CN114107567A - 一种病毒核酸突变检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒Delta毒株的特异检测方法及应用。该特异性检测方法，包括Cas12蛋白、特异性非天然导向RNA、DNA报告探针及反应缓冲液体系。本发明可以实现对新型冠状病毒野生型与Delta突变型病毒毒株的高效区分。

Description

一种病毒核酸突变检测方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定病毒突变位点或毒株的特异性非天然导向RNA、体系、试剂盒及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是基因变异的最常见形式，与疾病状态或药物反应密切相关。单核苷酸多态性在病毒进化及传播中发挥重要作用，并且对突变毒株单核苷酸多态性水平的精准检测对疫病防控至关重用。因此，SNP检测对于早期诊断，临床预后和疾病预防非常重要。迫切需要研究人员开发简单、快速和有效的技术，以允许在医疗现场进行灵敏和特异性的基因分型和SNP定量。
新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta(B.1.617.2)变体，于2020年底在印度被发现。Delta毒株具有高度传染性，其传染性是之前变体和原始毒株的2倍以上。Delta毒株由SARS-CoV-2的刺突蛋白中的19R、(G142D)、156del、157del、R158G、L452R、T478K、E484Q、P681R、D950N突变定义。其中一些突变可能会影响针对受体结合蛋白(452和478)的关键抗原区域和部分N末端结构域(156和157)缺失的免疫反应。其中，P681R突变直接改变弗林蛋白酶裂解位点邻近的氨基酸，这是病毒侵入人体细胞的关键步骤，从而增强病毒的传染性。该毒株在暴露四天后首次在感染者中检测到，而在原始毒株感染者中平均为6天，这表明Delta毒株的复制增强。感染此变体的个体的病毒载量比感染原始毒株的人的病毒载量高出1260倍。Delta变体导致全球病例的激增。
目前，有多种方法可用于单核苷酸多态性(SNP)基因分型，每种方法都有其优点和局限性。例如，基于核酸测序技术能准确鉴定SNP，但该方法耗时长且需送到专业机构完成，无法在临床一线使用；基于等位基因特异性qPCR技术，虽然可以鉴定部分多位点突变，但对单位点突变的检测准确性很低。此外，大多数现有方法或者灵敏度低或者特异性差，有效的SNP鉴别通常需要使用专门的设备，训练有素的人员以及严格的实验条件和精确的温度控制。另外，还有一些现有方法存在高耗时、高费用和高复杂性的问题，使得它们在资源受限的情况下得不到实际应用。因此，急需开发高准确性、快速、简便易用的核酸突变检测技术方案。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中的一种适应性免疫系统，Cas12是V型CRISPR-Cas系统的效应子，通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12通过引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cas12识别富含胸腺嘧啶(T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于上述特性，科学家正在试图开发基于Cas12的快速、准确及灵敏的核酸检测方法。然而，crRNA的序列对于核酸检测以及多种核酸序列的区分的灵敏度效果影响很大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a法快速精准鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株的检测方法，基于CRISPR-Cas12a法检测新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株的特异性crRNA、包含所述crRNA的检测体系以及试剂盒，旨在对新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株进行快速、准确的检测。
第一方面，本发明提供了用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株的特异性crRNA，所述特异性crRNA包括：针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第484位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA。
在一些实施方案中，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1-10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQID NOs：1-10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1-5和SEQ ID NOs：7-10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：1-5和SEQ ID NOs：7-10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：11-16中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：11-16中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：11-15中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：11-15中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第484位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：17-24中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株第484位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：17-24中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第484位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：25-34中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ IDNOs：25-34中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：25-26，30，32-34中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NOs：25-26，30，32-34中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
优选地，所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点及其邻近1-10个位点设计的crRNA包括由SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NOs：1-5和SEQ ID NOs：7-10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：11-15中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或SEQ ID NOs：17-24中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：25-26，30，32-34中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和由SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和由SEQ ID NO：25或SEQ IDNO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；由SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和由SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
在一些实施方案中，所述特异性crRNA包括：由SEQ ID NO：17的核苷酸序列所示的核苷酸；和由SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸。
第二方面，本发明提供了用于RPA扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株与S基因特异性突变相关片段的引物，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和/或P681R。
优选地，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和P681R。
所述新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株为新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株。
在一些实施方案中，所述引物包含正向引物(F)和反向引物(R)。所述正向引物选自：SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示序列中的一个或者多个；所述反向引物选自SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示序列中的一个或者多个。
在一些实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41所示的正向引物；以及SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：45所示的反向引物。
所述引物可以经RPA扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株与S基因特异性突变相关的片段，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和/或P681R。
第三方面，本发明提供了用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株的检测体系，所述检测体系包含第一方面的特异性crRNA。
在一些实施方案中，所述检测体系还包含Cas12a蛋白。
在一些实施方案中，所述检测体系还包含DNA报告探针。所述DNA报告探针为单链DNA探针，包含荧光标记和淬灭标记，或包含生物标记物。所述DNA报告探针是用于CRISPR-Cas12a系统的常用DNA报告探针。
优选地，所述DNA报告探针为FAM-ATTATT-BHQ1或Digoxin-ATTATT-Biotin。
在一些实施方案中，所述检测体系还包含RNA酶抑制剂。所述RNA酶抑制剂是本领域常用的RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述检测体系还包含靶DNA片段。
优选地，所述靶DNA片段是利用第二方面的引物经RPA扩增获得的产物。
在一些实施方案中，所述检测体系包含：第一方面的特异性crRNA；Cas12a蛋白，DNA报告探针，RNA酶抑制剂，以及利用第二方面的引物经RPA扩增获得的产物。
第四方面，本发明提供了用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面的特异性crRNA，Cas12a蛋白和DNA报告探针。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含第二方面的引物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于RPA扩增的其他试剂，例如重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
所述引物，重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶可以与试剂盒中的其他组分置于试剂盒中分开的室中。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含胶体金试纸条或胶体金试纸条缓冲液。
所述胶体金试纸条或胶体金试纸条缓冲液与试剂盒中的其他组分置于试剂盒中分开的室中。
第五方面，本发明提供了用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株的方法，所述方法包括如下步骤：
将第一方面的特异性crRNA，Cas12a蛋白，DNA报告探针与靶DNA片段在反应体系中进行反应，或者将第三方面的检测体系与靶DNA片段进行反应，或者将第三方面的检测体系进行反应，或者利用第四方面的试剂盒进行反应。
所述方法还包括对反应结果进行观察的步骤。可以利用荧光灯肉眼观察，或者经仪器读取荧光值，或者在胶体金试纸条上肉眼观察结果。
在一些实施方案中，将第一方面的特异性crRNA，Cas12a蛋白，DNA报告探针与靶DNA片段在反应体系中进行反应，所述反应体系中还包含RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法还包括利用第二方面的引物经RPA扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株与S基因特异性突变相关的片段，从而获得经扩增的靶DNA片段的步骤，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和/或P681R。
在一些实施方案在，所述方法还包括从待检测样品制备RNA的步骤。所述RNA经RT-RPA扩增获得经扩增的靶DNA片段。
第六方面，本发明提供了第一方面的特异性crRNA，第二方面的引物，第三方面的检测体系或第四方面的试剂盒在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株中的用途。
附图说明
图1是本发明新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株鉴定方法的原理示意图；
图2是本发明实施例中筛选获得的针对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株的特异性crRNA；
图3是本发明实施例中筛选获得针对新型冠状病毒DELTA毒株相应核酸区段的最优等温扩增RPA引物组合；
图4是本发明实施例中模拟检测验证本检测体系酶标仪检测能有效区分新型冠状病毒DELTA毒株；
图5是本发明实施例中样品验证本检测体系可视荧光法能有效区分新型冠状病毒DELTA毒株；
图6是本发明实施例中样品验证本检测体系胶体金试纸条法能有效区分新型冠状病毒DELTA毒株。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的一些实施方案中，所述由SEQ ID NOs：1-34的核苷酸序列所示的核苷酸是34个长度为23bp的crRNA，所述crRNA针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的野生型毒株和新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株S基因的第452位点，第478位点，第484位点和/或第681位点。其中由SEQ ID NOs：1-3的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型毒株S基因的第452位点和/或邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NOs：4-5和SEQ IDNOs：7-10的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株S基因的L452R突变及其邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NO：11的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型毒株S基因的第478位点和/或邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NOs：12-15的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株S基因的T478K突变及其邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NO：17的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型毒株S基因的第484位点和/或邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NOs：18-24的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株S基因的E484Q突变及其邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NO：25的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型毒株S基因的第681位点和/或邻近1-10个位点的crRNA；由SEQ ID NOs：26，30和32-34的核苷酸序列所示的核苷酸是针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的Delta毒株S基因的P681R突变及其邻近1-10个位点的crRNA。
在本发明的一些实施方案中，针对突变位点荧光值最高且对野生型荧光值小的crRNA作为检测突变位点crRNA；筛选针对野生型位点荧光值最高且对突变型荧光值小的crRNA作为检测野生型位点crRNA。
所述的crRNA识别Cas12a蛋白的PAM序列。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的核苷酸是针对SARS-CoV-2毒株S基因中与特异性突变L452R、T478K和E484Q相关片段的RPA扩增的正向引物。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO：35所示的核苷酸是针对SARS-CoV-2毒株S基因中与特异性突变L452R、T478K和E484Q相关片段的RPA扩增的反向引物。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的核苷酸是针对SARS-CoV-2毒株S基因中与特异性突变P681R相关片段的RPA扩增的正向引物。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的核苷酸是针对SARS-CoV-2毒株S基因中与特异性突变P681R相关片段的RPA扩增的反向引物。
在本发明中，新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因片段的编码序列是参考NCBIWuhan-Hu-1毒株序列进行的。
CRISPR-Cas12a是第二类(V型)用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。Cas12a(Cpf1)蛋白具有类似于Cas9的RuvC内切核酸酶结构域。此外，Cas12a不具有HNH内切酶结构域，并且Cas12a的N-末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。Cas12a执行剪切后的DNA双链断裂引入了4或5个核苷酸突出的粘性末端，研究表明LbCas12a-crRNA复合物与互补单链DNA或者双链DNA的结合释放出强大的非特异性ssDNA反式切割活性。
Cas12a的靶基因是ssDNA和dsDNA，并且Cas12a引导链需要识别PAM序列。Cas12a酶的附加DNA酶切功能，可以切割特定单链DNA探针(例如，荧光和淬灭标记)，实现核酸检测。双链DNA在crRNA的引导下Cas12a可以切割双链模板DNA和荧光标记探针，探针被水解后释放出荧光信号，通过检测荧光信号便可知道是否有靶DNA。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物通常是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR引物的设计那样成熟，需要进行大量条件摸索的工作，从而对RPA的引物进行优化。
本发明基于Cas12a的针对新型冠状病毒DELTA毒株位点突变核酸检测体系筛选出针对突变位点荧光值最高且对野生型荧光值小的crRNA作为检测突变位点的特异性crRNA；筛选出针对野生型位点荧光值最高且对突变型荧光值小的crRNA作为检测野生型位点的特异性crRNA。所述包含特异性crRNA的检测体系能准确及灵敏检测鉴定区分新型冠状病毒DELTA毒株S基因的L452R、T478K、E484Q和P681R突变位点。
本发明针对新型冠状病毒DELTA毒株S基因突变位点的特异性crRNA和用于等温扩增RPA的引物组合，在Cas12a荧光核酸检测体系中能高效、准确、灵敏、便捷的检测并鉴定新型冠状病毒DELTA毒株突变毒株，与测序结果一致。
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种用于鉴定病毒突变位点的特异性非天然导向RNA设计策略、体系、试剂盒及其检测方法。本发明公开了一系列用于鉴定新型冠状病毒DELTA毒株S基因位点突变的特异性crRNA，其序列为SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：10，SEQID NO：11，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：34,并通过利用Cas12a特异识别核酸荧光检测技术，实现对新型冠状病毒DELTA毒株S基因位点突变核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。本发明的检测原理为Cas12a荧光法或试纸条法，如图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、检测成分制备和体系构建，及可视荧光检测或试纸条检测。本发明中所用crRNA是通过独创性引入特异性人工突变，并进行大量筛选验证获得的对DELTA毒株具有最优区分度的crRNA组合，本发明crRNA有别于传统的天然序列，是具有独创性及特异性的。而且，从最优区分度的crRNA组合与其他crRNA相比，可以看出几个碱基甚至1-2个碱基的差异也会导致检测灵敏度的显著变化。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明采用Cas12a荧光法或试纸条法检测新型冠状病毒DELTA毒株的位点突变，能对新型冠状病毒DELTA毒株位点突变情况进行快速检测，或者对野生型和DELTA毒株相应核酸序列进行快速区分诊断，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势；并且，检测结果可在包含荧光灯下肉眼直接可视检测，或通过胶体金试纸条检测，能实现方便快捷的结果判读，有效提高检测的准确性和可信性；因此，本发明的技术方案便于在基层实验和临床一线得到推广应用及普及。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中，RPA扩增试剂盒
Figure BDA0003415596290000091
Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGAclear Kit购自Ambion公司，Rnase Inhibitors、Cas12a protein和DNA reporter购自IDT；常规试剂如Tris-Base,NaCl,Tris-HCl，MgCl2,BSA和甘油等购自Thermo Fisher均采购自商业途径；检测用核酸片段、DNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成。
实施例1针对新型冠状病毒Delta毒株检测最优crRNA筛选验证
1、核酸制备
本实施例中，包含DELTA毒株位点突变的待检测核酸为新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因片段，参考NCBI Wuhan-Hu-1毒株序列设计，由南京金斯瑞公司合成，分别命名为：对应突变型的序列SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以及对应野生型的序列SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49。
>SEQ ID NO：46
CCCTAATACGACTCACTATAGGTGAgattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttGGTGGTAATTATAATTACCGGTATAGAttgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCAAACCTTGTAATGGTGTTCAAGGTTTTAATtgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaaTTTAAAGGGCCCGTCGACTGC
>SEQ ID NO：47
CCCTAATACGACTCACTATAGGTGAggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaatTCTCGTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataaTTTAAAGGGCCCGTCGACTGC
>SEQ ID NO：48
CCCTAATACGACTCACTATAGGTGAgattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGAttgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATtgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaaTTTAAAGGGCCCGTCGACTGC
>SEQ ID NO：49
CCCTAATACGACTCACTATAGGTGAggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaatTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataaTTTAAAGGGCCCGTCGACTGC
2、针对SARS-CoV-2病毒DELTA毒株S基因的位点突变设计并制备特异性crRNA
针对SARS-CoV-2病毒DELTA毒株S基因的位点突变的特异性crRNA制备按照如下方案进行：针对SARS-CoV-2的DELTA毒株的L452R、T478K、E484Q和P681R突变位点，设计包含识别序列的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，对应表1相应的crRNA,对应的编号为SEQ IDNOs：1-34。crRNA的制备，可交由公司直接合成crRNA序列对应的RNA。
本发明筛选提供的SARS-CoV-2的针对SARS-CoV-2病毒DELTA毒株位点突变的特异性crRNA包括SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：34，具体信息如表1所示：
表1针对SARS-CoV-2病毒Delta毒株位点突变的特异性crRNA
Figure BDA0003415596290000101
Figure BDA0003415596290000111
3、本实施例中，针对SARS-CoV-2病毒DELTA毒株位点突变的特异性检测采用20μL体系如表2所示，但不限于此，可以对相应成分的比例进行调整：
表2新型冠状病毒DELTA毒株位点突变的特异性检测体系
Figure BDA0003415596290000112
4、CRISPR全波长酶标仪荧光检测
酶标仪荧光检测中，检测体系依次加入2μL缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、1μL Cas12a蛋白、1μL DNA报告探针、5μL样品、1μL crRNA和9μL H2O。各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cas12a蛋白为200ng/μL，DNA reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。
首先，依次检测针对SARS-CoV-2病毒核酸的crRNA检测效率。在Cas12a检测体系中，各加入1μL crRNA，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应15min，对上述反应产物进行后续结果检测判定。
利用荧光检测判定Cas12a检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测1小时。取检测30min荧光数值为反应值。
5、检测结果及结论
结果如图2所示，本实施例成功建立了基于Cas12a的针对新型冠状病毒DELTA毒株S基因位点突变的核酸检测体系，筛选出针对突变位点荧光值最高且对野生型荧光值小的crRNA作为检测突变位点crRNA；筛选出针对野生型位点荧光值最高且对突变型荧光值小的crRNA作为检测野生型位点crRNA。例如，得到了能准确及灵敏检测鉴定区分新冠病毒DELTA毒株S基因L452R、T478K、E484Q和P681R突变位点的特异性crRNA，具体为SEQ ID NO：3，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：34所示的核苷酸。
实施例2 Delta毒株特异性CRISPR检测最优等温扩增反应引物筛选
本实施例中，为提升检测灵敏度，利用等温扩增(RPA)对SARS-CoV-2的基因核酸片段(20拷贝/检测)分别进行预扩增，以便进行CRIPSR检测反应。
按照等温扩增反应要求，分别设计并合成RPA扩增引物RPA-F(正向引物)和RPA-R(反向引物)，序列为SEQ ID NOs：35至45，如表3所示。
根据RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：等温扩增在50μL反应体系中进行。将5μL样品，13.5μL ddH2O，2μL RPA-F，2μL RPA-R(浓度为10μM)和25μL反应缓冲液(
Figure BDA0003415596290000121
Basic kit，购自TwistAmp公司)混匀，加入反应管溶解混匀。最后，加入2.5μL乙酸镁(
Figure BDA0003415596290000122
Basic kit，浓度为280mM)，混匀后在39℃下孵育20分钟，RPA产物进行下一步检测。
表3针对SARS-CoV-2的S基因相应片段的特异性RPA扩增引物序列
Figure BDA0003415596290000131
利用CRISPR全波长酶标仪荧光检测评估RPA扩增效率。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测1小时。取检测30min荧光数值为反应值。
结果如图3所示，本实施例成功建立了基于Cas12a的针对新型冠状病毒DELTA毒株位点突变的核酸检测体系，并成功筛选到能准确及灵敏检测鉴定新型冠状病毒DELTA毒株S基因L452R、T478K、E484Q和P681R突变位点的高效RPA扩增引物组合，具体包括SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：45。
实施例3 Delta毒株特异性CRISPR酶标仪检测
1、核酸制备
通过体外转录制备新型冠状病毒SARS-CoV-2包含DELTA毒株位点基因片段对应的RNA核酸样品。具体操作如下：使用MEGAshortscript T7转录试剂盒(Thermo FisherScientific)，分别用以包含DELTA毒株位点野生型和突变型基因片段DNA作为模板转录对应的基因RNA样品。转录后的RNA用MEGAclear试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化，并通过乙醇沉淀法回收；检测转录后RNA质量和浓度，并保存在-80℃直至使用。
2、模拟检测DELTA毒株位点突变
本实施例模拟SARS-CoV-2的DELTA毒株位点突变检测，本检测使用体外转录RNA样品进行模拟验证。模拟样品为S1至S7,其中S1、S3、S4和S6包含Delta突变位点，S2、S5和S7是野生型。
本案例中，取5μL包含DELTA毒株位点RNA样品、25μL 2*Buffer、2μL浓度为40U/μL的RPA上游引物、2μL浓度为40U/μL的RPA下游引物和2.5μL浓度为200ng/μL的乙酸镁混合均匀，于39℃进行RT-RPA预扩增30min，获得扩增产物RPA样品，扩增产物进行下一步核酸检测。其中，RPA引物为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36,及SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：45。在Cas12a检测体系中，取2μL Buffer、1μL浓度为40U/μL的Rnase Inhibitors、1μL浓度为200ng/μL的Cas12a protein、1μL浓度为25pM/μL的DNA reporter、5μL RPA样品、1μL浓度为1nM/μLcrRNA和9μL H2O混合均匀。其中，crRNA为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：34。于37℃反应15min，在485nm荧光灯下肉眼观察判定阴阳性结果。
4、检测结果及结论
结果如图4所示，本实施例成功了模拟临床新型冠状病毒DELTA毒株位点RNA样品，作为用于准确鉴定区分的样品，其中S1、S3、S4和S6为Delta毒株模拟样品，S2、S5和S7是野生型毒株模拟样品，检测符合率为100％。
实施例4 Delta毒株特异性CRISPR可视荧光检测
本实施例对模拟新型冠状病毒DELTA毒株的核酸样品进行快速检测，本检测在合规实验室进行，并且所有操作严格按照有关法律法规和相关规定进行。
本实施例中，每个待检测样品取5μL包含或不包含Delta毒株标志性突变的RNA样品进行RT-RPA预扩增，步骤与实施例2中相同，获得的产物进行CRISPR-Cas12a检测。在CRISPR-Cas12a检测体系中，依次加入2μL缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、1μL Cas12a蛋白、1μLDNA报告探针(FAM-ATTATT-BHQ1)、10μL RPA样品、1μL crRNA。其中，RPA引物为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；crRNA为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：34。各组分混合均匀，在37℃反应15min。在荧光灯下肉眼可有效对模拟临床阴阳性样品判定。
如图5所示，本实施例通过模拟样品验证本发明中针对新型冠状病毒DELTA毒株突变位点的crRNA和等温扩增RPA引物组合，在Cas12a荧光核酸检测体系能高效、准确、灵敏、便捷的检测并鉴定新型冠状病毒DELTA突变毒株，与测序结果一致。
实施例5 Delta毒株特异性CRISPR胶体金试纸检测
本实施例对模拟新型冠状病毒DELTA毒株的样品进行快速检测，本检测在合规实验室进行，并且所有操作严格按照有关法律法规和相关规定进行。本实施例中，制备8个模拟样品T1至T8,其中T1、T3、T4、T6、T7和T8，所述模拟样品包含Delta毒株的Q484突变，T2和T5包含野生型E484片段。每个待检测样品取5μL进行RT-RPA预扩增，步骤与实施例2中相同，获得产物进行CRISPR-Cas12a检测。在CRISPR-Cas12a检测体系中，依次加入2μL缓冲液、1μLRNA抑制剂、1μL Cas12a蛋白、1μL DNA报告探针、10μL RPA样品、1μL的crRNA。其中，RPA引物为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36,及SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：45；crRNA为SEQ ID NO：17,SEQ ID NO：19。各组分混合均匀，在37℃反应15min。将20μL反应产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4×SSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定及进行拍照记录。
如图6所示，本实施例通过模拟样品验证本发明中针对新型冠状病毒DELTA毒株位点的crRNA和等温扩增RPA引物组合，在CRISPR-Cas12荧光核酸检测体系能高效、准确、灵敏、便捷的检测并鉴定新型冠状病毒DELTA毒株突变毒株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州国家实验室
广州呼吸健康研究院
<120> 一种病毒核酸突变检测方法及应用
<130> CP11592SW
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
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agcttggaat tctaacaatc ttgattctaa gg 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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attctaaggt tggtggtaat tataattacc 30
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ttctacaggt tctaatgttt ttcaaacacg 30
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tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc 30
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ctgaacatgt caacaactca tatgagtgtg ac 32
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caatgatgga ttgactagct acactacgtg cc 32
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<213> Artificial Sequence
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<400> 44
acatagtgta ggcaatgatg gattgactag c 31
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<212> DNA
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<223> Artificial
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caccaagtga catagtgtag gcaatgatgg 30
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<212> DNA
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ccctaatacg actcactata ggtgagatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 60
tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attaccggta 120
tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 180
tcaggccggt agcaaacctt gtaatggtgt tcaaggtttt aattgttact ttcctttaca 240
atcatatggt ttccaaccca ctaatttaaa gggcccgtcg actgc 285
<210> 47
<211> 278
<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
<400> 47
ccctaatacg actcactata ggtgaggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa 60
acacgtgcag gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata 120
cccattggtg caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcg tcggcgggca 180
cgtagtgtag ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca 240
gttgcttact ctaataattt aaagggcccg tcgactgc 278
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
<400> 48
ccctaatacg actcactata ggtgagatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 60
tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta 120
tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 180
tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca 240
atcatatggt ttccaaccca ctaatttaaa gggcccgtcg actgc 285
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ccctaatacg actcactata ggtgaggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa 60
acacgtgcag gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata 120
cccattggtg caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca 180
cgtagtgtag ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca 240
gttgcttact ctaataattt aaagggcccg tcgactgc 278

Claims (10)

1.用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2Delta毒株、或区分新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和Delta毒株的特异性crRNA，其包括针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第484位点的crRNA；和/或针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点的crRNA；
所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第452位点的crRNA包括：
由SEQ ID NOs：1-5和SEQ ID NOs：7-10中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；
所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第478位点的crRNA包括：
由SEQ ID NOs：11-15中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；
所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第484位点的crRNA包括：
由SEQ ID NOs：17-24中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸；
所述针对SARS-CoV-2毒株S基因第681位点的crRNA包括：
由SEQ ID NOs：25-26，30和32-34中的一个或者多个核苷酸序列所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的特异性crRNA，其包括：由SEQ ID NOs：1-5和SEQ ID NOs：7-10中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：11-15中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或SEQ ID NOs：17-24中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NOs：25-26，30，32-34中的一个或者两个核苷酸序列所示的核苷酸。
3.根据权利要求1所述的特异性crRNA，其包括：由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：10的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19的核苷酸序列所示的核苷酸；和/或由SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：34的核苷酸序列所示的核苷酸。
4.用于RPA扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株与S基因特异性突变相关片段的引物，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和/或P681R，
所述特异性突变L452R、T478K和/或E484Q的正向引物选自：SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示序列中的一个或者多个，所述反向引物为SEQ IDNO：35；所述特异性突变P681R的正向引物选自SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示序列中的一个或者多个，所述反向引物选自SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示序列中的一个或者多个；或
所述引物包含SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：41所示的正向引物；以及SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：45所示的反向引物。
5.用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2Delta毒株、或区分新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和Delta毒株的试剂盒，其包含权利要求1-3任一项的特异性crRNA，Cas12a蛋白，DNA报告探针和RNA酶抑制剂，所述DNA报告探针包含荧光标记和淬灭标记，或包含生物标记物，所述DNA报告探针为FAM-ATTATT-BHQ1或Digoxin-ATTATT-Biotin。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，进一步包括胶体金试纸条以及胶体金试纸条缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，进一步包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照选自SEQ NO.46和SEQ NO.47中一种或多种；所述阴性对照为野生型毒株S蛋白片段。
8.用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2Delta毒株、或区分新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和Delta毒株的方法，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：
将权利要求1-3任一项的特异性crRNA，Cas12a蛋白，DNA报告探针，RNA酶抑制剂与靶DNA片段在反应体系中进行反应，或者利用权利要求5-7任一项的试剂盒进行反应；以及
利用荧光灯肉眼观察，经仪器读取荧光值，或者在胶体金试纸条上肉眼观察，对反应结果进行观察的步骤。
9.根据权利要求8的方法，还包括利用权利要求4的引物经RPA扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株与S基因特异性突变相关的片段，从而获得经扩增的靶DNA片段的步骤，所述特异性突变选自L452R、T478K、E484Q和/或P681R。
10.权利要求1-3任一项的特异性crRNA，权利要求4的引物，或权利要求5-7任一项的试剂盒在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2Delta毒株、或区分新型冠状病毒SARS-CoV-2野生型和Delta毒株中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
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