JP2002500875A - 病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法 - Google Patents
病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、基本的にインビトロにて「オフ」であり、インビボの感染過程の間に選択的に「オン」となるプロモーターを有する発現ベクター系を用いて遺伝子産物の発現レベルの減少の変化に対する病原体の感受性を測定する方法を提供する。選択される病原体の成長または感染に不可欠であると、この方法により同定された遺伝子および遺伝子産物もまた提供される。加えて、この方法により同定された標的遺伝子のために設計された治療用組成物も提供される。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、インビトロでは基本的に「オフ」であり、感染過程にて選択的に「
オン」となるプロモーターを有する発現ベクター系を用いて、遺伝子産物の発現
レベルの減少の変化に対する病原体の感受性を測定する方法を提供する。この方
法を用いれば、阻害に対して最も感受的である遺伝子の標的を、選択される病原
体に対する新規な治療法を開発するための分子標的として選択することができる
。
オン」となるプロモーターを有する発現ベクター系を用いて、遺伝子産物の発現
レベルの減少の変化に対する病原体の感受性を測定する方法を提供する。この方
法を用いれば、阻害に対して最も感受的である遺伝子の標的を、選択される病原
体に対する新規な治療法を開発するための分子標的として選択することができる
。
【０００２】 （背景技術） 最新の科学的研究における主たる目標は、遺伝子を同定し、配列決定して特徴
付けることである。遺伝子を同定し、その配列を決定し、その生物学的機能を特
徴付けることにより、組換え技法を利用して、大量の有用な遺伝子産物、例えば
、蛋白およびペプチドを産生することが可能である。また、遺伝子配列を知るこ
とで、選択された遺伝子の不当な発現および／または抑制により特徴付けられる
、あるいは遺伝子機能に対する外部因子、例えば、発癌性物質または催奇物質の
影響により特徴付けられる、植物および動物の種々の病態の診断、予測および処
置に対するキーポイントを得ることができる。 さらに、遺伝子産物を基礎とする、特定の遺伝子配列を同定するための種々の
技法が記載されている。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９１／０７０８７（１９
９１年５月３０日公開）を参照のこと。加えて、所望の配列を増幅するための方
法も記載されている。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９１／１７２７１（１９９
１年１１月１４日公開）を参照のこと。
付けることである。遺伝子を同定し、その配列を決定し、その生物学的機能を特
徴付けることにより、組換え技法を利用して、大量の有用な遺伝子産物、例えば
、蛋白およびペプチドを産生することが可能である。また、遺伝子配列を知るこ
とで、選択された遺伝子の不当な発現および／または抑制により特徴付けられる
、あるいは遺伝子機能に対する外部因子、例えば、発癌性物質または催奇物質の
影響により特徴付けられる、植物および動物の種々の病態の診断、予測および処
置に対するキーポイントを得ることができる。 さらに、遺伝子産物を基礎とする、特定の遺伝子配列を同定するための種々の
技法が記載されている。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９１／０７０８７（１９
９１年５月３０日公開）を参照のこと。加えて、所望の配列を増幅するための方
法も記載されている。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９１／１７２７１（１９９
１年１１月１４日公開）を参照のこと。
【０００３】 しかしながら、有機物の増殖に不可欠な遺伝子を、将来の解析のために容易に
回収されるような方法にて同定することは困難である。必須遺伝子を同定するの
に一般に利用される最も慣用的な方法は、条件致死変異体ライブラリーを作成し
、つづいて適当な許容および非許容条件下で２組のメンバーをスクリーニングに
付すことからなる、多工程プロセスである。次に、候補変異体を、第２のゲノム
ライブラリーに移し、変異体表現型を補足することで所望の遺伝子を単離する。
相補的プラスミドを回収し、サブクローニングに付し、ついで再試験する。しか
し、この操作は、労力を要し、時間を費やして作成した所望の遺伝子を同定し、
かつ回収するのに、複数のサブクローニング工程を含んでなる。
回収されるような方法にて同定することは困難である。必須遺伝子を同定するの
に一般に利用される最も慣用的な方法は、条件致死変異体ライブラリーを作成し
、つづいて適当な許容および非許容条件下で２組のメンバーをスクリーニングに
付すことからなる、多工程プロセスである。次に、候補変異体を、第２のゲノム
ライブラリーに移し、変異体表現型を補足することで所望の遺伝子を単離する。
相補的プラスミドを回収し、サブクローニングに付し、ついで再試験する。しか
し、この操作は、労力を要し、時間を費やして作成した所望の遺伝子を同定し、
かつ回収するのに、複数のサブクローニング工程を含んでなる。
【０００４】 トランスポゾン変異体形成に基づく病原体ビルレンスを単離するための多くの
方法が開発された。これらの方法は、特定のビルレンス−関連因子の喪失につい
てスクリーニングすること（Leeら、J.Infect.Dis. １９８７、１５６：７４１ ）、マクロファージ内の生存についてスクリーニングすること（Fieldsら、Proc
.Nat'l Acad. Sci. １９８６、８３：５１８９）および上皮細胞の浸透について
スクリーニングすること（Finlayら、Mol.Microbiol. １９８８、２：７５７） を包含する。しかし、これらの方法は感染のある段階に制限される。 トランスポゾン変異体をまた、生物の感染実験にて試験した（MIllerら、Infe
ct.Immun.、１９８９、５７：２７５８；およびBilkerら、Mol.Gen.Genet.、１ ９９４、２４８：５４７−５５２）。しかし、細菌遺伝子の包括的なスクリーニ
ングはその能力が不足しているため変異形成細菌のプール内にあるビルレンスを
弱めた変異体を同定することができず、膨大な数の変異体を個々にスクリーニン
グする必要がある。
方法が開発された。これらの方法は、特定のビルレンス−関連因子の喪失につい
てスクリーニングすること（Leeら、J.Infect.Dis. １９８７、１５６：７４１ ）、マクロファージ内の生存についてスクリーニングすること（Fieldsら、Proc
.Nat'l Acad. Sci. １９８６、８３：５１８９）および上皮細胞の浸透について
スクリーニングすること（Finlayら、Mol.Microbiol. １９８８、２：７５７） を包含する。しかし、これらの方法は感染のある段階に制限される。 トランスポゾン変異体をまた、生物の感染実験にて試験した（MIllerら、Infe
ct.Immun.、１９８９、５７：２７５８；およびBilkerら、Mol.Gen.Genet.、１ ９９４、２４８：５４７−５５２）。しかし、細菌遺伝子の包括的なスクリーニ
ングはその能力が不足しているため変異形成細菌のプール内にあるビルレンスを
弱めた変異体を同定することができず、膨大な数の変異体を個々にスクリーニン
グする必要がある。
【０００５】 Henselらは、細菌のビルレンス遺伝子を単離するために、独特なＤＮＡ配列タ
グを有するトランスポゾンを用いる挿入可能な変異誘発系を開発した。Science 、１９９５、２６９：４００−４０３を参照のこと。この系において、特性タグ
化変異誘発（Signature−Tagged mutagenesis）とは、トランスポゾン変異体の 各々が異なるＤＮＡ配列でタグ化されることを意味する。この操作により、細菌
を混合した変異体の母集団に感染した宿主から回収して同定すること、ならびに
ビルレントの弱い変異体を選択することが可能となる。この方法を用いてチフス
熱のネズミ実験にてサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
ビルレンス遺伝子を同定した。さらには、Slauchらは、基本的にはインビトロに
て存在しないが、感染の全体を通して、あるいは感染の種々の期間に存在する、
転写物を同定するための手段を提供する、ＩＶＥＴ技法と称される方法を記載す
る（Methods in Enzymology、１９９４、２３５：４８１−４９２）。しかし、 これらの方法は、生物中に遺伝子産物が完全に存在しない場合の効果またはイン
ビボにおける特異的なアップレギュレーションに関する情報を提供するにすぎな
い。 したがって、病原体の感染性および増殖に不可欠な種々のレベルでの遺伝子を
同定する効果的な方法についての要求がある。
グを有するトランスポゾンを用いる挿入可能な変異誘発系を開発した。Science 、１９９５、２６９：４００−４０３を参照のこと。この系において、特性タグ
化変異誘発（Signature−Tagged mutagenesis）とは、トランスポゾン変異体の 各々が異なるＤＮＡ配列でタグ化されることを意味する。この操作により、細菌
を混合した変異体の母集団に感染した宿主から回収して同定すること、ならびに
ビルレントの弱い変異体を選択することが可能となる。この方法を用いてチフス
熱のネズミ実験にてサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
ビルレンス遺伝子を同定した。さらには、Slauchらは、基本的にはインビトロに
て存在しないが、感染の全体を通して、あるいは感染の種々の期間に存在する、
転写物を同定するための手段を提供する、ＩＶＥＴ技法と称される方法を記載す
る（Methods in Enzymology、１９９４、２３５：４８１−４９２）。しかし、 これらの方法は、生物中に遺伝子産物が完全に存在しない場合の効果またはイン
ビボにおける特異的なアップレギュレーションに関する情報を提供するにすぎな
い。 したがって、病原体の感染性および増殖に不可欠な種々のレベルでの遺伝子を
同定する効果的な方法についての要求がある。
【０００６】 （発明の開示） 一の態様において、本発明は、インビトロにて「オフ」であり、病原体の感染
過程の特定の期間に選択的に「オン」にスイッチが入るプロモーターを用いる、
発現ベクター系の利用を通して病原体の感染性および増殖に不可欠な種々のレベ
ルでの遺伝子を同定する方法を提供する。 本発明のさらなる態様は、病原体の感染性および／または増殖に不可欠であり
、上記した方法により同定される単離遺伝子を提供することである。 本発明のさらにもう一つ別の態様は、上記で同定された遺伝子配列の発現によ
り産生される単離蛋白にある。かかる蛋白は治療用および診断用組成物の開発に
、あるいは薬物を開発する標的として有用である。
過程の特定の期間に選択的に「オン」にスイッチが入るプロモーターを用いる、
発現ベクター系の利用を通して病原体の感染性および増殖に不可欠な種々のレベ
ルでの遺伝子を同定する方法を提供する。 本発明のさらなる態様は、病原体の感染性および／または増殖に不可欠であり
、上記した方法により同定される単離遺伝子を提供することである。 本発明のさらにもう一つ別の態様は、上記で同定された遺伝子配列の発現によ
り産生される単離蛋白にある。かかる蛋白は治療用および診断用組成物の開発に
、あるいは薬物を開発する標的として有用である。
【０００７】 本発明のさらにもう一つ別の形態は、抗生物質、特に広域抗生物質、とりわけ
、これらの必須遺伝子の発現および／またはその遺伝子産物の活性を調節する抗
生物質を同定することにある。 本発明は、選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測定する方法であって、
オン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクター発
現系を調製し；そのベクター発現系にあるプロモーターを潜在的標的遺伝子に関
するリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に連結させ；リボザイムま
たはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択される病原体中に導入
し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染させ；
標的遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し；標的遺伝子発現レベルをその動物にお
ける感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な遺伝子を同定す
る、ことからなる方法を提供する。
、これらの必須遺伝子の発現および／またはその遺伝子産物の活性を調節する抗
生物質を同定することにある。 本発明は、選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測定する方法であって、
オン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクター発
現系を調製し；そのベクター発現系にあるプロモーターを潜在的標的遺伝子に関
するリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に連結させ；リボザイムま
たはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択される病原体中に導入
し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染させ；
標的遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し；標的遺伝子発現レベルをその動物にお
ける感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な遺伝子を同定す
る、ことからなる方法を提供する。
【０００８】 本発明はまた、選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測定する方法であっ
て、オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびレポーター
遺伝子を含むベクター発現系を調製し；そのベクター発現系にある標的遺伝子プ
ロモーターを潜在的標的遺伝子に関するリボザイムまたはアンチセンス構築物と
発現可能に連結させ；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベク
ター系を選択される病原体中に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクタ
ー系を含有する病原体で感染させ；標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定し；ｍ
ＲＮＡのレベルをその動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の
増殖に不可欠な遺伝子を同定する、ことからなる方法を提供する。
て、オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーターおよびレポーター
遺伝子を含むベクター発現系を調製し；そのベクター発現系にある標的遺伝子プ
ロモーターを潜在的標的遺伝子に関するリボザイムまたはアンチセンス構築物と
発現可能に連結させ；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベク
ター系を選択される病原体中に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクタ
ー系を含有する病原体で感染させ；標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定し；ｍ
ＲＮＡのレベルをその動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の
増殖に不可欠な遺伝子を同定する、ことからなる方法を提供する。
【０００９】 その上さらに、本発明によれば、選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測
定する方法であって、オン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺
伝子を含むベクター発現系を調製し；プロモーターのオン／オフ特性がそのベク
ター発現系に保持されていることを確認し；そのベクター発現系にあるレポータ
ー遺伝子を潜在的な標的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と置き
換え；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択さ
れる病原体中に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する
病原体で感染させ；標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定し；ｍＲＮＡのレベル
をその動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な
遺伝子を同定する、ことからなる方法が得られる。
定する方法であって、オン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺
伝子を含むベクター発現系を調製し；プロモーターのオン／オフ特性がそのベク
ター発現系に保持されていることを確認し；そのベクター発現系にあるレポータ
ー遺伝子を潜在的な標的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と置き
換え；リボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択さ
れる病原体中に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する
病原体で感染させ；標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定し；ｍＲＮＡのレベル
をその動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な
遺伝子を同定する、ことからなる方法が得られる。
【００１０】 さらに、選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測定する方法であって、オ
ン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクター発現
系を調製し；そのベクター発現系にある標的遺伝子プロモーターを潜在的な標的
遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に連結させ；リボザ
イムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択される病原体中
に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染
させ；標的遺伝子により発現される蛋白のレベルを測定し；蛋白のレベルをその
動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な遺伝子
および遺伝子産物を同定する、ことからなる方法が提供される。
ン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺伝子を含むベクター発現
系を調製し；そのベクター発現系にある標的遺伝子プロモーターを潜在的な標的
遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に連結させ；リボザ
イムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を選択される病原体中
に導入し；少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染
させ；標的遺伝子により発現される蛋白のレベルを測定し；蛋白のレベルをその
動物における感染の進行と関連付けて選択される病原体の増殖に不可欠な遺伝子
および遺伝子産物を同定する、ことからなる方法が提供される。
【００１１】 選択される病原体が、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ストレプトコ ッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）、スタヒロコッカス（Staphy
lococcus）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、エン テロコッカス（Enterococcus）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococc
us faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シュードモナス・エルジノー
サ（Psudomonas aeruginosa）、エシェリキア（Escherichia）、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）からなる群より選択される方法も提供される。 感染過程にある動物を、齧歯動物、マウス、ラット、ラビットおよびモルモッ
トからなる群より選択する、別の方法も提供される。 本発明はさらに、本発明のベクターを含むキットを提供する。 本発明によって、本発明の方法により用いられるベクター、かかる方法にて用
いられる病原体が提供される。 オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレセプター
遺伝子を含む発現ベクターも提供される。また、潜在的な標的遺伝子用のリボザ
イムまたはアンチセンス構築物に発現可能に連結したオン／オフ特性を有する遺
伝子プロモーターを含むベクターも提供される。
lococcus）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、エン テロコッカス（Enterococcus）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococc
us faecalis）、シュードモナス（Pseudomonas）、シュードモナス・エルジノー
サ（Psudomonas aeruginosa）、エシェリキア（Escherichia）、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）からなる群より選択される方法も提供される。 感染過程にある動物を、齧歯動物、マウス、ラット、ラビットおよびモルモッ
トからなる群より選択する、別の方法も提供される。 本発明はさらに、本発明のベクターを含むキットを提供する。 本発明によって、本発明の方法により用いられるベクター、かかる方法にて用
いられる病原体が提供される。 オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレセプター
遺伝子を含む発現ベクターも提供される。また、潜在的な標的遺伝子用のリボザ
イムまたはアンチセンス構築物に発現可能に連結したオン／オフ特性を有する遺
伝子プロモーターを含むベクターも提供される。
【００１２】 本発明はまた、オン／オフ特性を有するプロモーターおよびレポーター遺伝子
を含む発現ベクターを含む病原体、ならびに潜在的な標的遺伝子用のリボザイム
またはアンチセンス構築物に発現可能に連結したオン／オフ特性を有する遺伝子
プロモーターを含むベクターからなる病原体を提供する。かかる病原体を含む動
物もまた、本発明により提供される。 本発明の他の目的、特性、有利な点および態様は、以下の記載より当業者に明
らかとなるであろう。しかしながら、以下の記載および実施例は、本発明の好ま
しい具体例を記載するが、本発明を説明するにすぎないものである。開示されて
いる発明の精神および範囲内にある種々の変形および修飾も、以下の記載を読む
ことで、さらには本発明の開示とは別の記載から、当業者であれば容易に理解す
るであろう。
を含む発現ベクターを含む病原体、ならびに潜在的な標的遺伝子用のリボザイム
またはアンチセンス構築物に発現可能に連結したオン／オフ特性を有する遺伝子
プロモーターを含むベクターからなる病原体を提供する。かかる病原体を含む動
物もまた、本発明により提供される。 本発明の他の目的、特性、有利な点および態様は、以下の記載より当業者に明
らかとなるであろう。しかしながら、以下の記載および実施例は、本発明の好ま
しい具体例を記載するが、本発明を説明するにすぎないものである。開示されて
いる発明の精神および範囲内にある種々の変形および修飾も、以下の記載を読む
ことで、さらには本発明の開示とは別の記載から、当業者であれば容易に理解す
るであろう。
【００１３】 （発明を実施するための最良の形態） 多種の病原体の抗菌物質に対する耐性機構の生化学的な基礎知識は今では公知
である。これらの機構は、単独で、あるいは協力して、院内感染および地域獲得
感染の両方に見られる抗菌物質耐性の問題をエスカレートさせる原因となってい
る。これらの問題を解決するのに研究者が採用する主たる方法は、現存する薬物
をさらに改良しようとすることである。これらの方法はかかる耐性病原体による
感染との戦いにいくらかは貢献をしているが、新しい方法が必要とされている。 生物の増殖に不可欠な遺伝子または遺伝子産物を熟知することで感染性病原体
の処置を開発する鍵を得ることができる。遺伝子のノックアウト研究は、遺伝子
産物が全くないことの効果に関する情報を提供する。しかし、抗菌物質を用いる
療法では、所定の遺伝子産物の活性を完全に撲滅することは稀にしか達成できな
い。加えて、遺伝子産物がインビトロにおける生存力に不可欠である場合、遺伝
子ノックアウトは（簡単な挿入／削除変異誘発によって）形成することができな
い。
である。これらの機構は、単独で、あるいは協力して、院内感染および地域獲得
感染の両方に見られる抗菌物質耐性の問題をエスカレートさせる原因となってい
る。これらの問題を解決するのに研究者が採用する主たる方法は、現存する薬物
をさらに改良しようとすることである。これらの方法はかかる耐性病原体による
感染との戦いにいくらかは貢献をしているが、新しい方法が必要とされている。 生物の増殖に不可欠な遺伝子または遺伝子産物を熟知することで感染性病原体
の処置を開発する鍵を得ることができる。遺伝子のノックアウト研究は、遺伝子
産物が全くないことの効果に関する情報を提供する。しかし、抗菌物質を用いる
療法では、所定の遺伝子産物の活性を完全に撲滅することは稀にしか達成できな
い。加えて、遺伝子産物がインビトロにおける生存力に不可欠である場合、遺伝
子ノックアウトは（簡単な挿入／削除変異誘発によって）形成することができな
い。
【００１４】 本発明は種々のレベルでの遺伝子産物の減少に対する病原体の感受性を測定す
る方法であって、インビトロにて不可欠な遺伝子に用いることができる方法を提
供する。というのも、遺伝子産物のレベルの減少はインビボでのみ起こるからで
ある。選択された標的に関するｍＲＮＡの減少度をモニター観察し、感染の進行
および／または感染細胞より回復した生存数と関連付けることができる。この方
法を用いた場合、インビボにおける阻害に感受的な選択される病原体からの遺伝
子を同定することができ、新規な介入療法を開発するための標的として選択する
ことができる。 「病原体」とは、動物または植物に感染し、動物または植物の細胞または組織
中の核酸配列を複製する能力を有するいずれの生物をもいう。そのような病原体
は一般に感染動物または植物の病態に関連している。かかる病原体は、限定され
るものではないが、細胞内または細胞外で複製するウイルス、あるいは他の生物
、例えば細菌、真菌または寄生体を包含し、それらは通常組織または血液に感染
する。ある種の病原体は連続した区別可能な発達段階、例えば、潜伏期、感染期
および徴候を示す段階に存在することが知られている。病原体は、これらの種々
の段階では、生存に不可欠なものとして異なる遺伝子に依存していると推測され
る。
る方法であって、インビトロにて不可欠な遺伝子に用いることができる方法を提
供する。というのも、遺伝子産物のレベルの減少はインビボでのみ起こるからで
ある。選択された標的に関するｍＲＮＡの減少度をモニター観察し、感染の進行
および／または感染細胞より回復した生存数と関連付けることができる。この方
法を用いた場合、インビボにおける阻害に感受的な選択される病原体からの遺伝
子を同定することができ、新規な介入療法を開発するための標的として選択する
ことができる。 「病原体」とは、動物または植物に感染し、動物または植物の細胞または組織
中の核酸配列を複製する能力を有するいずれの生物をもいう。そのような病原体
は一般に感染動物または植物の病態に関連している。かかる病原体は、限定され
るものではないが、細胞内または細胞外で複製するウイルス、あるいは他の生物
、例えば細菌、真菌または寄生体を包含し、それらは通常組織または血液に感染
する。ある種の病原体は連続した区別可能な発達段階、例えば、潜伏期、感染期
および徴候を示す段階に存在することが知られている。病原体は、これらの種々
の段階では、生存に不可欠なものとして異なる遺伝子に依存していると推測され
る。
【００１５】 本発明の方法にて有用な好ましい病原体は、例えば、ストレプトコッカス、ス
トレプトコッカス・ニゥモニエ、スタヒロコッカス、スタヒロコッカス・アウレ
ウス、エンテロコッカス、エンテロコッカス・フェカーリス、シュードモナス、
シュードモナス・エルジノーサ、エシェリキアおよびエシェリキア・コリを包含
する。 この方法においては、まず、インビトロにおける増殖に不可欠か、または感染
中に不可欠であるかのいずれかにより、抗菌療法用の潜在的な遺伝子標的を同定
する。インビトロにおける増殖に関する不可欠性は、例えば、選択される病原体
の条件致死変異体を形成することにより決定する。変異遺伝子は病原体より調製
したゲノムライブラリーと相補させることにより同定することができる。感染過
程にある遺伝子の不可欠性は、個々の遺伝子欠失／ノックアウトを生じさせるこ
とにより、あるいは無作為な変異誘発操作を行い、つづいて特性タグ化変異誘発
（ＳＴＭ：ヘンセルら、Science、１９９５、２６９：４００−４０５）などの 感染モデルを介してサイクリングした後、負の選択を行うことにより決定される
。
トレプトコッカス・ニゥモニエ、スタヒロコッカス、スタヒロコッカス・アウレ
ウス、エンテロコッカス、エンテロコッカス・フェカーリス、シュードモナス、
シュードモナス・エルジノーサ、エシェリキアおよびエシェリキア・コリを包含
する。 この方法においては、まず、インビトロにおける増殖に不可欠か、または感染
中に不可欠であるかのいずれかにより、抗菌療法用の潜在的な遺伝子標的を同定
する。インビトロにおける増殖に関する不可欠性は、例えば、選択される病原体
の条件致死変異体を形成することにより決定する。変異遺伝子は病原体より調製
したゲノムライブラリーと相補させることにより同定することができる。感染過
程にある遺伝子の不可欠性は、個々の遺伝子欠失／ノックアウトを生じさせるこ
とにより、あるいは無作為な変異誘発操作を行い、つづいて特性タグ化変異誘発
（ＳＴＭ：ヘンセルら、Science、１９９５、２６９：４００−４０５）などの 感染モデルを介してサイクリングした後、負の選択を行うことにより決定される
。
【００１６】 転写が、基本的に、インビトロにてオフであるが、インビボにてオンである遺
伝子の存在を示すものとして、ＩＶＥＴ技法（Slauchら、Methods in Enzymolog
y、１９９４、２３５：４８１−４９２）および感染組織またはインビトロでの 増殖細胞より単離したＲＮＡ全体のＲＴ−ＰＣＲ分析が脚光を浴びている。ゲノ
ムのデータベースを用いて、選択される病原体の予測転写物に対するプライマー
対を設計し、マイクロタイター皿フォーマットに配列する。ＲＮＡ全体をインビ
トロ増殖病原体より単離し、すべてのプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行う
。同様に、種々の適当な動物実験にて選択される病原体の感染より様々な時間に
単離したＲＮＡのすべてを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。所定のｍＲＮＡの内部標
準体、例えばｒＲＮＡまたはハウスキーピング遺伝子に対する割合を示すＰＣＲ
プロフィールを比較して、基本的に、インビトロにて不在であるが、感染の種々
の期間全体を通して、またはその間にオンである、これらの転写物を同定する。
伝子の存在を示すものとして、ＩＶＥＴ技法（Slauchら、Methods in Enzymolog
y、１９９４、２３５：４８１−４９２）および感染組織またはインビトロでの 増殖細胞より単離したＲＮＡ全体のＲＴ−ＰＣＲ分析が脚光を浴びている。ゲノ
ムのデータベースを用いて、選択される病原体の予測転写物に対するプライマー
対を設計し、マイクロタイター皿フォーマットに配列する。ＲＮＡ全体をインビ
トロ増殖病原体より単離し、すべてのプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行う
。同様に、種々の適当な動物実験にて選択される病原体の感染より様々な時間に
単離したＲＮＡのすべてを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。所定のｍＲＮＡの内部標
準体、例えばｒＲＮＡまたはハウスキーピング遺伝子に対する割合を示すＰＣＲ
プロフィールを比較して、基本的に、インビトロにて不在であるが、感染の種々
の期間全体を通して、またはその間にオンである、これらの転写物を同定する。
【００１７】 オン／オフ特性を有する潜在的プロモーターを同定した後、そのプロモーター
領域を、選択される病原体の適当なベクターのレポーター遺伝子の上流にクロー
ンする。「適当なベクター」なる語は、選択される病原体で安定した複製能を有
するベクターを意味する。本発明は、基本的に、インビトロにて「オフ」であり
、感染過程のある期間に選択的に「オン」に変わるプロモーターを用いる発現ベ
クター系を使用することに基づいている。「オン」なる語は、プロモーターがそ
の付着遺伝子の発現を誘発または促進することによりその正常な能力を発揮する
状態を意味し、「オフ」なる語は、プロモーターがその正常な能力を発揮せず、
ほとんどまたは全く検出可能な転写物が得られない状態を意味する。インビトロ
およびインビボ増殖の間、この新たな構築物中に、プロモーターの条件的および
一時的発現、またはその「オン／オフ」特性が保存されていることを、視覚（発
光）により、あるいはレポーターＲＮＡに特異的なプライマーを用いるＲＴ−Ｐ
ＣＲにより確認する。これらの特性の保存をプロモーターで確認した後、レポー
ター遺伝子のコーディング領域を潜在的な標的遺伝子用のリボザイムまたはアン
チセンスＲＮＡ構築物と置き換える。まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を 調節するＩＰＴＧ／ｌａｃＩＰＯとカップリングさせたＴ７プロモーターなどの
標準的な制御可能なプロモーターを用いて、標的遺伝子の発現を阻害するのに最
適なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ配列の測定をインビトロにて行う。
領域を、選択される病原体の適当なベクターのレポーター遺伝子の上流にクロー
ンする。「適当なベクター」なる語は、選択される病原体で安定した複製能を有
するベクターを意味する。本発明は、基本的に、インビトロにて「オフ」であり
、感染過程のある期間に選択的に「オン」に変わるプロモーターを用いる発現ベ
クター系を使用することに基づいている。「オン」なる語は、プロモーターがそ
の付着遺伝子の発現を誘発または促進することによりその正常な能力を発揮する
状態を意味し、「オフ」なる語は、プロモーターがその正常な能力を発揮せず、
ほとんどまたは全く検出可能な転写物が得られない状態を意味する。インビトロ
およびインビボ増殖の間、この新たな構築物中に、プロモーターの条件的および
一時的発現、またはその「オン／オフ」特性が保存されていることを、視覚（発
光）により、あるいはレポーターＲＮＡに特異的なプライマーを用いるＲＴ−Ｐ
ＣＲにより確認する。これらの特性の保存をプロモーターで確認した後、レポー
ター遺伝子のコーディング領域を潜在的な標的遺伝子用のリボザイムまたはアン
チセンスＲＮＡ構築物と置き換える。まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を 調節するＩＰＴＧ／ｌａｃＩＰＯとカップリングさせたＴ７プロモーターなどの
標準的な制御可能なプロモーターを用いて、標的遺伝子の発現を阻害するのに最
適なリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ配列の測定をインビトロにて行う。
【００１８】 ついで標準技法に従って、発現ベクターを選択される病原体に導入する。リボ
ザイムまたはアンチセンスＲＮＡ構築物を有するベクターの選択される病原体へ
の導入は、インビトロにおける標的遺伝子の増殖または発現に影響を及ぼしては
ならない。しかし、その構築物を動物モデルに導入することで、リボザイムまた
はアンチセンスＲＮＡ構築物が発現し、その結果、標的遺伝子の発現が減少する
。遺伝子発現のレベルは、感染の間の種々の時点で感染組織より単離したすべて
のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲでモニター観察し、ｒＲＮＡ、ハウスキーピング遺伝子
または組換え導入したマーカー遺伝子対照および生菌数と関連付けすることがで
きる。標的となるｍＲＮＡの減少を、病状、代謝活性な病原体の数を測定するこ
とのできる薄い組織切片における発光、および治療薬の開発用の遺伝子標的を優
先させる生菌数を含む、感染の進行状況と関連させる。例えば、生菌数に関して
はあまり効果がないが、標的となるｍＲＮＡにて有意な減少が見られるような場
合には、その遺伝子は生菌数の減少がＲＴ−ＰＣＲ分析により標的となるｍＲＮ
Ａの減少と関連している場合ほど魅力的な標的ではないと考えられる。
ザイムまたはアンチセンスＲＮＡ構築物を有するベクターの選択される病原体へ
の導入は、インビトロにおける標的遺伝子の増殖または発現に影響を及ぼしては
ならない。しかし、その構築物を動物モデルに導入することで、リボザイムまた
はアンチセンスＲＮＡ構築物が発現し、その結果、標的遺伝子の発現が減少する
。遺伝子発現のレベルは、感染の間の種々の時点で感染組織より単離したすべて
のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲでモニター観察し、ｒＲＮＡ、ハウスキーピング遺伝子
または組換え導入したマーカー遺伝子対照および生菌数と関連付けすることがで
きる。標的となるｍＲＮＡの減少を、病状、代謝活性な病原体の数を測定するこ
とのできる薄い組織切片における発光、および治療薬の開発用の遺伝子標的を優
先させる生菌数を含む、感染の進行状況と関連させる。例えば、生菌数に関して
はあまり効果がないが、標的となるｍＲＮＡにて有意な減少が見られるような場
合には、その遺伝子は生菌数の減少がＲＴ−ＰＣＲ分析により標的となるｍＲＮ
Ａの減少と関連している場合ほど魅力的な標的ではないと考えられる。
【００１９】 ついで、本発明の方法により同定された遺伝子および遺伝子産物を治療薬およ
び診断薬の設計に使用することができる。例えば、本発明の方法で感染過程にて
選択される病原体に不可欠であると同定された遺伝子およびそれによりコードさ
れた蛋白を、この病原体による感染を処置するための治療薬としての有用性を有
する、天然のまたは合成の化合物をスクリーニングし、開発するための標的とし
て用いることができる。一例として、このような遺伝子によりコードされた蛋白
との結合能を有し、その生物学的活性を阻害する能力を有する化合物は、特定の
微生物の増殖より由来の疾患または障害を予防する薬物生成物として有用である
かもしれない。また、必須の遺伝子の発現を阻害し、あるいはその発現を減少さ
せる化合物は、治療において有用であると考えられる。
び診断薬の設計に使用することができる。例えば、本発明の方法で感染過程にて
選択される病原体に不可欠であると同定された遺伝子およびそれによりコードさ
れた蛋白を、この病原体による感染を処置するための治療薬としての有用性を有
する、天然のまたは合成の化合物をスクリーニングし、開発するための標的とし
て用いることができる。一例として、このような遺伝子によりコードされた蛋白
との結合能を有し、その生物学的活性を阻害する能力を有する化合物は、特定の
微生物の増殖より由来の疾患または障害を予防する薬物生成物として有用である
かもしれない。また、必須の遺伝子の発現を阻害し、あるいはその発現を減少さ
せる化合物は、治療において有用であると考えられる。
【００２０】 そのような治療薬のスクリーニングおよび開発に従来のアッセイおよび技法を
用いることができる。例えば、これらの遺伝子配列によりコードされる蛋白に特
異的に結合するか、または該蛋白を特異的に阻害する化合物を同定する方法は、
簡単に、選択された蛋白または蛋白産物を試験化合物と接触させ、その試験化合
物を蛋白に結合させ、あるとすれば、該蛋白に結合している試験化合物の量を測
定する工程を含むことができる。そのような方法は、試験化合物および蛋白の固
体支持体に固定したインキュベーションを包含する。薬物をスクリーニングする
さらに別の一般的方法は、遺伝子産物またはその一部の構造と類似するまたは相
補的な構造を有する化合物を測定するのに、適当なコンピュータープログラムを
利用し、蛋白への競合結合についてこれらの化合物をスクリーニングしてもよい
。かかる化合物は適当な治療処方に、単独であるいは他の活性成分と組み合わせ
て配合することができる。そのような医薬組成物の処方方法、ならびに適当な医
薬担体などは当業者に周知である。
用いることができる。例えば、これらの遺伝子配列によりコードされる蛋白に特
異的に結合するか、または該蛋白を特異的に阻害する化合物を同定する方法は、
簡単に、選択された蛋白または蛋白産物を試験化合物と接触させ、その試験化合
物を蛋白に結合させ、あるとすれば、該蛋白に結合している試験化合物の量を測
定する工程を含むことができる。そのような方法は、試験化合物および蛋白の固
体支持体に固定したインキュベーションを包含する。薬物をスクリーニングする
さらに別の一般的方法は、遺伝子産物またはその一部の構造と類似するまたは相
補的な構造を有する化合物を測定するのに、適当なコンピュータープログラムを
利用し、蛋白への競合結合についてこれらの化合物をスクリーニングしてもよい
。かかる化合物は適当な治療処方に、単独であるいは他の活性成分と組み合わせ
て配合することができる。そのような医薬組成物の処方方法、ならびに適当な医
薬担体などは当業者に周知である。
【００２１】 したがって、かかる方法を介して、本発明は、これら遺伝子あるいはコードさ
れる蛋白またはそのフラグメントと相互作用し、所望により、その生物学的活性
を強化または減少させうる化合物を提供すると考えられる。かかる化合物もまた
本発明に包含される。 本発明の非常に多くの修飾および変形は上記した明細書中に含まれており、当
業者に明らかであると考えられる。本発明の組成物および方法に対応するかかる
修飾および変形は上記した特許請求の範囲の範囲内にあると考えられる。 本明細書に開示した各文献のその内容を出典明示により本明細書の一部とする
。当該出願が優先権を主張しているいずれの特許出願もその内容を出典明示によ
り本明細書の一部とする。 以下の非限定的な実施例は本発明をさらに詳しく説明するために記載するもの
である。
れる蛋白またはそのフラグメントと相互作用し、所望により、その生物学的活性
を強化または減少させうる化合物を提供すると考えられる。かかる化合物もまた
本発明に包含される。 本発明の非常に多くの修飾および変形は上記した明細書中に含まれており、当
業者に明らかであると考えられる。本発明の組成物および方法に対応するかかる
修飾および変形は上記した特許請求の範囲の範囲内にあると考えられる。 本明細書に開示した各文献のその内容を出典明示により本明細書の一部とする
。当該出願が優先権を主張しているいずれの特許出願もその内容を出典明示によ
り本明細書の一部とする。 以下の非限定的な実施例は本発明をさらに詳しく説明するために記載するもの
である。
【００２２】 （実施例） 実施例１：遺伝子の不可欠性 スタヒロコッカス・アウレウス感染にて発現した遺伝子の不可欠性を、スタヒ
ロコッカス・アウレウスの選択菌株、例えばＲＮ４２２０で感染させた１０2− １０8個の細胞を適当な動物モデル、例えば、ネズミ損傷または腎盂腎炎モデル に導入して測定する。感染組織を感染後の様々な時点で該動物より回収する。す
べてのＲＮＡを組織より単離し、スタヒロコッカス・アウレウスゲノムデータベ
ースを用いて設計したプライマーにより方向付けられるＲＴ−ＰＣＲに付し、実
験下にあるスタヒロコッカス・アウレウス菌株によりコードされるすべての転写
物を増幅する。転写物が一時的かつ条件的に制御されている遺伝子のプロモータ
ーを、Augustinらが、Eur.Ｊ.Biochem.、１９９２、２０４：１１４９−１１５ ４に記載している操作に従って、ｐＣＵ１の独特ＨｉｎｄＩＩＩ部位でエシェリ
キア・コリ／スタヒロコッカス・アウレウスのシャトルベクターにライゲートす
る。このシャトルベクターもまた、ｐＣＵ１の独特なＥｃｏＲＩ部位に挿入され
たスタヒロコッカス・アウレウス翻訳に関する適当なコドンを含有する、レポー
ター遺伝子融合物、ｌｕｘＡＢを担持する。組換え体を選択体としてのアンピシ
リン（１００ｍｇ／ｍｌ）に対する耐性を用いてエシェリキア・コリ中で増幅さ
せる。
ロコッカス・アウレウスの選択菌株、例えばＲＮ４２２０で感染させた１０2− １０8個の細胞を適当な動物モデル、例えば、ネズミ損傷または腎盂腎炎モデル に導入して測定する。感染組織を感染後の様々な時点で該動物より回収する。す
べてのＲＮＡを組織より単離し、スタヒロコッカス・アウレウスゲノムデータベ
ースを用いて設計したプライマーにより方向付けられるＲＴ−ＰＣＲに付し、実
験下にあるスタヒロコッカス・アウレウス菌株によりコードされるすべての転写
物を増幅する。転写物が一時的かつ条件的に制御されている遺伝子のプロモータ
ーを、Augustinらが、Eur.Ｊ.Biochem.、１９９２、２０４：１１４９−１１５ ４に記載している操作に従って、ｐＣＵ１の独特ＨｉｎｄＩＩＩ部位でエシェリ
キア・コリ／スタヒロコッカス・アウレウスのシャトルベクターにライゲートす
る。このシャトルベクターもまた、ｐＣＵ１の独特なＥｃｏＲＩ部位に挿入され
たスタヒロコッカス・アウレウス翻訳に関する適当なコドンを含有する、レポー
ター遺伝子融合物、ｌｕｘＡＢを担持する。組換え体を選択体としてのアンピシ
リン（１００ｍｇ／ｍｌ）に対する耐性を用いてエシェリキア・コリ中で増幅さ
せる。
【００２３】 そうして形成された組換えプラスミドをエシェリキア・コリより単離し、電気
穿孔法によりスタヒロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０に導入し、クロルアン
フェニコール（Chloramphenicol）耐性（１０ｍｇ／ｍｌ）について選択し、つ いでビルレントなスタヒロコッカス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９に移すか、また
は生合成についての遺伝子を担持するように修飾し、ビルレンスに対して作用し
ないことが知られている位置で染色体に挿入されたルシフェラーゼ（Luciferase
）反応のための基質および脂肪酸をリサイクリングする。発光反応のアルデヒド
基質、ドデカノールの蒸気に曝した後に、薄い組織切片中の発光を見ることによ
り、またはインビトロおよびインビボの両方でルシフェラーゼ特異的ｍＲＮＡに
ついてＲＴ−ＰＣＲ解析に付し、プロモーターの特性が保持されているかどうか
を確認することにより、ルシフェラーゼ発現は肉眼で測定される。プロモーター
の「オン／オフ」特性が保存されているならば、ルシフェラーゼ遺伝子のコーデ
ィング配列を、試験される候補遺伝子に特異的なリボザイムまたはアンチセンス
ＲＮＡのものと置き換える。新たな構築物を染色体中のスタヒロコッカス・アウ
レウスの発現に最適化されるルシフェラーゼオペロン全体を担持するように修飾
されているか、あるいはｌｕｘＡＢを担持するように修飾されている、スタヒロ
コッカス・アウレウスに挿入し、組換えクローンをアルデヒドに曝し、発現をモ
ニター観察する。リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡならびにその標的ＲＮＡ
のインビトロ増殖の間の発現をモニター観察し、適当な発現を確認する。ついで
、抗生物質の存在下でその構築物を担持するスタヒロコッカス・アウレウスを一
夜増殖させ、１０2−１０8個の生存細胞を動物モデルに導入することにより、そ
の両方での発現を感染の間モニターする。標的とするｍＲＮＡの減少は、病態、
代謝活性な細菌の数を測定することを可能とする薄い組織切片中の発光、および
遺伝子候補が治療薬の開発に優先され得るように生菌数を含む、感染の進行状況
と関連付けられる。
穿孔法によりスタヒロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０に導入し、クロルアン
フェニコール（Chloramphenicol）耐性（１０ｍｇ／ｍｌ）について選択し、つ いでビルレントなスタヒロコッカス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９に移すか、また
は生合成についての遺伝子を担持するように修飾し、ビルレンスに対して作用し
ないことが知られている位置で染色体に挿入されたルシフェラーゼ（Luciferase
）反応のための基質および脂肪酸をリサイクリングする。発光反応のアルデヒド
基質、ドデカノールの蒸気に曝した後に、薄い組織切片中の発光を見ることによ
り、またはインビトロおよびインビボの両方でルシフェラーゼ特異的ｍＲＮＡに
ついてＲＴ−ＰＣＲ解析に付し、プロモーターの特性が保持されているかどうか
を確認することにより、ルシフェラーゼ発現は肉眼で測定される。プロモーター
の「オン／オフ」特性が保存されているならば、ルシフェラーゼ遺伝子のコーデ
ィング配列を、試験される候補遺伝子に特異的なリボザイムまたはアンチセンス
ＲＮＡのものと置き換える。新たな構築物を染色体中のスタヒロコッカス・アウ
レウスの発現に最適化されるルシフェラーゼオペロン全体を担持するように修飾
されているか、あるいはｌｕｘＡＢを担持するように修飾されている、スタヒロ
コッカス・アウレウスに挿入し、組換えクローンをアルデヒドに曝し、発現をモ
ニター観察する。リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡならびにその標的ＲＮＡ
のインビトロ増殖の間の発現をモニター観察し、適当な発現を確認する。ついで
、抗生物質の存在下でその構築物を担持するスタヒロコッカス・アウレウスを一
夜増殖させ、１０2−１０8個の生存細胞を動物モデルに導入することにより、そ
の両方での発現を感染の間モニターする。標的とするｍＲＮＡの減少は、病態、
代謝活性な細菌の数を測定することを可能とする薄い組織切片中の発光、および
遺伝子候補が治療薬の開発に優先され得るように生菌数を含む、感染の進行状況
と関連付けられる。
【００２４】 実施例２：インビトロ実験にて「オン」である、スタヒロコッカス・アウレウス
プロモーター 発現を「オン」および「オフ」のモードに調整することのできる、プロモータ
ーの具体例として、スタヒロコッカス・アウレウス配列を示す。このオープン・
リーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」という）のプロモーター配列は動物感
染モデルにおいてインビボにて転写されるが、インビトロにて転写されない。こ
のプロモーターを本発明の方法にて用いてもよい。
プロモーター 発現を「オン」および「オフ」のモードに調整することのできる、プロモータ
ーの具体例として、スタヒロコッカス・アウレウス配列を示す。このオープン・
リーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」という）のプロモーター配列は動物感
染モデルにおいてインビボにて転写されるが、インビトロにて転写されない。こ
のプロモーターを本発明の方法にて用いてもよい。
【００２５】 下線で示した２つの好ましい推定プロモーター配列の領域がある。下線および
太字で示される配列番号：１（以下に示す）の配列は最も好ましい推定プロモー
ター領域を示す。この上流に、第２の好ましい推定プロモーター領域（下線だけ
）がある。配列番号：１の配列より転写した遺伝子のＡＴＧ開始コドンをイタリ
ックで示す。本明細書に記載の方法にて試験された遺伝子は、この開始コドンを
含めあるいは除き、プロモーター配列に発現可能にライゲートすることができる
。
太字で示される配列番号：１（以下に示す）の配列は最も好ましい推定プロモー
ター領域を示す。この上流に、第２の好ましい推定プロモーター領域（下線だけ
）がある。配列番号：１の配列より転写した遺伝子のＡＴＧ開始コドンをイタリ
ックで示す。本明細書に記載の方法にて試験された遺伝子は、この開始コドンを
含めあるいは除き、プロモーター配列に発現可能にライゲートすることができる
。
【００２６】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ジュリー・エム・プラット イギリス、エルイー18・１エヌピー、レス ター、ウィッグストン、ハイフィールド・ ドライブ77番 (72)発明者 マーティン・ローゼンバーグ アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロ イヤーズフォード、ミンゴ・ロード241番
Claims (20)
- 【請求項１】 選択される病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法であって
、 （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレポ
ーター遺伝子を含むベクター発現系を調製し； （ｂ）そのベクター発現系中の標的遺伝子のプロモーターを、その潜在的な標
的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に結合させ； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を
選択される病原体に導入し； （ｄ）少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染さ
せ； （ｅ）標的遺伝子の遺伝子発現レベルを測定し；および （ｆ）標的遺伝子の発現レベルを動物における感染の進行と関連付け、その選
択される病原体の成長に不可欠な遺伝子を同定することからなる方法。 - 【請求項２】 選択される病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法であって
、 （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレポ
ーター遺伝子を含むベクター発現系を調製し； （ｂ）そのベクター発現系中の標的遺伝子のプロモーターを、その潜在的な標
的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に結合させ； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を
選択される病原体に導入し； （ｄ）少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染さ
せ； （ｅ）標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定し；および （ｆ）ｍＲＮＡレベルを動物における感染の進行と関連付け、その選択される
病原体の成長に不可欠な遺伝子を同定することからなる方法。 - 【請求項３】 選択される病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法であって
、 （ａ）潜在的な標的遺伝子を同定し； （ｂ）オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレポ
ーター遺伝子を含むベクター発現系を調製し； （ｃ）そのベクター発現系にプロモーターのオン／オフ特性が保存されている
ことを確認し； （ｄ）そのベクター発現系にあるレポーター遺伝子を潜在的な標的遺伝子用の
リボザイムまたはアンチセンス構築物と置き換え； （ｅ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を
選択される病原体中に導入し； （ｆ）少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染さ
せ； （ｇ）標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定し；および （ｈ）ｍＲＮＡのレベルを動物の感染の進行と関連付け、選択される病原体の
増殖に不可欠な遺伝子を同定する ことからなる方法。 - 【請求項４】 選択される病原体中の遺伝子の不可欠性を測定する方法であ
って、 （ａ）オン／オフ特性を有する潜在的な標的遺伝子のプロモーターおよびレポ
ーター遺伝子を含むベクター発現系を調製し； （ｂ）ベクター発現系の標的遺伝子プロモーターを、その潜在的な標的遺伝子
用のリボザイムまたはアンチセンス構築物と発現可能に連結させ； （ｃ）そのリボザイムまたはアンチセンス構築物を含有する発現ベクター系を
選択される病原体に導入し； （ｄ）少なくとも１種の動物をその発現ベクター系を含有する病原体で感染さ
せ； （ｅ）その標的遺伝子で発現した蛋白のレベルを測定し；および （ｆ）蛋白のレベルを動物における感染の進行と関連付け、選択される病原体
の増殖に不可欠な遺伝子および遺伝子産物を同定する ことからなる方法。 - 【請求項５】 選択される病原体がストレプトコッカス属、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ、スタフィロコッカス属、スタフィロコッカス・アウレウ
ス、エンテロコッカス属、エンテロコッカス・フェカリス、シュードモナス属、
シュードモナス・アエルギノサ、エシェリヒア属、およびエシェリヒア・コリか
らなる群より選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 選択される病原体がストレプトコッカス属、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ、スタフィロコッカス属、スタフィロコッカス・アウレウ
ス、エンテロコッカス属、エンテロコッカス・フェカリス、シュードモナス属、
シュードモナス・アエルギノサ、エシェリヒア属、およびエシェリヒア・コリか
らなる群より選択される請求項２記載の方法。 - 【請求項７】 選択される病原体がストレプトコッカス属、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ、スタフィロコッカス属、スタフィロコッカス・アウレウ
ス、エンテロコッカス属、エンテロコッカス・フェカリス、シュードモナス属、
シュードモナス・アエルギノサ、エシェリヒア属、およびエシェリヒア・コリか
らなる群より選択される請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 選択される病原体がストレプトコッカス属、ストレプトコッ
カス・ニューモニアエ、スタフィロコッカス属、スタフィロコッカス・アウレウ
ス、エンテロコッカス属、エンテロコッカス・フェカリス、シュードモナス属、
シュードモナス・アエルギノサ、エシェリヒア属、およびエシェリヒア・コリか
らなる群より選択される請求項４記載の方法。 - 【請求項９】 感染過程にある動物が、齧歯動物、マウス、ラット、ラビッ
トおよびモルモットからなる群より選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 感染過程にある動物が、齧歯動物、マウス、ラット、ラビ
ットおよびモルモットからなる群より選択される請求項２記載の方法。 - 【請求項１１】 感染過程にある動物が、齧歯動物、マウス、ラット、ラビ
ットおよびモルモットからなる群より選択される請求項３記載の方法。 - 【請求項１２】 感染過程にある動物が、齧歯動物、マウス、ラット、ラビ
ットおよびモルモットからなる群より選択される請求項４記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１に記載のベクターを含むキット。
- 【請求項１４】 請求項１に記載のベクター。
- 【請求項１５】 請求項１に記載の病原体。
- 【請求項１６】 オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーター
およびレポーター遺伝子を含む発現ベクター。 - 【請求項１７】 潜在的標的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築
物に発現可能に連結した標的遺伝子プロモーターを含むベクター。 - 【請求項１８】 オン／オフ特性を有する潜在的標的遺伝子のプロモーター
およびレポーター遺伝子を含む発現ベクターを含む病原体。 - 【請求項１９】 潜在的標的遺伝子用のリボザイムまたはアンチセンス構築
物に発現可能に連結した標的遺伝子プロモーターを含むベクターを含む病原体。 - 【請求項２０】 請求項１９の病原体を含む動物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/010,523 US6139817A (en) | 1996-10-15 | 1998-01-21 | Method for determining gene essentiality in a pathogen |
| US09/010,523 | 1998-01-21 | ||
| PCT/US1999/001278 WO1999037330A1 (en) | 1998-01-21 | 1999-01-21 | Method for determining gene essentiality in a pathogen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=21746147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000528310A Withdrawn JP2002500875A (ja) | 1998-01-21 | 1999-01-21 | 病原体中の遺伝子の不可欠性の測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6139817A (ja) |
| EP (1) | EP1047453A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002500875A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US20030124507A1 (en) * | 1997-12-04 | 2003-07-03 | Smithkline Beecham Corporation | Method of generating conditionally expressed mutant cells using expressible antisense sequences |
| US6720139B1 (en) | 1999-01-27 | 2004-04-13 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli |
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