CN118147335A - 三种软腐病病原特异性检测基因及其在检测香芋软腐病方面的应用 - Google Patents
三种软腐病病原特异性检测基因及其在检测香芋软腐病方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了三种软腐病病原特异性检测基因及其在检测香芋软腐病方面的应用。本发明研究获得了用于检测方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacteriumcolocasium)的特异性基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。并基于此开发了一套能特异检测三种病原菌的引物组及检测产品，可分别或同时检测三种病原菌。本发明首次采用分子检测技术对香芋软腐病的上述三种病原菌进行检测鉴定，本发明的检测方法快速、简便，特异性好，灵敏度高，可在入侵早期实现特异性检测，对相关病害尤其是香芋软腐病的病情预测预报和及时采取措施防控，具有重要意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及香芋软腐病病原菌基因片段及其在香芋软腐病检测中的应用，以及基于此建立的香芋软腐病病原菌特异性检测方法。
背景技术
软腐病是一种复杂的世界性植物病害，病原菌种类较多，对全球范围内的农业生产造成重大影响。由于不同地区引起软腐病的病原菌优势种各不相同，同一植物软腐病的病原菌可能由多种病原细菌共同侵染的结果，不同植物软腐病的主要病原菌往往也会有差异。因此很难对软腐病进行全面、准确地检测。
例如香芋软腐病问题逐年加重，造成大量经济损失。香芋是粮蔬兼用型作物，其营养丰富、风味独特，且药用价值高，是老少皆宜的营养品。我国香芋种植规模较大，年产鲜芋头180万吨，在其种植和加工产业中伴生的可饲用资源约有81万吨，其主要栽植区包括福建、广东、广西、海南等。其中广东的韶关市乐昌县种植香芋的历史悠久，已超过350年，香芋产业已成为韶关市的一张靓丽名片，更是韶关市当地经济的支柱性产业。近几年，香芋软腐病给当地的香芋产业发展带来了严峻挑战。韶关市香芋的种植面积逾2万亩，香芋软腐病发病率在10％-30％之间，严重的达60％左右，每年经济损失就达1.05亿元，成为制约韶关市香芋产业发展的主要影响因素之一。
根据本团队在韶关市的调查研究，韶关市香芋软腐病的病原菌主要为方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)三种，这些病原菌主要通过分泌果胶裂解酶降解植物细胞的胞间层和初生壁中的果胶，浸渍植物组织，导致植物组织发生软化、腐烂，造成巨大的经济损失(Isolation and Genome Analysis of Pectobacterium colocasiumsp.nov.and Pectobacterium aroidearum,Two New Pathogens of Taro.Front PlantSci.Zhou et al.,2022Apr 26；13:852750.)。因此，在香芋软腐病的检测方面，对这三种病原菌有任一漏检都可能造成病害的漏检。
另外，方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacteriumaroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)这三种病原菌除了引起香芋软腐病，已报道的还会引起多种植物病害，如方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)是常见的侵染木本植物的软腐病病菌，还会引起梨树锈水病；环状果胶杆菌(Pectobacteriumaroidearum)还会引起大白菜等蔬菜、魔芋等软腐病。它们均是会引起多种植物病害的病原菌。
然而目前尚未有比较好的上述病原菌的检测技术，尤其是三种病菌同时检测技术，而传统的病原菌分离鉴定技术复杂、耗时长，且对操作人员技术依赖性高、容易误检漏检。
因此，建立快速、准确、简便的能够针对以上三种病原菌的监测技术，尤其是同时检测技术，对于相关病害的监测及防治都具有重要的意义。对于防止香芋软腐病病原菌蔓延和防治香芋软腐病，对我国尤其是粤北的香芋产业发展，具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明经过对方中达迪克氏菌(Dickeyafangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)这三种病原菌遗传信息的分析研究，获得了三种分别用于检测和鉴别这三种病原菌的特异性基因片段，并基于此开发了能特异检测3种不同香芋软腐病病原菌的引物及检测产品，不仅能检测分别检测三种病原菌，更重要的是还能同时检测、可避免香芋软腐病的漏检，该类检测技术可以PCR等分子技术实现，快速、简便、准确，非常易于推广应用。
本发明的第一个目的是提供一种能够检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeyafangzhongdai)的特异性基因片段。
本发明的第二个目的是提供一种能够检测鉴定环状果胶杆菌(Pectobacteriumaroidearum)的特异性基因片段。
本发明的第三个目的是提供一种能够检测鉴定芋头果胶杆菌(Pectobacteriumcolocasium)的特异性基因片段。
本发明的第四个目的是提供上述基因片段在对应病原菌检测方面的应用。
本发明的第五个目的是提供一种检测上述三种病原菌、检测香芋软腐病的特异性引物组，以及检测试剂盒和检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过对中国境内能够引起香芋软腐病的主要三种香芋软腐病原菌方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)进行全基因组数据比对分析、筛选、研究，获得了可用于检测鉴定的特异性基因片段，设计了特异性引物、建立了特异性PCR检测方法，能够特异灵敏地把这三种病原菌和其他病原菌株区分开来，从而用来早期检测这三种病原菌，可实现这三种病原菌所致病害的监测，如香芋软腐病的监测，尤其是对粤北香芋软腐病的监测具有重要价值。
即本发明提供了如下方案：
一种能够检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)的特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种能够检测鉴定环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)的特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种能够检测鉴定芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)的特异性基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种能够检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的特异性基因片段组合，所述特异性基因片段组合包括上述任一或任几所述特异性基因片段；所述香芋软腐病病原菌为方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中的一种或几种。
基于此，本发明还提供如下应用方案：
上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合作为检测靶点，在检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中一种或多种病原菌方面的应用。
上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合作为检测靶点，在制备能够检测方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中一种或多种病原菌的产品中的应用。
上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合作为检测靶点，在监测香芋软腐病中的应用。
上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合作为检测靶点，在制备能够监测香芋软腐病的产品中的应用。
检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的试剂，在检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中一种或多种病原菌方面的应用。
检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的试剂，在监测香芋软腐病中的应用。
检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的试剂，在制备检测方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中一种或多种病原菌的产品中的应用。
检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的试剂，在制备监测香芋软腐病产品中的应用。
进一步地，本发明提供一种检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的引物组，包括检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的引物对。
作为优选方案之一，所述引物组为引物对DK600-F/DK600-R、PA302-F/PA302-R、PC502-F/PC502-R中的任一或任几对，所述引物对DK600-F/DK600-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4-5所示，引物对PA302-F/PA302-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示，引物对PC502-F/PC502-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
并基于此，本发明提供一种特异性检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的试剂盒，含有检测上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合的试剂。
作为优选方案之一，所述试剂为上述引物组，引物组为引物对DK600-F/DK600-R、PA302-F/PA302-R、PC502-F/PC502-R中的任一或任几对。
另外，本发明提供一种特异性检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的方法，以上述特异性基因片段或上述特异性基因片段组合作为靶点，对待测样本进行检测，根据结果判断待测样本是否含有香芋软腐病病原菌或是否感染软腐病；如检测结果为任一靶点或任几个靶点阳性，则待测样本含有香芋软腐病病原菌或感染软腐病；如检测结果全部为阴性，则待测样本未含有香芋软腐病病原菌或未感染软腐病。
具体地，作为一种优选方案，所述特异性检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的方法，取待测样本DNA，利用上述引物组或上述试剂盒对待测样本进行检测，根据结果判断待测样本是否含有香芋软腐病病原菌或是否感染软腐病；如检测结果为任一或任几个阳性，则待测样本含有香芋软腐病病原菌或感染软腐病；如检测结果全部为阴性，则待测样本未含有香芋软腐病病原菌或未感染软腐病。
另外，作为具体地可选择地实施方案，所述检测为PCR检测，根据PCR扩增产物是否阳性，判断待测样本是否含有香芋软腐病病原菌或是否感染软腐病。
可选地，所述PCR的反应体系为：2×T5 Super PCR Mix 12.5μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水9.5μL。
可选地，所述PCR的反应程序为：98℃预变性3分钟，98℃变性15秒，65℃退火15秒，72℃延伸20秒，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸5分钟。
作为可选择的实施方案，所述PCR扩增产物判断方法为凝胶电泳，若出现601bp的条带，则判定为方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)阳性，若出现302bp的条带，则判定为环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)阳性，若出现502bp的条带，则判定为芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)为阳性。这三种病原菌有任一或任几个阳性，则判断香芋软腐病阳性。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次采用分子检测技术对香芋软腐病进行鉴定，实现了香芋软腐病病原菌分子监测技术零的突破。与传统的病原菌生化鉴定检测方法相比，本发明的分子生物学检测方法操作简单、快速，无需对病原菌进行分离培养，极大缩短了检测时间，且随着PCR检测技术的升级可望进一步简化、缩短时间。
本发明检测方法特异性强，准确性高。。本发明的检测方法可对香芋软腐病三种病原菌方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacteriumaroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)进行特异检测并进行区分，实现不同香芋软腐病病原菌的种间区分，具体是以特异性检测引物DK600-F/DK600-R进行PCR扩增后，即可实现香芋软腐病病原菌D.fangzhongdai的特异性检测；以特异性检测引物PA302-F/PA302-R进行PCR扩增后，即可实现香芋软腐病病原菌P.aroidearum的特异性检测；以特异性检测引物PC502-F/PC502-R进行PCR扩增后，即可实现香芋软腐病病原菌P.colocasium的特异性检测。三者同时检测又能保证香芋软腐病不漏检。
本发明的检测方法灵敏度高，对病原菌D.fangzhongdai的检测限为0.05ng/μL，对病原菌P.aroidearum和P.colocasium的的检测限为0.005ng/μL，可在入侵早期就特异检测出病原菌，进而及时采取相应的措施进行病害防控。
此外，本发明的检测方法应用灵活，即可对样本遗传信息进行检测，亦可直接利用植株组织浸出液即可检测出植株是否带有软腐病病原菌，具有很好的应用前景。
本发明可应用于不仅限于香芋软腐病的病情预测预报以及病原菌的鉴定，对相关病害如香芋软腐的病防治具有重要意义，尤其对于三种病原菌同时危害的南方香芋软腐病的监测与防控，具有重要意义；也为这三种病原菌危害的其他病害检测提供了技术指导和理论依据。
附图说明
图1为引物组DK600的特异性PCR验证电泳结果(M为2000bp Marker，泳道1为菌株ZXC1的DNA扩增结果，泳道2为菌株CL3的DNA扩增结果，泳道3为菌株MS2的DNA扩增结果，泳道4为菌株EC1的DNA扩增结果，泳道5为菌株3937的DNA扩增结果，泳道6为菌株5316的DNA扩增结果，泳道7为菌株402的DNA扩增结果，H2O为水的扩增结果)。
图2为引物组PA302特异性PCR验证电泳结果(M为2000bp Marker，泳道1为菌株LJ2的DNA扩增结果，泳道2为菌株LJ1的DNA扩增结果，泳道3为菌株0623的DNA扩增结果，泳道4为菌株11303的DNA扩增结果，泳道5为菌株11629的DNA扩增结果，泳道6为菌株10813的DNA扩增结果，泳道7为菌株17280的DNA扩增结果，H2O为水扩增结果)。
图3为引物组PC502特异性PCR验证电泳结果(M为2000bp Marker，泳道1为菌株LJ1的DNA扩增结果，泳道2为菌株0623的DNA扩增结果，泳道3为菌株LJ2的DNA扩增结果，泳道4为菌株11303的DNA扩增结果，泳道5为菌株11629的DNA扩增结果，泳道6为菌株10813的DNA扩增结果，泳道7为菌株17280的DNA扩增结果，H2O为水扩增结果)。
图4为引物组DK600、PA302和PC502分别对D.fangzhongdai、P.aroidearum和P.colocasium的灵敏度PCR检测电泳结果(a图为引物组DK600的灵敏度PCR检测电泳结果，b图为引物组PA302的灵敏度PCR检测电泳结果，c图为引物组PC502的灵敏度PCR检测电泳结果；其中a、b、c图中的M为2000bp Marker，泳道1为50ng/μL的DNA扩增结果，泳道2为25ng/μL的DNA扩增结果，泳道3为10ng/μL的DNA扩增结果，泳道4为5ng/μL的DNA扩增结果，泳道5为1ng/μL的DNA扩增结果，泳道6为0.1ng/μL的DNA扩增结果，泳道7为0.05ng/μL的DNA扩增结果、泳道8为0.01ng/μL的DNA扩增结果、泳道9为0.005ng/μL的DNA扩增结果)。
图5为香芋组织浸出液的PCR检测电泳结果(a图的上图为D.fangzhongdai CL3菌株接种香芋的发病组织表型图，下图为DK600引物组PCR检测D.fangzhongdai CL3菌株接种香芋的组织浸出液的电泳结果；b图的上图为P.aroidearum LJ2菌株接种香芋的发病组织表型图，下图为PA302引物组PCR检测P.aroidearum LJ2菌株接种香芋的组织浸出液的电泳结果；c图的上图为P.colocasium LJ1菌株接种香芋的发病组织表型图，下图为PC502引物组PCR检测P.colocasium LJ1菌株接种香芋的组织浸出液的电泳结果)。
图6为D.fangzhongdai特异性引物组DK600的荧光定量PCR检测结果(A、B、C图为分别为荧光定量PCR的溶解曲线、扩增图谱和标准曲线)。
图7为P.aroidearum特异性引物组PA302的荧光定量PCR检测结果(A、B、C图为分别为荧光定量PCR的溶解曲线、扩增图谱和标准曲线)。
图8为P.colocasium特异性引物组PC502的荧光定量PCR检测结果(A、B、C图为分别为荧光定量PCR的溶解曲线、扩增图谱和标准曲线)。
图9为引物组DK600、PA302和PC502混合后对香芋软腐病病原菌PCR检测电泳结果(a图为3个引物组混合后分别对D.fangzhongdai CL3、P.aroidearum LJ2、P.colocasiumLJ1三种香芋软腐病病原菌PCR检测电泳结果，M为2000bp Marker，泳道1为对D.fangzhongdai CL3的DNA扩增结果，泳道2为对P.colocasium LJ1的DNA扩增结果，泳道3为对P.aroidearum LJ2的DNA扩增结果，泳道4为ddH2O扩增结果；b图为3个引物组混合后对三种香芋软腐病病原菌混合DNA的PCR检测电泳结果，M为2000bp Marker、泳道1、2、3分别为实验结果的3次重复，泳道4为ddH2O扩增结果；c图为3个引物组单独对三种香芋软腐病病原菌混合DNA的PCR检测电泳结果，M为2000bp，泳道1、2、3分别为引物组DK600、PC502和PA302单独对三种香芋软腐病病原菌混合DNA的PCR检测电泳结果，泳道4为ddH2O扩增结果)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
细菌基因组DNA纯化试剂盒，PCR Purification Kit，货号为EP101-01，购买于北京全式金生物技术股份有限公司。
实施例中所用引物由广州擎科生物技术有限公司合成。
2×T5 Super PCR Mix购买于广州擎科生物技术有限公司，货号为TSE005。
实施例3中人工接种方法参考发明人文章《Zhou J,Hu M,Hu A,et al.Isolationand genome analysis of Pectobacterium colocasium sp.nov.And Pectobacteriumaroidearum,two new pathogens of taro[J].Frontiers in Plant Science,2022,13:852750.》中的接种方法。
以下实施例中所用菌株信息如表1所示。
表1本发明所用的菌株列表
Dickeya fangzhongdai CL3在文章《Hu A,Hu M,Chen S,Xue Y,Tan X,ZhouJ.Five Plant Natural Products Are Potential Type III Secretion SystemInhibitors to Effectively Control Soft-Rot Disease Caused by Dickeya.FrontMicrobiol.2022Feb22；13:839025.》中披露。
Dickeya fangzhongdai ZXC1在文章《Huang S,Chen Z,Hu M,Xue Y,Liao L,Zhang LH.First Report of Bacterial Soft Rot Disease on Taro Caused by Dickeyafangzhongdaiin China.Plant Dis.2021May 2》中披露。
Dickeya zeae MS2在文章《Feng L,Schaefer AL,Hu M,Chen R,Greenberg EP*,Zhou J*.Virulence Factor Identification in the Banana Pathogen Dickeya zeaeMS2.Appl.Environ.Microbiol.,2019,85(23):e01611-19.》中披露。
Dickeya oryzeae EC1在文章《Zhou J,Cheng Y,Lv M,Liao L,Chen Y,Gu Y,LiuS,Jiang Z,Xiong Y,Zhang LH.The Complete genome sequence of Dickeya zeae EC1reveals substantial divergence from other Dickeya strains and species.BMCGenomics,2015,16(1):571》中披露。
Pectobacterium colocasium LJ1、Pectobacterium aroidearum LJ2保存在本实验室，在文章《Zhou J,Hu M,Hu A,Li C,Ren X,Tao M,Xue Y,Chen S,Tang C,Xu Y,ZhangL,Zhou X.Isolation and Genome Analysis of Pectobacteriumcolocasium sp.nov.andPectobacterium aroidearum,Two New Pathogens of Taro.Front Plant Sci.2022Apr26；13:852750.》中披露。
Dickeya dadantii 3937，标准菌株，已在NCBI网站中披露，Dickeyadadantii3937在NCBI的Taxonomy ID为198628。
实施例1香芋软腐病病原菌PCR检测特异性引物的设计及引物的特异性验证
(一)实验方法
1、引物设计
本发明通过对三种香芋软腐病原菌方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)和芋头果胶杆菌(Pectobacteriumcolocasium)进行全基因组数据比对分析、筛选、研究，获得了可用于检测鉴定的特异性基因，并设计了特异性引物、建立了特异性PCR检测方法，
本发明针对三种香芋软腐病病原菌(D.fangzhongdai、P.aroidearum、P.colocasium)利用unqprimer和NCBIPrimer-Blast设计出了多对引物，并通过大量实验进行筛选，最终获得针对三种香芋软腐病病原菌的特异性引物(如表2所示)。
表2本发明所用引物
DK600引物组扩增产物，即可特异性检测方中达迪克氏菌(D.fangzhongdai)的特异性基因片段，序列如SEQ ID NO.1所示，
SEQ ID NO.1：
TTGCCCGACAAGCCTGAGCGCGCCGTAGATACCCCGATCGATGTACGGCGCCCCATTTTCCGCCAGACGTTATTAAGGTCATGATGGATGAAAATATTGTGTGCTGTATTGGCGTTGAGTCTGTCAACGATGTTGCCTGCCCTGGCTCAGACGGCATCCCCGCAGGGTGAGGCGGAGATCGCCGGGCTGGCTGGTAAGCGGGATCTGGTGCAGGAAGAAAAGAACCGTGCGTTGGTGGTTGAGTTTTATACGGAAGTGTTAAGCCATCGCCGGGTCGATCTGGCGGATAAATACCTGAGCGCAGAATATATTCAGCATAATCCGTATGCAGCGACCGGGCGCGAGGCATTTGTGGCCTTTTTCACCGATTTATTCCGTCGTTATCCGCAATCCGAGCACCGTATTATCCGCACCGCTACCGACGGTAATCTGGTCTATCTGCATGTATTTGCACGGAATGACCCCAGCGATCGGGGACGGGCGGTGGTCGATATTCTGCGCGTTGATAACGGTAAGATCGTGGAGCACTGGGATGTGGTACAGCCGATACCTGAAACGAGCGCCAACACCAACGGGATGTTTTGATACGGCTTGCCCGGCG。
PA302引物组扩增产物，即可特异性检测环状果胶杆菌(P.aroidearum)的特异性基因片段，序列如SEQ ID NO.2所示，
SEQ ID NO.2：
GCGCAGGATGACGCGGAACTGACACACCGTTAAGCCACGCTTGCTGCACAAAAGAAAACGCCGACGGCTGGAGCTGTCGGCGTTTTTTATAACACTTTTCTAATAACGATATCGTGCTATCAGGTTAACTAGCGCTGTGGGTTAGTATCGTAAGCCTGGCAGCTCTGGAAGCCTTTATTGAGGACATGCCCTGTGTCGTTATAGCTCACGAAATAGTTCTGCGCGGTACCATCGCGGTTTTTCAGCAGATAATCACTGCAGGTACCCTTGGCATTCACCAAACGTTTCTCAGTGCCGCCCGT。
PC502引物组扩增产物，即可特异性检测芋头果胶杆菌(P.colocasium)的特异性基因片段，序列如SEQ ID NO.3所示，
SEQ ID NO.3：
CAGTGGCGTGCTGGGTACGGCCTTGGCATCACGGGTGTCATTCAGGTAGAGCACAACGGTAGAGCGTGGATCGACGGTCACGTTACCGGACAGCGTTCGCTGTGATACCAGATCTTCCGCGCCCTTAAAGCCGACTGGTGTTTTCAGGGCGTAGCGGTTGTCGGCGCTGGCATTAATACCAATGAGATAGTGGCCGAAACGTGCGGCATAGAAATCGGCCTTGCCTCGGAAAGGTTCATCGTTGGATGCCTCTTCAGGTTTAATGCCGAGCGGCAGGATTTCACCAGCATAGGCGTTAGTCGGCGGATTGGGAGGCGTATAGGGTGTTTTCTCCGGCATGTCGATGCGGTTAGGGCGTGTATAGCTCGCCGTTGAACGAAAGATCGGGGTGGTTTCCAGTACACCATACTGATCATAGCCCGGAGTGCTGAAATGGAAACGCGCCAGCCCGTTGATGCCGGTTCCTGCTTTGGCCTGCCAATATGTCGTCAGCCACAGGCGC。
2、细菌基因组DNA提取
利用细菌基因组DNA纯化试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)，对各待测软腐病病原菌P.colocasium LJ1、P.aroidearum LJ2、P.colocasium 0623、P.aroidearum11303、P.aroidearum 11629、P.cacticida 10813、P.carotovorum17280、D.fangzhongdaiCL3、D.fangzhongdai ZXC1、D.oryzeae EC1、D.zeae MS2、D.dadantii 3937、D.solani5316、D.chrysanthemi 402基因组DNA进行提取。参考试剂盒说明书进行基因组DNA的提取，具体方法如下：
(1)取过夜培养的菌液各1mL，12000×g离心1分钟，尽量弃上清；
(2)加入100μL LB11和20μL Proteinase K，振荡至菌体彻底悬浮；
(3)55℃孵育15分钟；
(4)加入20μL RNase A混匀静置2分钟；
(5)加入400μL BB11(加入无水乙醇)涡旋30秒；
(6)将全部的溶液加入离心柱中，12000×g离心30秒，弃流出液；
(7)加入500μL CB11，12000×g离心30秒，弃流出液；
(8)重复步骤(7)一次；
(9)加入500μL WB11，12000×g离心30秒，弃流出液；
(10)重复步骤(9)一次；
(11)12000×g离心2分钟，彻底除去残留的WB11；
(12)将离心柱置于干净的离心管中，在柱中央加入50μL预热EB(60-70℃)或去离子水(pH>7.0)，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，洗脱DNA。
将提取获得的基因组DNA利用微量分光光度计(NanoDrop2000c)测定DNA浓度后将DNA产物保存在-20℃备用。
3、PCR检测方法的建立及引物特异性PCR验证
基于同时适用于DK600-F/DK600-R，PA302-F/PA302-R，PC502-F/PC502-R三个引物组PCR扩增的研究目的，通过PCR扩增反应体系和反应程序的优化，建立了香芋软腐病病原菌PCR检测方法：
PCR反应体系(25μL体系)：2×T5 Super PCR Mix 12.5μL，正向引物和反向引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水9.5μL。
PCR反应程序：98℃预变性3分钟，98℃变性15秒，65℃退火15秒，72℃延伸20秒，变性-退火-延伸进行30个循环；最后72℃延伸5分钟。
以菌株LJ1、LJ2、0623、11303、11629、10813、17280、CL3、ZXC1、EC1、MS2、3937、5316、402的基因组DNA为模板，采用以上PCR反应体系与反应程序进行PCR扩增，取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，对引物DK600-F/DK600-R，PA302-F/PA302-R，PC502-F/PC502-R的特异性进行验证。
(二)实验结果
引物组DK600的特异性PCR验证电泳结果如图1所示，结果表明，引物DK600-F/DK600-R能特异性地以D.fangzhongdai基因组DNA扩增出大小为601bp的条带，而对其它菌株的DNA及阴性对照均无扩增条带，说明该对引物可以将D.fangzhongdai与其它香芋软腐病病原菌区分开来，具有种间的特异性，可用于香芋软腐病病原菌D.fangzhongdai的快速检测。
引物组PA302特异性PCR验证电泳结果如图2所示，结果表明，引物PA302-F/PA302-R能特异性地以P.aroidearum基因组DNA扩增出大小为302bp的条带，而对其它菌株的DNA及阴性对照均无扩增条带，说明该对引物可以将P.aroidearum与香芋软腐病病原菌其它菌株区分开来，具有种间的特异性，可用于香芋软腐病病原菌P.aroidearum快速检测。
引物组PC502特异性PCR验证电泳结果如图3所示，结果表明，引物PC502-F/PC502-R能特异性地以P.colocasium基因组DNA扩增出大小为502bp的条带，而对其它菌株的DNA及阴性对照均无扩增条带，说明该对引物可以将香芋软腐病病原菌P.colocasium与其它菌株区分开来，具有种间的特异性，可用于香芋软腐病病原菌P.colocasium快速检测。
实施例2香芋软腐病病原菌特异性引物的灵敏度测定
(一)实验方法
用无菌超纯水分别对香芋软腐病病原菌D.fangzhongdai CL3、P.aroidearum LJ2和P.colocasium LJ1的基因组DNA进行稀释，获得质量浓度梯度为50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL、0.01ng/μL、0.005ng/μL的DNA模板。
采用实施例1的PCR扩增反应体系和反应程序进行PCR扩增，取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，对引物DK600-F/DK600-R，PA302-F/PA302-R，PC502-F/PC502-R的灵敏度进行测定。
(二)实验结果
特异引物组DK600、PA302和PC502的灵敏度PCR检测电泳结果如图4所示，结果表明：
DK600-1检测D.fangzhongdai CL3基因组DNA的最低浓度为0.05ng/μL(图4的a图)；PA302检测P.aroidearum LJ2基因组DNA的最低浓度为0.005ng/μL(图4的b图)；PC502检测P.colocasium LJ1基因组DNA的最低浓度为0.005ng/μL(图4的c图)。
综上，说明DK600、PA302和PC502引物组对各自检测的目标病原菌都有很好的检测灵敏度，可对香芋软腐病进行灵敏检测。
实施例3利用香芋软腐病病原菌接种香芋组织的PCR检测
(一)实验方法
参考已报道的人工接种方法(Zhou J,Hu M,Hu A,et al.Isolation and genomeanalysis of Pectobacterium colocasium sp.nov.And Pectobacterium aroidearum,two new pathogens of taro[J].Frontiers in Plant Science,2022,13:852750.)，将香芋切片分别接种香芋软腐病病原菌菌株D.fangzhongdai CL3、P.colocasium LJ1、P.aroidearum LJ2后，置于28℃恒温培养箱。待寄主植物发病后，取腐烂的部分香芋组织转移于50mL离心管中，加入10mL灭菌的双蒸水，于28℃振荡培养2h制备得到组织浸出液。以制备得到的组织浸出液作为模板进行PCR检测，PCR扩增反应体系和反应程序同实施例1。
(二)实验结果
香芋组织浸出液的PCR检测电泳结果如图5所示，结果表明，使用引物DK600-F/DK600-R对组织浸出液能扩增出特异的601bp条带，说明能检测出发病组织浸出液中含有香芋软腐病病原菌菌株D.fangzhongdai(图5的a图)；
使用引物PA302-F/PA302-R和PC502-F/PC502-R分别对P.aroidearum LJ2和P.colocasium LJ1接种香芋的组织浸出液能扩增出扩增出特异的302bp条带(图5的b图)和502bp条带(图5的c图)，说明通过对发病组织浸出液进行检测即可判断发病组织中是否带有香芋软腐病病原菌。
综上，实验结果说明本发明的引物组DK600、PA302和PC502能检测出组织浸出液是否含有目标病原菌，可用于香芋软腐病病原菌病原的快速分子检测。实施例4香芋软腐病病原菌特异性引物荧光定量PCR检测
使用DK600-F/DK600-R、PA302-F/PA302-R和PC502-F/PC502-R特异性引物分别对D.fangzhongdai CL3、P.aroidearum LJ2和P.colocasium LJ1菌株的DNA进行荧光定量PCR(qPCR)检测，检测结果分别如图6、图7和图8所示。
图6、图7和图8的A图可以看出，DK600、PA302和PC502三个引物组的qPCR检测限为2.5×10-6ng/μL，比常规PCR灵敏200倍。
从图6、图7和图8的B图可以看出，DK600-F/DK600-R引物扩增D.fangzhongdai CL3基因组DNA的溶解温度为87.1℃，PA302-F/PA302-R引物扩增P.aroidearum LJ2基因组DNA的溶解温度为85.2℃，PC502-F/PC502-R引物扩增P.colocasium LJ1的基因组DNA溶解温度为85.0℃，且溶解曲线都是单峰，说明3个引物组的特异性很好。
依据初始模板量的对数与荧光信号采集所需循环数的关系建立标准曲线，引物组DK600、PA302、PC502的荧光定量标准曲线图分别如图6、图7和图8的C图所示，由标准曲线得出DNA浓度对数值与Ct值的线性方程分别为：
DK600 y＝-3.0395x+35.624(引物组DK600)；
PA302 y＝-3.0832x+35.977(引物组PA302)；
PC502 y＝-3.3487x+36.126(引物组PC502)。
引物组DK600、PA302、PC502的荧光定量标准曲线显示Ct值与DNA浓度之间都具有较好线性相关性(R2分别为：0.98，0.98，0.99)，说明本实验的qPCR结果准确性高，香芋软腐病病原菌的实时荧光PCR检测体系和反应条件合理可靠。
实施例5香芋软腐病病原菌特异性引物混合PCR检测，即三种病原菌的同时检测
(一)实验方法
将DK600-F/DK600-R、PA302-F/PA302-R和PC502-F/PC502-R三组特异性引物混合在一起，分别检测D.fangzhongdai CL3、P.aroidearum LJ2和P.colocasium LJ1三种香芋软腐病病原菌的基因组DNA，以及检测三种香芋软腐病病原菌混合后的基因组DNA。
另外，使用三组特异性引物分别单独检测三种香芋软腐病病原菌的混合后的基因组DNA。
(二)实验结果
3个引物组混合后分别对D.fangzhongdai CL3、P.aroidearum LJ2、P.colocasiumLJ1三种香芋软腐病病原菌PCR检测电泳结果如图9的a图所示；
3个引物组混合后对三种香芋软腐病病原菌混合DNA的PCR检测电泳结果如图9的b图所示；
3个引物组单独对三种香芋软腐病病原菌混合DNA的PCR检测电泳结果如图9的c图所示。
结果表明，3个引物组混合体系能够独立扩增出三种香芋软腐病病原菌对应的特异性条带(图9的a图)。
3个引物组混合体系能够在混合DNA样本中清晰地扩增出三种香芋软腐病病原菌对应的特异性条带(图9的b图)，说明3个引物组混合后不影响原PCR扩增反应，未产生非特异条带。
使用3个引物组单独检测三种香芋软腐病病原菌的混合基因组DNA能够扩增出三种香芋软腐病病原菌对应的特异性条带，也说明了引物组检测结果不受其他病原菌的干扰，特异性很好(图9的c图)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种能够检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)的特异性基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种能够检测鉴定环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)的特异性基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种能够检测鉴定芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)的特异性基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种能够检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的特异性基因片段组合，其特征在于，所述特异性基因片段组合包括权利要求1～3任一或任几所述特异性基因片段；所述香芋软腐病病原菌为方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacterium colocasium)中的一种或几种。
5.权利要求1～3任一所述特异性基因片段或权利要求4所述特异性基因片段组合作为检测靶点，在检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacteriumcolocasium)中一种或多种病原菌方面的应用，或制备检测病原菌产品中的应用，或在监测香芋软腐病中的应用，或制备监测香芋软腐病产品中的应用。
6.检测权利要求1～3任一所述特异性基因片段或权利要求4所述特异性基因片段组合的试剂，在检测鉴定方中达迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai)、环状果胶杆菌(Pectobacterium aroidearum)、芋头果胶杆菌(Pectobacteriumcolocasium)中一种或多种病原菌方面的应用，或在监测香芋软腐病中的应用，或在制备检测或监测产品中的应用。
7.一种检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的引物组，其特征在于，包括检测权利要求1～3任一所述特异性基因片段或权利要求4所述特异性基因片段组合的引物对。
8.根据权利要求7所述引物组，其特征在于，所述引物组为引物对DK600-F/DK600-R、PA302-F/PA302-R、PC502-F/PC502-R中的任一或任几对，所述引物对DK600-F/DK600-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，引物对PA302-F/PA302-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示，引物对PC502-F/PC502-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
9.一种特异性检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的试剂盒，其特征在于，含有检测权利要求1～3任一所述特异性基因片段或权利要求4所述特异性基因片段组合的试剂。
10.一种特异性检测香芋软腐病病原菌或监测香芋软腐病的方法，其特征在于，以权利要求1～3任一所述特异性基因片段或权利要求4所述特异性基因片段组合作为靶点，对待测样本进行检测，根据结果判断待测样本是否含有香芋软腐病病原菌或是否感染软腐病；如检测结果为任一靶点或任几个靶点阳性，则待测样本含有香芋软腐病病原菌或感染软腐病；如检测结果全部为阴性，则待测样本未含有香芋软腐病病原菌或未感染软腐病。
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| CN118147335A true CN118147335A (zh) | 2024-06-07 |
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