CN113621719A

CN113621719A - 杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用

Info

Publication number: CN113621719A
Application number: CN202110924690.XA
Authority: CN
Inventors: 刘琴; 蒋家窕; 樊煜航; 张元兴; 王蓬勃
Original assignee: Shanghai Weizhong Biotechnology Co ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Shanghai Weizhong Biotechnology Co ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113621719B

Abstract

本发明提供了杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用。本发明首次确定以EvpP基因作为检测杀鱼爱德华氏菌的特异性靶基因。本发明也揭示了一组可特异性鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂，其基于重组酶聚合酶扩增和侧向流技术(RPA‑LF)进行检测。本发明中还优化了进行RPA‑LF检测的方法。本发明的试剂以及检测方法具有良好的再现性、特异性以及灵敏度，同时还具有操作便捷、检测时间快、特异性及灵敏度高的特点。

Description

杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用

技术领域

本发明属于病原体检测领域，更具体地，本发明涉及一种杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对海产品的需求量越来越大，中国水产业的养捕比逐年提高。规模化、集约化、高密度的养殖模式逐渐成为中国鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，产生的潜在问题就是水产养殖病害问题的日益严重。病害一旦出现，会造成大面积的水体污染，不仅对水产养殖动物有极高的致死率，也威胁着人们的身体健康。

爱德华氏菌感染鱼类后引起胃肠炎症和出血性败血症，造成鱼类大量死亡，严重威胁水产养殖业。其中，杀鱼爱德华氏菌是爱德华氏菌属中毒性最强的菌种之一。

杀鱼爱德华氏菌感染能造成鱼类出血性败血症以及内脏组织的坏死等病症，统称为爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，对水产经济的发展造成威胁。杀鱼爱德华氏菌是经济养殖鱼种鲆鲽类(大菱鲆、牙鲆等)腹水病的首要病原，死亡率高，目前在全世界范围流行，且危害极大，能感染牙鲆、大菱鲆、鳗鲡、真鲷、鲑鱼、罗非鱼、鲤鱼等多种重要经济鱼类，造成水产养殖业的经济损失。

尽管本领域开发了一些检测方法，但传统的爱德华氏菌检测方法，例如选择性培养基和生理生化试验检测等，存在操作方法费时费力、低特异性、低灵敏度等技术缺陷，尚不能满足病害防治的要求。同时，本领域也亟待对于不同类型的爱德华氏菌进行精确的甄别，开发出高特异性、高灵敏度地针对杀鱼爱德华氏菌的检测方法及检测试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定杀鱼爱德华氏菌的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物以及所述引物的扩增产物相应的探针进行重组酶聚合酶扩增和侧向流技术检测(RPA-LF)；若检测阳性，则表明待测样品中包含杀鱼爱德华氏菌。

在一个或多个实施方式中，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物。

在一个或多个实施方式中，更佳地所述可检测标记物为生物素(Biotin)。

在一个或多个实施方式中，所述引物的扩增产物相应的探针为以下结构的探针：荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物。

在一个或多个实施方式中，所述的荧光基团为FAM；

在一个或多个实施方式中，所述阻止链延伸的效应物为C3 Spacer。

在一个或多个实施方式中，所述的待测样品包括：来自杀鱼爱德华氏菌宿主或潜在宿主的样品，来自存在杀鱼爱德华氏菌宿主或潜在宿主的食物、饲料、器具、液体(如水样)、场所(如养殖场地)。

在一个或多个实施方式中，所述的方法不是以诊断(如诊断细菌感染)为直接目的的，不是诊断性方法。

在一个或多个实施方式中，所述的杀鱼爱德华氏菌的宿主主要为鱼类。

在一个或多个实施方式中，所述的鱼类包括淡水鱼类或海水鱼类。

在一个或多个实施方式中，所述的鱼类如但不限于：牙鲆、大菱鲆、鳗鲡、真鲷、鲑鱼、罗非鱼、鲤鱼等。

在一个或多个实施方式中，进行重组酶聚合酶扩增时，反应温度为39±2℃；较佳地为39±1℃。

在一个或多个实施方式中，进行重组酶聚合酶扩增时，反应时间为3～30分钟(如4、6、8、12、16、18、22、26、28分钟)；较佳地为5～20分钟；更佳地为10～15分钟。

在本发明的另一方面，提供引物和探针的用途，用于制备鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其中，所述的引物是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物，所述的探针是所述引物的扩增产物相应的探针；

在一个或多个实施方式中，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物；更佳地所述可检测标记物为生物素(Biotin)。

在一个或多个实施方式中，所述引物的扩增产物相应的探针为以下结构的探针：荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物；较佳地，所述的荧光基团为FAM；较佳地，所述阻止链延伸的效应物为C3 Spacer。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其中包括：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物以及所述引物的扩增产物相应的探针，用于进行重组酶聚合酶扩增和侧向流技术检测。

在一个或多个实施方式中，所述的用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒中，所述SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物；更佳地所述可检测标记物为生物素(Biotin)。

在一个或多个实施方式中，所述的用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒中还包括选自下组的材料：DNA提取试剂；琼脂糖凝胶电泳试剂；用于RPA扩增反应的酶；缓冲液；阴性对照；ddH₂O；醋酸镁；试纸条(如纳米胶体金试纸条)；和/或，记载了进行RPA-LF检测的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、特异性检测试剂的筛选中，一些代表性的引物组的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2、RPA-LF反应中，不同反应温度(30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃)下的检测结果。

图3、RPA-LF反应中，不同反应时间(0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min)下的检测结果。

图4、RPA-LF检测方法的特异性分析。

图5、RPA-LF检测方法的灵敏度分析；

(A)PCR法的检测限(琼脂糖凝胶电泳结果)；

(B)RPA-LF其最低检测限(纸条检测结果)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究分析和筛选，首次确定以EvpP基因作为检测杀鱼爱德华氏菌的特异性靶基因。本发明也揭示了一组可特异性鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂，其基于重组酶聚合酶扩增和侧向流技术(RPA-LF)进行检测。本发明中还优化了进行RPA-LF检测的方法。本发明的试剂以及检测方法具有良好的再现性、特异性以及灵敏度，同时还具有操作便捷、检测时间快、特异性及灵敏度高的特点。

靶基因及检测试剂的筛选

传统的爱德华氏菌检测方法，例如选择性培养基和生理生化试验检测等，存在操作方法费时费力、低特异性、低灵敏度等技术缺陷，尚不能满足病害防治的要求。此外，现阶段应用广泛的实时荧光定量PCR(qPCR)，设备仪器要求高，但稳定性、准确性相对而言常常不能满足精细检测的需要，特别是针对复杂样品。

爱德华氏菌具有多种种类，包括杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida,CCTCC208068)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，ATCC15947)、保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae，ATCC33379)、鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri，ATCC33202)等，尽管它们之间高度相近但却致病能力有很大的区别。因此，对它们进行准确的检测、鉴定是非常关键的。但是，鉴于爱德华氏菌的多种类、不同种类菌株之间基因组序列的同源性也非常高，且还存在很多与之接近的鱼类病菌。如何准确、便捷地(最好实时地)判断出杀鱼爱德华氏菌一直是本领域关注的课题，目前实践中所用方法实际上存在较高比例的假阳性和假阴性现象，不同型别之间的误判可能性较大。因此，合适的靶标基因的获得是尤为重要的。

本发明中，经过筛选、分析以及实验研究，撇除了很多种属间特异性不理想的基因，以及撇除了很多在种内保守性不理想的基因，最终确定以爱德华氏菌的EvpP基因作为检测靶基因。

本领域中，对于RPA引物及探针的设计还没有一个严格的设计标准，难循规律，所以往往需要进行大量的筛选和验证工作。同时，引物的筛选的最好要贴合实际检测时的状况。目前本领域还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，这使得研究人员对候选引物进行测试和筛选的工作尤为重要。同时，对于RPA这一反应而言，根据PCR原理设计的引物通常不能套用于RPA，其往往无法达到RPA对于重组效率的要求。同样的，绝大多数基于PCR原理所设计的探针也并不适合套用于RPA反应。尤其是那些基于聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性与RPA无法实现兼容。因此，基于合适的靶标基因，进一步获得合适的检测试剂也是重要的。

为了实现基于等温扩增法的检测(无需PCR过程)，本发明人进行了引物以及探针的研究筛选。一方面等温扩增法对扩增产物长度、GC含量等要求高，另一方面如前段所述爱德华氏菌型别较多、特异性检测位置的甄别不易，使得从基因组中找到合适的、特异性高、灵敏度高的特异性鉴定区域非常困难。针对杀鱼爱德华氏菌，本发明人解决了这些技术难题，制备了可特异区分杀鱼爱德华氏菌的检测试剂。最终获得的检测试剂特异性良好，不会与其它型别的爱德华氏菌以及其它致病菌发生交叉反应。

试剂及试剂盒

本发明人通过杀鱼爱德华氏菌及其它以及其它物种在基因层面的比较和筛选，获得了适用于RPA-LF方法的引物、探针，从而建立了用于检测杀鱼爱德华氏菌的试剂/试剂盒，达到精确鉴定杀鱼爱德华氏菌的目的。本发明的试剂盒，可以实现对于杀鱼爱德华氏菌的特异性检测，并不会因体系复杂而导致假阳性以及假阴性，特异性和灵敏度均非常理想。

因此，本发明提供一组引物，所述的引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本发明的这些引物还可以用可检测标记物如放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明还提供一种探针，所述的探针具有如下的结构：荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物。较佳地，所述的探针携带有可检测标记物如荧光标记物，从而便于进行识别或检测。

本发明还涉及一种用于同时鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的引物；更佳地，所述的试剂盒中还探针，所述的探针具有如下的结构：荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定杀鱼爱德华氏菌的辅助试剂，如(但不限于)：

(A)提取DNA(即制备RPA-LF反应的模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；和/或

(B)提取DNA的试剂盒；和/或

(C)配合RPA-LF方法的酶(重组酶聚合酶)；

(D)配合RPA-LF方法的检测载体，如试纸条。

所述的重组酶聚合酶是配合RPA-LF方法的关键性的酶，其能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定杀鱼爱德华氏菌的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、规模化批量检测杀鱼爱德华氏菌的目的。

RPA-LF检测方法

本发明人通过杀鱼爱德华氏菌及其它以及其它物种在基因层面的比较和筛选，获得了适用于RPA-LF方法的引物、探针，从而建立了用于检测杀鱼爱德华氏菌的RPA-LF方法，达到精确鉴定待测样品中杀鱼爱德华氏菌的目的。

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”可互换使用，是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。

RPA-LF方法的主要原理在于：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

本发明人还比较了RPA-LF反应过程中所涉及的多种条件，包括反应体系、反应组分的添加量、反应时间、反应温度等等，并且发现反应温度的高低与反应的扩增效率显著性相关。在此基础上，本发明人优化了反应温度，作为本发明的优选方式，进行重组酶聚合酶扩增时，反应温度为39±2℃；较佳地为39±1℃。

本发明人也发现，由于本发明具有非常突出的引物和探针作为检测试剂，RPA-LF反应过程所需的时间非常短。作为本发明的优选方式，进行重组酶聚合酶扩增时，反应时间为3～30分钟；较佳地为5～20分钟；更佳地为10～15分钟。

利用本发明的引物及探针，只需进行短时间的RPA-LF反应，进一步可结合琼脂糖凝胶电泳和/或侧向流技术，判断相应扩增产物的有无，从而准确、快速地判断待测样品是否含有杀鱼爱德华氏菌。这一方法的一个特点是：所需的样品量很少，对于微量的杀鱼爱德华氏菌也能检出，灵敏度非常高。

本发明的方法中，提取基因组DNA可以采用本领域已知的各种技术，或者可以运用本领域已经商品化的试剂盒来进行。

本发明的方法中，琼脂糖凝胶电泳可以采用本领域已知的各种技术，或者可以运用本领域已经商品化的试剂盒来进行。

经全面测试，本发明建立的检测方法是特异于杀鱼爱德华氏菌的检测，该检测方法的灵敏度达到飞克级；且具有良好的可重复性，因此建立的该检测方法效果特别优异。

本发明的主要优点在于：

(1)揭示基于RPA-LF反应的特异性鉴定杀鱼爱德华氏菌的检测试剂(引物和探针)，所述的检测试剂特异性良好，对于杀鱼爱德华氏菌能够实现特异性扩增，而对于其它爱德华氏菌以及其它物种则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的基于RPA-LF反应的检测试剂或含有所述检测试剂的试剂盒进行检测，可快速、大批量地检测杀鱼爱德华氏菌，适合于任何场所的规模化检测。从待测样品中快速准确地区分杀鱼爱德华氏菌，不受体系内其它物质的干扰，并且所需样品量少，操作简单。

(3)与PCR方法相比，本发明基于RPA-LF反应的检测方法，所需的成本大大降低，反应的时间也显著减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、菌种及其培养

1、菌种来源

(1)爱德华氏菌

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida,CCTCC208068)，迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda，ATCC15947)、保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae，ATCC33379)、鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri，ATCC33202)。

(2)其它水产致病菌和常见菌

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida，XSDHY-P)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida，AS02)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum，MVM425)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，CCTCC209306)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi，VIB647)，大肠杆菌(Escherichia coli，DH5a)。

(3)细菌培养

杀鱼爱德华氏菌，迟缓爱德华氏菌，鲶爱德华氏菌，保科爱德华氏菌，溶藻弧菌接种于LB固体培养基，30℃培养18h，挑取单菌落于LB液体培养基30℃过夜培养至对数生长期。

鳗弧菌，杀香鱼假单胞菌，杀鲑气单胞菌，哈氏弧菌接种于LB固体培养基，22℃培养18h，挑取单菌落于LB液体培养基22℃过夜培养至对数生长期。

大肠杆菌划线接种于LB固体培养基，37℃培养18h，挑取单菌落于LB液体培养基37℃过夜培养至对数生长期。

(4)基因组提取

取1ml上述培养后的新鲜菌液，使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化，中国)提取各细菌基因组DNA，将其溶解于100μl ddH₂O中，-20℃保存备用。

实施例2、靶基因以及特异性检测试剂的筛选

本发明人分析了多种杀鱼爱德华氏菌的基因组特点，并综合分析了爱德华氏菌属内的其它爱德华氏菌以及与爱德华氏菌亲缘关系较近的其它物种的基因组特点。经过大量的研究比较和实验测试，撇除了很多种属间特异性不理想的基因，以及撇除了很多在种内保守性不理想的基因，最终确定以爱德华氏菌的EvpP基因作为检测靶基因。限于篇幅，未被选择的其它基因的分析结果以及实验验证没有一一列举在实施例中。

接着，本发明人以该特异性基因上的多个特定位点设计检测引物和探针来分析检测结果的特异性和准确性。本发明人设计了多种多样的引物和探针，以及考虑了多种扩增方案，从中选择适用于特异性检测，灵敏度以及特异性俱佳的检测试剂。其中，表1中显示了一部分针对EvpP序列的RPA引物；同时也提供了本发明人优化设计的探针。

表1、引物和探针序列

限于篇幅，前期筛选过程中其它检测方案以及检测试剂没有一一列举在实施例中。

考察表1中的引物的扩增效果，包括利用以下的引物组：

EvpP-1-F及EvpP-1-R(F1+R1)；

EvpP-1-F及EvpP-2-R(F1+R2)；

EvpP-1-F及EvpP-3-R(F1+R3)；

EvpP-2-F及EvpP-1-R(F2+R1)；

EvpP-2-F及EvpP-2-R(F2+R2)；

EvpP-2-F及EvpP-3-R(F2+R3)；

EvpP-3-F及EvpP-1-R(F3+R1)；

EvpP-3-F及EvpP-2-R(F3+R2)；

EvpP-3-F及EvpP-3-R(F3+R3)。

每个引物组分别使用5pg～50ng的杀鱼爱德华氏菌基因组进行RPA反应，对于反应产物利用琼脂糖凝胶电泳分析。

反应体系：冻干酶(1管)，缓冲液16.7μl，正向引物2.1μl，反向引物2.1μl，探针0.6μl，基因组模板1μl(1ng/μl，阴性对照为ddH₂O)，ddH₂O 26.5μl，醋酸镁2.5μl。

反应温度39℃，反应时间15min，之后进行琼脂糖凝胶电泳。每组样本设置5个重复的孔。

RPA扩增反应体系中包含的冻干酶、缓冲液、ddH2O均购买自江苏奇天基因生物科技有限公司；试纸条购买自山东潍坊安普未来生物科技有限公司。

结果如图1，与其它各组相比，EvpP-1-F及EvpP-1-R(F1+R1)的扩增效率最高，而其它多组引物均存在扩增产物的条带不显著的问题。

实施例3、RPA-LF反应条件的分析

选择EvpP-1-F及EvpP-1-R(F1+R1)引物，进行本实施例的RPA-LF试验，其中，对引物对进行修饰改造，RPA上下游引物，RPA-LF上下游引物，探针如表2。

表2

其中，“-/idSp/-”表示第32位碱基T后连接脱碱基位点四氢呋喃。

本实施例中，进行反应温度和反应时间的优化。

反应温度分别设置为：30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃。

反应时间分别设置为：0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min。

反应结束后，取5μl RPA反应液用PBS稀释到100μl，使用纳米胶体金试纸条(安普未来生物)进行基于侧向流技术(LF)的检测。

在其它反应条件相同的条件下，进行反应温度的测试(30℃，33℃，36℃，39℃，42℃，45℃，48℃)，其中反应时间为15min，结果如图2。

根据图2可见，本发明的检测试剂在39℃时反应效率最高，因此约39℃的温度是相对最为优选的。

在其它反应条件相同的条件下，进行反应时间的测试(0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min)，其中反应温度为39℃，结果如图3。

根据图3可见，本发明的检测试剂在5min即可达到一定程度的阳性可视化条带，10min及之后则阳性可视化条带非常深。

实施例4、RPA-LF检测方法的特异性分析

本实施例中，选择并提取9种常见的水产致病菌和常见菌的基因组，包括迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌、保科爱德华氏菌、杀香鱼假单胞菌、杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、哈氏弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌。

将基因组DNA稀释到100pg/μl，进行RPA-LF检测，反应体系同实施例3不变(其中反应时间为10min，反应温度为39℃)，结果如图4。

根据图4，除杀鱼爱德华氏菌为阳性，其余9种菌和阴性对照均未出现阳性。

因此，本发明的检测试剂及检测方法具有良好的针对杀鱼爱德华氏菌的特异性，即使对爱德华氏菌属的其它菌也丝毫不产生假阳性。

实施例5、RPA-LF检测方法的灵敏度分析

1、RPA-LF检测

本实施例中，将杀鱼爱德华氏菌基因组DNA稀释为不同梯度：10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，进行RPA-LF检测，反应体系同实施例3不变(其中反应时间为10min，反应温度为39℃)，检测结果如图5B。

根据图5B结果可见，RPA-LF其最低检测限为10fg/μl。

2、PCR法的检测

作为比较，本发明人也运用PCR法进行检测，本发明人优选的PCR引物如表3。

表3

PCR法的检测结果如图5A。

根据图5A，PCR法的检测限为100pg/μl。

根据上述，RPA-LF其最低检测限为10fg/μl，PCR法的检测限为100pg/μl，RPA-LF的灵敏度约为PCR的1000倍。

3、成本比较

并且，PCR需要较为昂贵的PCR仪，需要非常专业的人员操作，操作繁琐，进行PCR反应的耗时也比较长，一般约在2小时左右。而本发明的方法则无需特殊仪器，操作简单，整个过程仅需约5-15min，结果判断简单易懂。

因此，本发明优化的检测试剂以及检测方法，具有操作简单快速、灵敏性高、特性强等特点，适合于规模化检测或各种抽样现场的就地检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

上海纬中生物科技有限公司

<120> 杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用

<130> 215458

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtgatcaaag aaaactggag ctctctcgac tt 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gccattccgg tacgatggcg gtctgcgcca gc 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgctatctcc ctggtggagc ccggtccagc ca 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaccgtcagg tttggaatat agaactgtgt 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aatattgaaa attggtggct actgatatgc c 31

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

caggtttgga atatagaact gtgtggcccc gc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gtctatgcct ggttcggtgg atttaagggc at 32

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tcgcgcattg ataatg 16

Claims

1.一种鉴定杀鱼爱德华氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物以及所述引物的扩增产物相应的探针进行重组酶聚合酶扩增和侧向流技术检测；若检测阳性，则表明待测样品中包含杀鱼爱德华氏菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物；更佳地所述可检测标记物为生物素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物的扩增产物相应的探针为以下结构的探针：

荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物；

较佳地，所述的荧光基团为FAM；

较佳地，所述阻止链延伸的效应物为C3 Spacer。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品包括：来自杀鱼爱德华氏菌宿主或潜在宿主的样品，来自存在杀鱼爱德华氏菌宿主或潜在宿主的食物、饲料、器具、液体、场所。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行重组酶聚合酶扩增时，反应温度为39±2℃；较佳地为39±1℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行重组酶聚合酶扩增时，反应时间为3～30分钟；较佳地为5～20分钟；更佳地为10～15分钟。

7.引物和探针的用途，用于制备鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其中，所述的引物是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的引物，所述的探针是所述引物的扩增产物相应的探针；

较佳地，所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物；更佳地所述可检测标记物为生物素；或

所述引物的扩增产物相应的探针为以下结构的探针：荧光基团-SEQ ID NO:5-/idSp/-SEQ ID NO:6-阻止链延伸的效应物；较佳地，所述的荧光基团为FAM；较佳地，所述阻止链延伸的效应物为C3 Spacer。

8.一种用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于，其中包括：SEQ ID NO:1和SEQID NO:4所示的引物以及所述引物的扩增产物相应的探针，用于进行重组酶聚合酶扩增和侧向流技术检测。

9.如权利要求8所述的用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于，所述SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:4所示的引物的末端标记有可检测标记物；更佳地所述可检测标记物为生物素；或

10.如权利要求8或9所述的用于鉴定杀鱼爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

DNA提取试剂；

琼脂糖凝胶电泳试剂；

用于RPA扩增反应的酶；

缓冲液；

阴性对照；

ddH₂O；

醋酸镁；

试纸条，如纳米胶体金试纸条；和/或

记载了进行RPA-LF检测的方法的使用说明书。