CN112680534A - 一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用。本发明所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的理论TM值较野生序列的相差4‑6℃，可在定量PCR检测中，快速、实时、准确监测由标准品引起的污染，避免传统的试剂盒标准品组件与样本间的交叉污染，影响对样本的准确定量。本发明识别标准品污染简单方便，无需额外仪器和操作步骤，仅通过对定量PCR熔解曲线的识别，便可实时快速判定任何可能的标准品扩增污染，节省人力物力，经济性高。

Description

一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR 标准品及其应用

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌sRNA标准品的设计、制备和实时定量PCR检测，能够在结核分枝杆菌sRNA的荧光定量PCR检测中、确定标准品污染所致假阳性反应。本发明属于微生物学领域。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的小RNA(small RNA，sRNA)是在菌体中表达量较高，有二级结构，具有稳定性的一类RNA；在感染组织中，MTB的sRNA高表达。研究表明，在结核分枝杆菌感染的小鼠肺组织中，MTS0997、MTS1338和MTS2823这三种结核分枝杆菌sRNA的表达水平最高([1]DV I,OIu T,NN L,et al.ExpressionofMycobacterium tuberculosis small RNAs in mice models oftuberculosis.Bioorganicheskaia khimiia,2014.40(2):253-256.[2]KB A,I C,NR T,etal.Sequence-based analysis uncovers an abundance of non-coding RNA in thetotal transcriptome of Mycobacterium tuberculosis.PLoS pathogens,2011.7(11):e1002342.)。所以，对MTB sRNA的检测有利于进一步深入研究sRNA的作用、探索MTB sRNA作为特异性诊断标志物的价值。

近年来，在临床病原微生物核酸的检测中，实时荧光定量PCR技术应用广泛。但该技术要求严格的质量控制，以避免检测中污染的产生。即便如此，作为一种核酸扩增技术，典型的PCR可产生多达10⁹个目标序列拷贝，如果雾化，即使最小的雾化也会含有多达10⁶个扩增产物。因此，检测体系中微量的污染就会造成大量的扩增产物，严重影响检测结果。PCR检测过程中的污染来源除了大量操作的样本导致的交叉污染，更多的来自于标准品的序列。因为，质粒等标准品在单位容积内浓度高，在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖及其很强的生命力，其污染环境的可能性也很大。经重复扩增相同的目标序列后可能大量的累积并存在于实验室环境中。所以在分子生物学实验室中因标准品引起的PCR污染比较常见。

对于PCR污染的防控，目前已报道的方法主要针对于反应过程中已出现的污染处理，例如，丁旭等人发明的“一种防止PCR污染的方法及其应用”(公开号CN106337045A)，在常规PCR反应体系中加入一定量的Benzonase核酸酶，去除PCR反应体系中的外源微生物或气溶胶污染的DNA；姚见尔等人发明的“一种利用限制性内切酶防止PCR污染的方法”(公开号CN101768629A)，在PCR反应体系中加入IIS型限制性内切酶，从而消化反应体系中可能存在的污染物。

但是，在PCR检测中，对污染的快速、早期的确认和识别是至关重要的。这不仅有利于快速判别检测的假阳性结果、避免检测结果的误判，更有利于早期识别污染来源，从而利于操作人员追踪污染来源，在后续检测中有针对性的对已识别的污染进行处理和过程把控。然而，针对较为常见的标准品的污染问题，目前市面上还没有较为成熟的产品加以解决。所以迫切需要一种实时、快速、经济、方便的PCR污染识别方法，减少假阳性结果的出现，利于快速对PCR污染进行防控处理。

发明内容

本发明目的是提供一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品，并建立一种实时、快速、准确地区分PCR标准品信号和待检特异性靶标信号的核酸定量PCR检测方法，克服了现有核酸定量PCR检测技术中，标准品组件与待检样本间交叉污染导致的假阳性检测结果，提高了核酸定量PCR检测的特异性和准确性。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明选取了结核分枝杆菌小RNAMTS0997的基因序列中的一段野生序列，删除部分碱基后，使突变后的核苷酸序列的理论TM值较野生序列的相差4-6℃，故将突变的核苷酸序列作为sRNA标准品序列。人工合成sRNA标准品序列，确定实时定量PCR引物，引物的扩增区域需包括发生缺失突变的区域，并建立荧光定量PCR检测体系。将sRNA标准品逆转录后的cDNA梯度稀释，不同浓度的标准品经实时定量PCR扩增后，分析sRNA标准品序列的扩增曲线、扩增效率以及sRNA标准品的稳定性和重复性。

本发明的一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品，所述的标准品为一段RNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一对用于检测所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的引物，优选的，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，优选的，所述的引物用于实时荧光定量PCR检测时，其qPCR体系如下所示：

qPCR反应条件如下所示：

进一步的，本发明还提出了所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用，所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的理论TM值较野生序列的相差4-6℃，故可用于识别假阳性反应。

其中，优选的，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS0997。

更进一步的，本发明还提出了所述的引物在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

其中，优选的，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS0997。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1.本发明所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的理论TM值较野生序列的相差4-6℃，可在定量PCR检测中，快速、实时、准确监测由标准品引起的污染，避免传统的试剂盒标准品组件与样本间的交叉污染，影响对样本的准确定量。

2.使用本发明的sRNA标准品识别标准品污染简单方便，无需额外仪器和操作步骤，仅通过对定量PCR熔解曲线的识别，便可实时快速判定任何可能的标准品扩增污染，节省人力物力，经济性高。

3.使用本发明的sRNA标准品在低拷贝核酸的检测中，能够有效地避免交叉污染导致的假阳性，提高检测的特异性。

4.本发明的sRNA标准品可以作为定量PCR核酸检测试剂盒的标准品组件使用。

5.使用本发明的sRNA标准品可用于定量结核分枝杆菌的低拷贝sRNA，对研发和使用新型结核病诊断标志物，提高结核病检出率，有重要意义。

附图说明

图1为不同浓度的sRNA标准品在荧光定量PCR时的扩增曲线

图2为RNA标准品#0997(-21)进行荧光定量PCR扩增建立的标准曲线。

图3为突变型与野生型标准品经RT-qPCR扩增时的熔解曲线。

其中，A图为突变型#0997(-21)RNA标准品的熔解曲线，TM值85℃。B图为野生型#0997-WT RNA的熔解曲线，TM值为91℃。C图为突变型与野生型标准品熔解曲线的差异比较。

图4为不同浓度#0997(-21)标准品污染荧光定量PCR检测体系时的熔解曲线。

其中，A-H分别为标准品在10⁷-10⁰copy/μL浓度下污染BCG菌体样本时的熔解曲线。I为无标准品污染时BCG菌体中sRNA MTS0997的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 sRNA标准品序列及引物设计

选取结核分枝杆菌小RNAMTS0997的基因序列中的一段野生序列，删除部分碱基后，使突变后的核苷酸序列的理论TM值较野生序列的相差4-6℃，与原始序列相比，在扩增序列中间带有突变位点的sRNA标准品序列命名为#0997(-21)，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。标准品全长92nt，PCR扩增长度为86nt。

表1 sRNA标准品序列

2.PCR引物序列

扩增#0997(-21)序列和细菌中的MTS0997序列所用的引物为同一套，引物序列见表2。

表2扩增RNA的引物序列

实施例2建立sRNA标准品实时定量PCR检测体系并绘制标准曲线

1、RNA逆转录

(1)取sRNA标准品#0997(-21)(SEQ ID No.1)干粉一管(0.6nmol)，以100μl DEPC处理水溶解。1mol RNA为6.02×10²³个拷贝数(copies)，0.6nmol的RNA干粉标准品为3.6×10¹⁴copies，100μl DEPC处理水溶解后为3.6×10¹²copies/μl。

(2)将sRNA标准品进行10的倍比稀释(10¹²-10⁰copies/μl，10μl的RNA标准品和90μl的DEPC处理水)。

(3)取各浓度的1μl sRNA标准品用于逆转录。

逆转录体系：

逆转录程序为：25℃10min，42℃15min，85℃5min。

2、每个稀释倍数的cDNA取2μl做qPCR实验

(1)qPCR体系(含引物，DEPC处理水，qPCR mix，cDNA)

(3)qPCR反应条件：

3、结果判定：

(1)10倍差梯度稀释的sRNA标准品样本(1.8×10⁹～1.8×10²copies/μl)，经荧光定量PCR方法扩增后，得到图1所示的不同稀释度标准品的扩增曲线。该标准曲线呈光滑的“S”型曲线，并且范围内的各梯度样本在指数期的扩增曲线呈明显的均匀平行关系，所以表明该标准品具有较好的扩增效率以及较高的扩增稳定性。

(2)用标准品对应的Ct值与拷贝数制作标准曲线，结果如图2所示。标准曲线方程为：Y＝-3.4768x+41.443，R²＝0.9903，扩增效率为93.92％。

该实验表明，用所设计发明的sRNA标准品建立的逆转录荧光定量PCR(reversetranscription quantitative PCR,RT-qPCR)标准曲线，可以用于建立MTS0997核酸绝对值定量RT-qPCR检测法，RNA标准品的标准工作曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.47，R²＝0.99)。

而且，该标准品具有较大的检测范围1.8×10⁹～1.8×10²copies/μl。并且，扩增效率为93.9％，R²＝0.99，具有较高的灵敏度。

实施例3 sRNA标准品的稳定性和重复性测试

将实施例2中的sRNA标准品的标准曲线制作过程重复三次。三次结果的CT值如表3。实验结果显示，3次重复实验得到的CV均小于1.5％，说明sRNA标准品具有较高的稳定性和重复性。

表3 sRNA标准品的稳定性和重复性

实施例4细菌培养与RNA提取

1、BCG培养：将一支卡介苗粉末(0.25mg/支)溶于200μL注射用生理盐水，接种于5mL含10％ADC的7H9培养基中，37℃，210r/min震荡培养16-30天。

2、总RNA提取：离心收集菌体，加入终浓度为4mg/ml的溶菌酶，静置5min后，5s/3s超声30个循环。加入500μl Trizol，按说明书的操作常规提取细菌总RNA。

3、野生型MTS0997的检测

参照实施例2中的逆转录体系和荧光定量PCR体系检测BCG菌体RNA中的野生型MTS0997。

4、分析MTS0997标准品与野生型MTS0997的熔解曲线

本发明所设计的sRNA标准品#0997(-21)序列与野生型RNAMTS0997，经荧光定量PCR扩增后的熔解曲线如图3。

野生型RNA为BCG细菌RNA，MTS0997在BCG细菌中稳定高表达。将细菌RNA与本发明所设计的#0997(-21)RNA进行PCR后，发现二者的熔解曲线峰型唯一无杂峰，提示qPCR产物为特异性产物。

比较二者熔解曲线TM值，本发明所设计的sRNA标准品(#0997(-21))扩增产物的TM为85℃左右，野生型序列的扩增产物TM为91℃左右。突变序列TM值低于野生型序列TM值6℃，所以二者同时被扩增后，可通过熔解曲线判断扩增产物的模板来源。即在检测样本RNA时，若出现本发明中的sRNA标准品污染时，可通过分析熔解曲线TM值的差异加以识别。

实施例5测定荧光定量PCR体系中标准品污染的可检出范围

1、将#0997(-21)标准品cDNA 10倍梯度稀释后(10⁷-10⁰copies/μL)与100ng BCG菌体总cDNA混合，模拟荧光定量PCR中标准品污染情况。

2、对混合样本按照实施例2所述的方法进行荧光定量PCR方法扩增，分析不同浓度污染后扩增产物的熔解曲线，确定能够检测到的污染范围。

3、结果判定：

如图4，可见在标准品浓度为10⁷-10¹copies/μL时，都出现了TM值为85℃的特征峰，且在大于10⁷copies/μL时只出现标准品的熔解曲线。随着污染标准品拷贝数的下降，其熔解曲线高度逐渐下降。当达到标准品含量低至10⁰copies/μL时，TM值为85℃的特征峰不再出现，说明此荧光定量PCR体系中标准品污染量大于10¹copies/μL时便可检出，但是仅在10⁶-10¹copies/μL时出现双峰。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 92

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gguuagugac caaucgaaag ugccggaaga cggggugaac gcaagagcag aaggcggugu 60

cagaagaguc aucugcccau guguaccggu gu 92

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ccggtacaca tgggcaga 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

caatcgaaag tgccggaaga 20

Claims (8)

1.一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品，其特征在于，所述的标准品为一段RNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一对用于检测权利要求1所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的引物。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物用于实时荧光定量PCR检测时，其qPCR体系如下所示：

qPCR反应条件如下所示：

5.权利要求1所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用，所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的理论TM值较野生序列的相差4-6℃，故可用于识别假阳性反应。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNAMTS0997。

7.权利要求2或3所述的引物在制备检测结核分枝杆菌sRNA表达水平试剂中应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌sRNA为sRNA MTS0997。

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