CN113308576A - 一种基于数字pcr检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于数字pcr检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。本发明自行设计了裂谷热病毒数字PCR引物和探针，并建立了裂谷热病毒数字PCR检测方法，方法灵敏度为150copies/mL，与血液样本中虫媒病毒无交叉反应，能直接计算临床样本中裂谷热病毒的拷贝数，无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量，建立的方法具有较高准确性、灵敏度、特异性和临床适用性。

Description

一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
裂谷热(Rift Valley Fever)是由裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus，RVFV)引起、由节肢动物传播的急性传染病，可感染多种脊椎动物。1931年首次在肯尼亚证实了本病的存在，并分离到病毒。人感染裂谷热病毒后临床特点为突然发热(常为双相热)、头痛、肌肉关节疼痛等，重症病例可表现为多脏器受累。本病主要流行于非洲，亚洲中东地区也有报道。我国于2016年7月23日通报了首例输入性裂谷热病例。
RVFV为RNA病毒，属于布尼亚病毒科白蛉病毒属。病毒直径约90～110nm，球形，有包膜。基因组为分节段的单股RNA，分为L、M、S三个片段，长度分别为6.4kb、1.7kb和3.9kb，其中L和M片段为负链RNA，S片段为双义RNA。L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶，M片段可编码至少4种产物：糖蛋白Gn和Gc、NSm和一种NSm与Gn的融合蛋白，S片段编码病毒核蛋白和NSs。目前国内采用实时荧光RT-PCR等核酸扩增方法对裂谷热病例进行核酸检测。
数字PCR技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统实时荧光PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统实时荧光PCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性，数字PCR迅速得到广泛的应用，在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可。而且其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、高通量测序文库精确定量和结果验证等诸多方面也具有广阔应用前景，已经受到越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR引物和探针；
所述数字PCR引物及探针的序列为：
上游引物RVFV-f：5’-GAAAATTCCTGAGACACATGGCAT-3’；
下游引物RVFV-r：5’-TTCCACTTCCTTGCATCATCTGA-3’；
探针RVFV-p：5’-CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATT-3’。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述探针的5’标记FAM，3’标记BHQ1。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括数字PCR预混液、逆转录酶、上下游引物、探针、H2O和模板。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中各组分的含量为：数字PCR预混液11.5μL、逆转录酶1μL、上下游引物各0.4μL、探针0.4μL、H2O 4.3μL和模板2μL，终体系20μL。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述上下游引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2μM。
本发明还提供一种利用所述试剂盒检测裂谷热病毒的方法，其具体检测方法包括如下步骤：
(1)提取裂谷热病毒RNA；
(2)制备含有核酸样品的数字PCR反应体系；
(3)制备微滴；
(4)数字PCR扩增；
(5)读取微滴的荧光信号，分析和确定裂谷热病毒的靶标拷贝数。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述扩增反应程序为：97℃10min；95.3℃30s，54℃60s，40个循环；98℃10min；20℃1min。
本发明的有益效果：
本发明自行设计了裂谷热病毒数字PCR引物和探针，建立了裂谷热病毒数字PCR检测方法，方法灵敏度为150copies/mL，与血液样本中虫媒病毒无交叉反应，能检出临床样本中裂谷热病毒，建立的方法具有较高准确性、灵敏度、特异性和临床适用性。
附图说明
图1：裂谷热病毒的数字PCR法分析结果图；从左向右依次为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101病毒样本。
图2：裂谷热病毒的荧光PCR法分析结果图；从左向右依次为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101病毒样本。
图3：裂谷热病毒临床样本数字PCR验证结果图；其中A：裂谷热病毒毒株；B：裂谷热阳性血清；C：阴性对照。
图4：特异性评价实验结果图。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1裂谷热病毒数字PCR序列和反应程序
分析裂谷热病毒保守性，在L片段设计数字PCR引物和探针序列。
上游引物序列RVFV-f：5’-GAAAATTCCTGAGACACATGGCAT-3’(SEQ ID NO:1)；
下游引物序列RVFV-r：5’-TTCCACTTCCTTGCATCATCTGA-3’(SEQ ID NO:2)；
探针序列RVFV-p：5’-CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATT-3’(SEQ ID NO:3)，其中5’标记FAM，3’标记BHQ1。
使用苏州锐讯数字PCR通用试剂盒，终体系20μL，包括数字PCR预混液11.5μL、逆转录酶1μL、上下游引物各0.4μL(终浓度0.4μM)、探针0.4μL(终浓度0.2μM)、H2O 4.3μL和模板2μL。将以上配置好的体系加入到数字PCR芯片中(DropDx-2044HT)，并用矿物油覆盖芯片，密封好并确保无泄漏。再把芯片放到数字PCR仪器上，并设置反应程序：97℃10min；95.3℃30s，54℃60s，40个循环；98℃10min；20℃1min。
实施例2准确性和灵敏度试验
裂谷热假病毒质粒合成于上海生工生物，该假病毒质粒含有完整的L片段序列。将人基因组RNA、假病毒质粒按照一定比例进行混合分别形成假病毒含量为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/mL的参考品。将上述的假病毒参考品作为模板进行实验，评价该方法的准确性和灵敏度。根据检测拷贝数和理论拷贝数做标准曲线和线性回归系数R2值。
根据数字PCR检测病毒含量与理论病毒含量进行拟合，其线性回归系数R2为0.998，表明在该条件下，裂谷热假病毒的理论值病毒含量和实际检测病毒含量呈现出很好的线性关系(表1)，显示建立的数字PCR检测方法具有很好的准确性。
表1假病毒参考品准确性的数字PCR检测结果
样本名称(copies/mL) 裂谷热假病毒含量检测结果(copies/mL)
假病毒含量参考品：1×10<sup>5</sup> 2.26×10<sup>5</sup>
假病毒含量参考品：1×10<sup>4</sup> 2.4×10<sup>4</sup>
假病毒含量参考品：1×10<sup>3</sup> 2.28×10<sup>3</sup>
假病毒含量参考品：1×10<sup>2</sup> 1.53×10<sup>2</sup>
实施例3与荧光PCR方法比较
将数字PCR与荧光PCR的检测结果进行平行比较，检测结果显示裂谷热病毒数字PCR和荧光PCR均能检测到100copies/mL以上病毒含量的样本(图1、图2)，但荧光PCR对1×102病毒含量的样本重复性不好，3次重复仅有1次检出，而数字PCR 3次重复均能检出，并可直接实现样本中的病毒核酸定量。
实施例4对裂谷热临床阳性样本验证
使用实验室保存的裂谷热阳性血清和裂谷热病毒培养物提取的核酸，利用数字PCR检测方法进行检测，结果均为阳性(图3)。
实施例5特异性实验
经序列同源性比对，所选用的引物和探针与其他的登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒等虫媒病毒无同源性。对登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒阳性血清样本与健康人群核酸样本进行特异性评价，结果均为阴性，显示较好的特异性(图4)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州海关技术中心
<120> 一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒及其检测方法
<130> 2021.6.8
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaaaattcct gagacacatg gcat 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttccacttcc ttgcatcatc tga 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cacaagtcca cacaggcccc ttacatt 27

Claims (7)

1.一种基于数字PCR检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括数字PCR引物和探针；
所述数字PCR引物及探针的序列为：
上游引物RVFV-f：5’-GAAAATTCCTGAGACACATGGCAT-3’；
下游引物RVFV-r：5’-TTCCACTTCCTTGCATCATCTGA-3’；
探针RVFV-p：5’-CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATT-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’标记FAM，3’标记BHQ1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括数字PCR预混液、逆转录酶、上下游引物、探针、H2O和模板。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分的含量为：数字PCR预混液11.5μL、逆转录酶1μL、上下游引物各0.4μL、探针0.4μL、H2O 4.3μL和模板2μL，终体系20μL。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述上下游引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.2μM。
6.一种利用权利要求1-5任一所述试剂盒检测裂谷热病毒的方法，其特征在于，其具体检测方法包括如下步骤：
(1)提取裂谷热病毒RNA；
(2)制备含有核酸样品的数字PCR反应体系；
(3)制备微滴；
(4)数字PCR扩增；
(5)读取微滴的荧光信号，分析和确定裂谷热病毒的靶标拷贝数。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应程序为：97℃10min；95.3℃30s，54℃60s，40个循环；98℃10min；20℃1min。
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