CN109266770A - 一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法。本发明提供的方法包括：构建杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株；利用荧光定量PCR分别检测sRNA在野生株和hfq突变株中的表达量，根据二者表达量的差异判定该sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。本发明提供的方法能够快速、准确地确定sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系，操作步骤简单，无需RNA免疫共沉淀等技术难度高的实验操作，可实现高通量检测和鉴定，大大降低了检测成本，易于广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法。
背景技术
杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)，之前又被称为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，是水产重要致病菌，能感染牙鲆、大菱鲆、鳗鲡、真鲷、鲑鱼、罗非鱼、鲤鱼等多种重要经济鱼类，其感染能造成鱼类出血性败血症以及内脏组织的坏死等病症统称为爱德华氏菌病(edwardsiellosis)。该病在全世界范围流行，且危害大，已给水产养殖业造成了巨大的经济损失。虽然杀鱼爱德华氏菌致病性研究已取得了积极进展，多种致病相关因子和系统被发现和研究，其全基因组序列图谱也已完成，但目前杀鱼爱德华氏菌的发病机制仍不清楚，它在侵染过程中如何适应宿主体内不利的环境条件，通过何种机制在细胞内生存和繁殖等等，这些都是杀鱼爱德华氏菌致病机制研究中亟待阐明的问题。
近年来，一种称为非编码的小RNA(non-coding regulating small,sRNA)引起微生物相关研究人员的重视，已成为了病原微生物的研究热点之一，Science、Nature、Cell和PNAS等高端杂志相继发表了多篇关于细菌sRNA的研究报道，研究表明sRNA调控细菌铁吸收、群体感应、生物被膜形成以及对环境胁迫的适应和毒力基因的表达等多种生理过程，是多种病原菌致病作用所必需的。细菌sRNA的发现不仅改变了蛋白质是基因表达的主要调节者这一传统观念，更令人关注的是其对阐明细菌致病机理具有重要的意义。目前对sRNA的研究主要集中在人类、哺乳动物和植物的致病菌，而对鱼类致病菌sRNA的研究鲜有报道。研究表明，鱼类致病菌大部分sRNA需借助于RNA分子伴侣蛋白Hfq来实行其调控功能，Hfq可以稳定sRNA～mRNA的相互作用。因此，快速、准确地鉴定sRNA是否为Hfq依赖性sRNA对进一步研究鱼类致病菌的致病机理意义重大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法，包括：
构建杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株；
利用荧光定量PCR分别检测sRNA在杀鱼爱德华氏菌野生株和hfq缺失突变株中的表达量；
根据二者表达量的差异确定该sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。
本发明提供的方法根据sRNA在杀鱼爱德华氏菌野生株和hfq缺失突变株中的表达差异确定该sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。二者表达量存在显著差异(p<0.05)，判定该sRNA与Hfq蛋白存在依赖关系，即该sRNA为Hfq蛋白依赖型sRNA。二者表达量不存在显著差异(p>0.05，或P＝0.05)，则判定该sRNA与Hfq蛋白不存在依赖关系，即该sRNA为Hfq蛋白非依赖型sRNA。
在一些实施方案中，杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株构建方法为：
扩增hfq基因缺失后的目标片段，将所述目标片段克隆到自杀质粒中，获得重组自杀质粒；
将所述重组质粒转化大肠杆菌后与杀鱼爱德华氏菌野生菌株进行接合转移，经抗性筛选、测序，获得杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株。
在一些具体实施例中，所述自杀质粒为pDM4。
在一些具体实施例中，所述大肠杆菌为E.coliS17-1λpir。
本发明提供的方法中，扩增hfq基因缺失后的目标片段，所述目标片段为hfq基因缺失222～255bp的DNA片段，所述缺失发生在hfq基因第13位～267位的核苷酸之间。
在一些具体实施例中，所述目标片段为hfq基因缺失222bp的DNA片段，所述缺失发生在hfq基因的第16位～237位，所述目标片段序列如SEQ IDNO:5所示。
在一些实施方案中，所述目标片段由如下方法获得：
以杀鱼爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1所示的引物F1、SEQ IDNO:2所示的引物R1进行PCR扩增，获得PCR产物1；
以杀鱼爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:3所示的引物F2、SEQ IDNO:4所示的引物R2进行PCR扩增，获得PCR产物2；
将所述PCR产物1和PCR产物2混合作为PCR扩增模板，以F1/R2为引物，进行重叠PCR扩增，获得目标片段。
本发明提供的方法包括：构建杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株；利用荧光定量PCR分别检测sRNA在野生株和hfq突变株中的表达量，根据二者表达量的差异判定该sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。本发明提供的方法能够快速、准确地确定sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系，操作步骤简单，无需RNA免疫共沉淀等技术难度高的实验操作，可实现高通量检测和鉴定，大大降低了检测成本，易于广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为sRNA082在野生株和hfq突变株中差异表达分析，其中，**P<0.01，*P<0.05；
图2为sRNA在野生株和hfq突变株中差异表达分析，其中，TX01表示野生株，TXhfq表示hfq突变株，**P<0.01，*P<0.05。
具体实施方式
本发明公开了一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株的构建
(1)利用重叠PCR技术获得缺失hfq基因222bp片段的目标片段：以杀鱼爱德华氏菌基因组为模板，采用F1/R1(F1：GGATCCGGATTGATCCGGTCGCC，SEQ IDNO:1；R1：CTGCCTGCTTGCCCC TTAGCCATTCT，SEQ IDNO:2)为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃3min预变性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，65℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min，PCR产物回收纯化，获得PCR产物1；以杀鱼爱德华氏菌基因组为模板，采用F2/R2(F2：GGCAAGCAGGCAGCAGCTACCA，SEQ IDNO:3；R2：GGATCCCGGTCGGTCTCCAACTG，SEQ IDNO:4)为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃3min预变性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，64℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min，PCR产物回收纯化，获得PCR产物2；将上述两段PCR产物混合，采用F1/R2为引物进行重叠PCR扩增，PCR条件为：94℃1min预变性模板DNA，然后94℃40s，50℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，64℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min，获得缺失了hfq基因222bp片段的目标片段，如SEQ IDNO:5所示；
(2)自杀重组质粒的构建：PCR产物直接与T载体链接，测序验证无误后用BamH酶切，酶切产物与经过BglII酶切后的pDM4连接，获得重组的自杀质粒；
(3)同源重组：重组自杀质粒转化S17-1λpir，转化子与野生菌株进行接合转移从而使自杀质粒转移到野生菌株中，获得的转化结合子涂布在含10％蔗糖LB平板上进行筛选；
(4)缺失突变株的鉴定：以F3/R3(F3:GGATTGCGTGGCACAGGT,SEQ IDNO:6；R3:CAAACTCGCTCAGGTCTTCG，SEQ IDNO:7)为引物，利用菌落PCR对蔗糖平板上的菌落进行筛选，经电泳检测，PCR产物大小为478bp的菌落为阳性菌落，再经抗性检测和测序，最终确定获得了hfq突变株。
实施例2实时荧光定量PCR分析
本实施例利用实时荧光定量PCR分析sRNA082在野生株和突变株中的表达差异。
方法：杀鱼爱德华氏菌野生株和hfq突变株培养至对数期(OD＝0.8)，收集菌体，利用Omega公司EZNA总RNA提取试剂盒提取RNA，RNA用无RNase的DNaseI处理，处理后取1μgRNA样品，用Invitrogen公司Superscript II reverse transcriptase进行反转合成cDNA；以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR：试剂为TakaraPrimeScriptTM RT-PCR KitII；反应参数为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环；sRNA引物(以杀鱼爱德华氏菌sRNA012为例)，082RTF:AACGGGCGGTGCTACTAAAT，SEQ IDNO:8；082RTR:CGGAACGAAAAAGCAGGAAT，SEQ IDNO:9；内参基因引物(16S rRNA基因)，16SRTF:GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG，SEQ IDNO:10；16SRTR:CGTGTGTAGCCCTGGTCGTA，SEQ IDNO:11；基因相对表达量的计算公式为2-ΔΔCt法，其中ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。
经计算，sRNA082在杀鱼爱德华氏菌hfq缺失突变株中的表达量相比野生株中的表达量和降低了3.69倍，P<0.01，确定sRNA082为Hfq依赖型sRNA，结果见图1。
实施例3准确性检测试验
采用本发明实施例1的方法和实施例2的实时荧光定量PCR实验条件对19个sRNA样本进行鉴定，其中，19个样本经转录组测序，确定均为Hfq依赖型sRNA。结果见图2。
结果显示，本发明提供的方法对上述19个样本检测，确定16个样本为Hfq依赖型sRNA，sR063、sR009、sR162三个样本为Hfq依赖型sRNA，准确率为84.2％。表明本发明提供的方法能够快速、准确地鉴定出sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法
<130> MP1827398
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
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<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatcccggt cggtctccaa ctg 23
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggctaagg ggcaagcagg cagcagctac catcacggtg gtcaggccgc gtctcagccc 60
actcagggca gtgatgacgc tgaataa 87
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggattgcgtg gcacaggt 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaactcgct caggtcttcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgggcggt gctactaaat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggaacgaaa aagcaggaat 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcacaagcgg tggagcatgt gg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtgtgtagc cctggtcgta 20
Claims (7)
1.一种快速鉴定杀鱼爱德华氏菌sRNA的方法，其特征在于，包括：
构建杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株；
利用荧光定量PCR分别检测sRNA在杀鱼爱德华氏菌野生株和hfq基因缺失突变株中的表达量；
根据二者表达量的差异确定该sRNA与Hfq蛋白之间的依赖关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株构建方法为：
扩增hfq基因缺失后的目标片段，将所述目标片段克隆到自杀质粒中，获得重组自杀质粒；
将所述重组质粒转化大肠杆菌后与杀鱼爱德华氏菌野生菌株进行接合转移，经抗性筛选、测序，获得杀鱼爱德华氏菌hfq基因缺失突变株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述自杀质粒为pDM4。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli S17-1λpir。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标片段为hfq基因缺失222～255bp的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标片段序列如SEQ IDNO:5所示。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目标片段由如下方法获得：
以杀鱼爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:1所示的引物F1、SEQ IDNO:2所示的引物R1进行PCR扩增，获得PCR产物1；
以杀鱼爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ IDNO:3所示的引物F2、SEQ IDNO:4所示的引物R2进行PCR扩增，获得PCR产物2；
将所述PCR产物1和PCR产物2混合作为PCR扩增模板，以F1/R2为引物，进行重叠PCR扩增，获得目标片段。
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Citations (1)
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| CN101948791A (zh) * | 2010-09-21 | 2011-01-19 | 华东理工大学 | 一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用 |
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| CN113621719B (zh) * | 2021-08-12 | 2023-08-18 | 华东理工大学 | 杀鱼爱德华氏菌的快速检测方法及应用 |
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