酸阴性。当检测样品35.0≤Ct值≤38，且扩增曲线均呈标准的S形曲线，判为可疑，需进行一次重复实验，如重复后仍然为上述结果，判为阳性，否则判为阴性。
其中，qPCR引物序列为VP60基因序列上游引物RHDV-F1：5′-TGGARMTWGGYTTRAGTGTDGAYG-3′（SEQ ID No.40）；下游引物：RHDV-R1：5′-CAGACATAAGAAAARCCATTGGYTG-3′（SEQ ID No.41）；RHDV1探针序列：5′-FAM-TGAYTGAACTCATTGAYGTACGCCC-BHQ1-3′（5′-FAM-SEQ ID No.42-BHQ1-3′）；RHDV2探针序列：5′-VIC-TGTCAGAMCTTGTTGACATCCGCC-BHQ2-3′（5′-VIC-SEQ ID No.43-BHQ2-3′）；引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上述序列中R代表A或G，M代表A或C，W代表A或T，Y代表C或T，D代表G或A或T。
qPCR扩增反应体系如下：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10µL，上、下游引物(10µmol/L)各0.6µL，ROX染料II(50×)0.4µL，荧光探针（10µmol/L）各0.8µL，RNA产物2μL，ddH2O 4μL。qPCR扩增反应程序如下：42℃ 5 min，95℃ 10 s；95℃5s，60℃ 34s，40个循环。
通过QuantStudio 1监测两个检测方法获得的反应物溶液的荧光；通过蓝光照射反应物溶液和侧向层析试纸条检测反应物溶液，结果如图11。结果显示，使用RHDV1的检测系统时，本发明建立的方法检测出19份RHDV1阳性样，qPCR方法检测出17份RHDV1阳性样本，两种检测方法的符合率为97.30%；使用RHDV2的检测系统时，本发明建立的方法检测出32份RHDV2阳性样，qPCR方法检测出30份RHDV2阳性样本，两种检测方法的符合率为97.30%；两个检测系统肉眼直接观察蓝光下荧光和侧向层析试纸条的结果均一致，这两种读出策略得到了相互验证。与qPCR方法的符合率也验证了该检测方法的稳定性和可靠性，表明了本发明构建的检测方法可视为检测和鉴别RHDV1和RHDV2一种新诊断方法，在临床实践中具有可行性。
本发明所有数据均采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，不同组间采用单因素方差分析(ANOVA)。所有实验至少重复3次，数据以均数±标准差表示。当p值<0.05时，差异被视为具有统计学意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
所述LAMP扩增体系中包括外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP；针对RHDV1的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.15-16所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.24-25所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.26-27所示；
所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括gRNA；针对RHDV1的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；针对RHDV2的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括环引物LF和/或LB；针对RHDV1的LAMP扩增体系中环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中环引物LF和LB的核苷酸序列如SEQ ID No.28-29所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增体系中还包括LAMP/RT-LAMP2X预混液、待检核酸和无酶水。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系还包括LAMP扩增产物、RNA酶抑制剂、NEBuffer 2.1、Cas12a蛋白、ssDNA报告分子和无酶水。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
6.如权利要求1~5任意一项所述的试剂盒在制备鉴别RHDV1和RHDV2产品中的应用。
7.基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待检测样本的RNA；
（2）以步骤（1）提取的RNA为模板，在LAMP扩增体系中进行LAMP扩增；
（3）将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行荧光检测；
或将步骤（2）得到的LAMP扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中酶切并进行侧流层析试纸条检测；
所述LAMP扩增体系中包括外引物对F3和B3，内引物对FIP和BIP；针对RHDV1的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.13-14所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.15-16所示；针对RHDV2的LAMP扩增体系中外引物对F3和B3的核苷酸序列如SEQ ID No.24-25所示，内引物对FIP和BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.26-27所示；
所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括gRNA；针对RHDV1的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；针对RHDV2的CRISPR/Cas12a检测体系中gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增体系总体积为25μL，12.5μLLAMP/RT-LAMP 2X预混液、2.5μL引物混合物、2μL提取的RNA和8μL无酶水；
针对RHDV1的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为1200nM；针对RHDV2的LAMP扩增体系中，外引物对F3和B3的终浓度分别为200nM，内引物对FIP和BIP的终浓度分别为800nM。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行荧光检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度250nM的荧光猝灭ssDNA报告分子和11μL无酶水。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行侧流层析试纸条检测时，所述CRISPR/Cas12a检测体系总体积为20μL，2μL LAMP扩增产物、1μL终浓度0.5U/μL的RNA酶抑制剂、2μL终浓度500nM的gRNA、2μL NEBuffer 2.1、1μL终浓度125nM的Cas12a蛋白、1μL终浓度100nM的生物素ssDNA报告分子和11μL无酶水。
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