JPH05504672A

JPH05504672A - グラム陰性細菌の同定および検出のためのポリヌクレオチドプローブ，方法およびキット

Info

Publication number: JPH05504672A
Application number: JP2505368A
Authority: JP
Inventors: ヨハネス　ペトラス　マリア　トマセン; アルデゴンダ　マリア　ジョアンナ　スピリングス
Original assignee: ホランド　バイオテクノロジー　ビー．ブイ．
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1993-07-22
Also published as: WO1990011370A1; AU5351790A; NL8900670A; EP0464123A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】グラム陰性細菌の同定および検出のためのポリヌクレオチドプローブ、方法およびキット本発明は、グラム陰性縞菌または種を特異的に認識するポリヌクレオチドプローブに関する。

微生物類の迅速検出は、さまざまな広い分野において極めて重大である０食品領域においては迅速検出によって原料、中間産物および最終産物の微生物学的品質に関する結論が得られるので、経済的にも極めて重要である。この手段によつ５日間を要するという事実は、微生物調定の迅速化がめられていることの例示として役立つことができる。

食品微生物学において重要な役割を果たす細菌の多くの属は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の属する。従って、サルモネ−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ン−（Ｓｈｉ　ｅｌｌａ）およびエルジニア（Ｙｅｒｓｉく、特にこれらの細菌が少数フローラに属しているときにとりわけ難しく、かつこれが通常の場合である０食品微生物学において、この問題は、微生物学的品質を決定するためまたは予防検査を行うためのインジケータ有機体を使用することによって、しばしば回避されている。したがって、特定されていない腸内細菌科の食品中存在は、食品会社の衛生状態を示唆するものとしてイ史用されている。このタイプの測定は、通常、政府当局およびモニターｍ織によっておよび産業界の研究所によって、双方で実施されている。上述のインジケータ有項賄α層吏用はそれなりの価値を示してきたにもかかわらず、さまざまな種の同定を行うことがしばしば必要となっている。

微生物類の迅速測定は、例えば感染を局在化しかつ克つ勝つために、医学および衛生管理においても橿めて重大である。さらに、環境部門における細菌の存在を決定するための迅速かつＡ虜槌を梢去も必要とされている。

細菌を検出するために、被験試料から純粋な培養物を調製することが現在に至っても通常必要とされており、その後、細菌の形態およびその他検査性質に基づき特異軸間またハ特異的群に付いて結論が引き出される。したがって、広く使用されているいわゆるＡＰＩシステムによって微生物は大量の検査群に供さねへそのそれぞれにおいて特異的酵素活性が出現するかどうかを決定する。見いだされた活性を組み合わせて、問題の細菌種または細菌属の示唆が得られる。この方法は手間がかかり、そして、とりわけ、決定的でない、ある目または纒菌群は、特定の確率（１００％ＭＥ＞でのみ検出される。

細菌検出のための一層迅速な診断方法を得るためにさまざまな経路に付いて研究が行われている。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシッンは、極めて将来性のある技術と見なされている。　ＩＫｌａｕｓｎｅｒおよびＷｉｌｓｏｎ、バイオテクノロジー（１３ｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）よ、４７１−４７８．１９８３参ＮＪ、この方法では、原則として細菌種また番謡岨社詳に特異的なりＮＡ断片刃（同定を望む細菌における構遭的に関連したＤＮＡのための２プローブ”として探索される。このタイプの検出技術の大きな利点は、検査が通常の表現型の代わりに遺伝型を対象としていることである０表現されないかまたＬＭを伴ってのみる角結膜炎）は、インビトロにおいてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシッンによって試験できる。さらに、本技術の感受性は、従来技術では材料がいくつかの前処理に供されなければならないがこれが必要でないようなものである。ＤＮＡプローブ使用についてのレビューは、Ｊ、Ａ、Ｍａ　ｔ　ｔｈｅｗｓおよびり、Ｊ。

Ｋｒ１ｃｋａ、アナリティカルストラテジーズ・フォア・ザ・ユース・オブ・ＤＮＡプローブズ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ）：アナリテイ　カルバイオケミストリ（Ａｎａ　ＩＢｉｏｃｈｅｍ、）１旦９．１−２５　（１９８８＞に見いだされる細菌のＤＮＡプローブ開発のために現在まで追跡されてきた経路は、実質的に任意の方法による細菌ＤＮＡの断片化、断片のプラスミドベクターへのクローニングおよび断片が細菌ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするかどうかについての放射性マーカー類の補助による研究である。８ｉめで有望なＰＣＲ操作を使用するために、このような断片類の配列を次に決定しなければならず、その後、オリゴヌクレオチド類力徴されｊｒｚ−＞再度試験される。このタイプのプローフｌの欠点は、それらが長期の手間のかかる調製、その後、さらに、次に調べる細菌種のために全く新しく開発されねばならない調製を必要としていることであり、その結果、このようなプローブ類に基づき試料類中のさまざまな細菌を測定するキットの構成ば実質的に不可能である。リポゾームＲＮＡに基づくプローブ類も同様に公知である；しかじ、いくつかの場合において、これらは、やっかいな交差反応性坏適当な包含性および捌圀すを示す。

グラム陰性側菌類の外膜タンパク質類をコードする遺伝子類のある配列類およびそれに相補性の配列噴は、例えば、食品中、臨床検体または環境中においである特定の種または真の微生物類を検出できるためのポリヌクレオチドプローブとして掻めて適切であることが見いだされた。

したがって、本発明のポリヌクレオチドプローブは、グラム陰性細菌の外膜タンパク質をコードする遺伝子またはメツセンジャーＲＮＡの断片を含有する。

本発明によるポリヌクレオチドプローブの利点は、これｊ（実質的に少数のヌクレオチド！［（１０−４０塩基対のオーダー）しか含有していないことであり、この結果、これは簡単に調製できかつ使用できる。同時に、このプローブは、グラム陰ａｌｉＭのある属または種に特異的であることが証明されている。

このポリヌクレオチドプローブは、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡブロー力またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡプローフ）のいずれかを含有することができる０本文において、用語”ポリヌクレオチド”は分子１個当たりのある特定の最小数の核酸類を示唆しておらず、したがって、この用語は”オリゴヌクレオチド“と絶対的に対照されているものではない。

本発明によるポリヌクレオチドプローブのさらに租点は、他の方法、例えばいわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクシラン）方法によって、ハイブリダイゼーシッンカ刺様に検出可能とできることである。さらに、このプローフ１はキットに組み入れること力慎實的に容易であり、それによって、例えば食品、体液、水試料等において１のグラム陰性細菌類が同定できる。

外膜タンパク質類は、グラム陰性細菌類の細胞エンベロープの外膜に存在するタンパク憇であり、そこでそれらは栄養物（孔形成性外膜タンパク質類またはボリン類（ｐｏｒｉｎｅｓ））および大量に熔解した物質類の輸送を可能とすることおよび外膜の構造および結合に寄与することのようなさまざまな機能を果たしている。これらのタンパク質類は、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ，ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥ、ＬａｍＢ、Ｔｓｘ、ＯｍｐＴ、ＦｈｕＡ、ＢｔｕＢ、ＦｅｐＡ、ＦｅｃＡ等と命名されている。

大腸遇し東Ｌ−Ｌ笠りよ）の外膜タンパク質類は、Ｊ、　Ｔｏｍｍａ　ｓ　ｓ　ｅ　ｎによって、Ｊ、Ａ、Ｆ、Ｏｐ　ｄｅｎ　Ｋａｍｐ、ＮＡＴＯＡＳＩシリーズ、第Ｈ１６巻、３５１−３７３　（１９８８）　、スプリングフェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｖｓｒｌａｇ）、ベルリン−ハイデルベルグによるメンブレンバイオジエネシス（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に記載されている。

緑濃菌’／ｓ−′モ　ス―アエルギノサ（Ｐｓｓｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ）の外股タンパク質Ｆのアミノ酸配列および対応するＤＮＡ配列は、ＢＰ−Ａ−２９７，２９１に記載されている。

グラム陰性纏菌類の外膜タンパク質類は高度に非相同性の断片類を含有しており、すなわち、種々の微生物類において、このタンパク質類の断趨のアミノ酸配列において有意な差が存在している。この顕著な非相同性の結果、細菌類の種また ζ号■冒のｍ１１７！Ｉｑロム均に短い配列で行うことができる。その結果、これらのタンパク質類をコードする遺伝子類は、同様に局所的に著名な非相同性を示す。

これらの遺伝子類は、対応して、！工且Δ、且見ｌΩ、−免匹見旦、２八且旦等と命名される。少数の騙ｅ廁■輩哩の見ユ見旦Φ遺伝子類は、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌｅｙら、ヨーロピアンジャーナル・オブ、バイオケミストリ　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ。

ｃｈａｍ、）Ｊｌ旦４，４６９−４７５　（１９８７）によって、研究されている。

少数の腸内細菌の皇工ｌΔ遺伝子煙は、Ｂｒａｕｎ＆Ｃｏ１ｅ、１９８４、モレキュラー・エンド・ジェぶラルジェネティクス（Ｍｏ　ｌ、Ｇｅｎ、Ｇｏｎｅ　ｔ。

）　Ｌｌｉ、３２１−３２８によって記載されている。

外膜タンパク質類の非相同断片類は細胞表面に露出している外膜タンパク質類の部分に出現し、一方、膜架橋部分は、実質的に保存されている。ゆえに、外股タンパク質類の露出断片類に対応する遺伝子類の断片類は、本発明による特異的ポリヌクレオチドプローブ類のための基盤として特に適切である。

Ａタンパク質の露出部分に対応する”１３−ｍａｒオリゴデオキシヌクレオチドＴＴＴＡＧＴＡＧＡＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣ，ＧＡを含有しているプローブである本発明によプローブ類は、原則として全てのグラム陰性給菌類の外膜タンパク質類に基づき構築されることができ、それ故に、細菌の同一グラム陰性種または属の検出に使用される。腸内細菌科のプローブ類は、これらの細菌Ｔｈ８食る。

本発明によるポリヌクレオチドプローブ類は、目の特定属およびおそらく細示さないことが証明される。しかし、本文において、細菌の属および種の現行分類が決して完全ではないことを述べておかねばならず、その結果、ある特定の属に属する種まが劇ｔｄｔ末プローブ力（同一連名の種を認識しないということが生ずる可能性もある。

しかし、本発明によるブローフｌの属限定は極めて顕著であるので、このような °偽陰性′反応の出現はこの陰性反応を呈する＃Ｊ％Ｂの属に属していないことを示唆するものである。これとは逆に、例えば　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ−属に属しておりかつおそらく単一種にざえ属していることＣＷ、Ｊ、Ｂｒｅｎｎｏｒ、バージエイの系統微生物学マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｎｕａｔ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｔｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１巻　４１０−４１１．　Ｗｉ１１ｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ社、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）　（１９８４）舎利を確認するものである。

本発明によるポリヌクレオチドプルーブ類がこのような高度の排除性および包含性を有しているという事実は、先行技術によるＤＮＡプローブによる結果と照らし合わせると特に驚くべきことである。

単一種の異なる単１１１ｈの外膜タンパク質パターンで観察される均一性の故に、このプロー１の感受性（包倉す　もまた驚くべきことである０例えば、Ｑｖａｒｂｓｋｅおよびｌ−ｕｇｔｓｎｂｅｒｇ　（ジャーナル・オプ・ジェネラルマイクロバイオロジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　１．）１２土、３７３− ３８０（１９８０）ｌ　は、４５の異なる　（Ｅ、ｃｏｌｉ　単離物を５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析によって比較し、これらの株で３６の異なるタイプを観察した。したがって、外膜のさまざまな部分に基づくプローブ類の感受性は、予測できなかったことであった。

本発明によるポリヌクレオチドプローブ゛は、自体公知の操作にしたがって関連ヌクレオチド類を配列することによって、選択した細菌の１個の外膜タンパク質をコードする遺伝子またはメツセンジャーＲＮＡの適当な断片に基づき調製できる。この調製は、ＤＮＡ合成機器を用いて自動化でき、有利である。

以上のようにして得られたプローブの特異的細菌類検出の能力は、例えば、いわゆるスロット−プロット操作（Ｐ、Ｊ、Ｃａｒｔｅｒら、セル（Ｃｅ１１）３８．８３５−８４０　（１９８４）ｌにおけるハイブリダイゼーションによって実証される０本操作においては、検査するべき目または細菌類のＤＮＡは細胞から解離さｉｎ−フィルターに付着さＬ次いで、例えば放射性標識された本発明によるプローブと接触させられる。ハイブリダイゼーション後、試料がヌクレオチド配列と反応した力＼別の言葉で言えばこのヌクレオチド配列を認識したかを例えばオートラジオグラムによって調べる。

一方、いわゆるポリメラーゼチェーンリアクンラン（ＰＣＲ）操作は、ハイブリダイゼーションの検出のために有効にイ吏用でき、Ｒ，に、５ａｉｋｉら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９．４８７　（１９８８）およびＥＰ−Ａ−２００，３６２を参照、この操作によって、ポリデオキシリボヌクレオチド断片は、２つの短いオリゴデオキシヌクレオチド類、いわゆるプライマー類の補助によって異なる温度においてコピーおよび変性サイクル中で効率的に酵素的に複製す顛長いポリデオキシヌクレオチドとして出現する。このようにして、１個の認識されたＤＮＡ断片が２個のプローブｌによって短時間にこのように大量に得ることができ、その結果、放射性ａなしでも検出が可能である。

ハイブリダイゼーション検出のために使用できるもう一つの最近開発された操作は、ウィルスＲＮＡへの結合であり、その後、このプローブは、決定すべきＤＮＡ試料にハイブリダイズされる０次に、ハイブリダイズされたＲＮＡのウィルス複製物の補助によるインビトロ複製によって、いかなるハイブリダイゼーションも実証できる。このようにして、このように大量のハイブリダイズされたＲＮＡが短時間で得ることができ、放射性標識を行わないでも検出が可能である。Ｐ、Ｍ、Ｌｉｚａｒｄｉら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｓｃｈｎｏｌｏｇｙ）旦、１１９７−１１０２　（１９８８）ｇ複数の目内において細菌種または属を例えば食品中に特異的に検出するために、このポリヌクレオチドプローブを使用することができる０本発明によるポリヌクレオチドプローブは、また、阜ｍ菌類を適当な場合には純粋培養物中において医学用途（ａｔのために同定するために非常に適している。

したがって、本発明は、上述のポリヌクレオチドプローブを用いて、グラム陰性細菌、特に腸内細菌科の検出および同定方法にも関している。

本方法は、例えば、検査すべき試料からポリヌクレオチド材料を単離するかまたはそれを公知の方法で担体に付着させること、およびそれを本発明によるプローブと接触させることから構成される。このハイブリダイゼーションは、次に、例えば、”Ｐ−ＡＴＰ、ウィルス複製物等を用いて、種々の方法によって検出できる０本発明による方法は、上記で示唆したＰＣＲ法を用いたときに特に有益であり、この場合、複製されたポリヌクレオチド断片はさまざまな方法で検出可能である。

本発明は、また、グラム陰性細菌の特異的検出／同定用キットに関し、このキットは、上述のポリヌクレオチドプローブを１種以上含をしている。特にこのキットは、１群の腸内細菌科の存在を検査するため組み合わせられたＤＮＡブローフｌを含有している。

このポリヌクレオチドプローブに加えて、本発明によるキットは、また、フィルター類のような（ハイブリダイズされた）ポリヌクレオチドを単離するための手段、標識用勧賞のようなハイブリダイゼーションシグナル検出のための手段、およびＤＮＡ−ポリメラーゼまたはウィルスポリメラーゼのようなハイブリダイズされたポリヌクレオチド断片類のインビトロ復製のための手段、および、細菌類同定を実行するためのその他の手段、およびもし所望であればこのための方法もまた含有している。

下記の実施例は、細胞表面に露出された外膜タンパク質類の部分をコードするポリヌクレオチド６ダ慣、またはこれらに相補性の配列頓力（グラム陰性細菌類の同定のための属特異的ブローフ量として使用できることを例示している。

大施例−土第１ゴヌクレオチド　の　゛よびオリゴデオキシヌクレオチド類は、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８６００　ＤＮＡシンセサイザーの補助によって自動で調製し、次に、高速液体クロマトグラフィによって精製する。このオリゴマー類は、ＭａｎｉａｔｉＳら、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ラボラトリマニュアル、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ＮＹ　（１９８２）の方法を用いて、Ｔ４　ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）　、ウプサラ、スウェーデン）によるＣｒ−”Ｐ）ＡＴＰ　（３０００Ｃ４／ｍｍｏ　ｌ、ア？−シｖムインターナ’ｉ　＊　ナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔ、ｐｌｃ）、アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　、英国）からの３ｚｐリン酸の酵素触媒移行によって、その５゛末端で標識される。

菌株殻よびプヲ冬ｌ上類下記の菌株類を、Ｌ培地中で振とうしながら３７℃で１晩培養した（Ｊ、Ｔ。

ｍｍａｓｓｅｎら、ＥＭＢＯ，Ｊ、２．　１２７５−１２７９　（１９８３）ｌ　、染色体り互且旦欠失を有する　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＣＥ１１９４、およびｌ九見旦誘導株ＣＥ１１９５　（Ｊ、Ｔｏｍｍａｓｓｅｎら、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）土 ↓主、６６８−６７２　（１９８２）１．大腸菌Ｊ旦、旦旦土工）ＢおよびＣ（分子生物学および医用バイオテクノロジー研究所（Ｉｎｓ口Ｌｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ、ウトレヒト大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｕｔｒｅｃｈｔ））、菌血症色者の培１鵠単離した大騙這り延し」Ｌ虹し↓）株Ｓ１．　Ｓ２．　Ｓ３、Ｓ４．Ｓ５．Ｓ６．Ｓ８およびＳ９、健常志願者のふん便から単離したＦｌ。

Ｆ５．Ｆ６．Ｆ９およびＦｌ２、および尿管感染を存する患者の尿から単離した０６、Ｕ７．Ｕ８．Ｕｌ　１およびＵｌ３は、０ｖｅｒｂｅｅｋｅおよびＬｕｇ　ｔｅｎｂｓｒｇ　（ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇ。

ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ　＋、）上２１　３７３−３８０　（１９８０）によって記載されている。ヒトふん便由来腸侵襲　（Ｅ、ｃｏｌｉ）である株ＥＩＥＣ）血液型亜型■、Ｉ　Ｌ　Ｉ　ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｖ［、Ｘおよび未知の血液型亜型、−ベン（Ｓｔａｔｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｈｙｇｉｅｎｅ、Ｂ１１ｔｈｏｖｅｎ）から入手したｔａｒ　ａｅｒｏ　ｅｎｅｓ）、シトロバタ　−・フロウンジ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、タレブノエラ・ニューモニアエ（１＜ＩｅｂｓｉＳｈｉ　５ｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ）　（Ｈ，Ｈｏｆｓｔｒａ、Ｊ、Ｄａｎｋｅｒｔ、ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｔ　ｃｒＳａｇｏ、Ｔ、Ｙｕｒａ、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ　ｏ　１．）　Ｌ３ｉ、４６８−４７７　（１９７９））　、　丈止至主立二士スＩｐ１−４ｐｒｏ−（分子生物学および医用バイオテクノロジー研究所（ｒｎｓｔｉｔｕｔｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｓｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＭｅｄｉｃａＩ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ウトレヒト大学（Ｕｎ！ｖｅｒｓｉｔｙ　。

ｒ　ｕｔｒｅｃｈｔｌｌｌ、およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＫＢ１７１１　（Ｋ、　Ｂａｕｅｒら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６土＋８１３ −８１６（１９８５））であった、下記は、ポリメラーゼチェーンリアクシラン操作のために使用された二大腸菌璽■ユ」」」ｊ−）Ｋ−１２株ＣＧ５Ｃ４２３４ｆ大腸菌］旦、旦！±工）ジェネティクストックセンター（Ｅ、ｃｏ目　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、デパートメント・オブ・ヒューマンジエネティクス（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｅｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、エール大学医学部、ニューヘブン、コネティカット他１丈止±主プニバ± マ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｎａｍａ）およびす火ｉ主之二カスｘＬ丈ｉＬ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＪ２３５３．下記のプラスミド類は、ＤＮＡスポット試験のために使用した：ｐＡＣＹ１８４　（Ａ、Ｃｈａｎｇ、Ｓ、Ｃｏｈｅｎ、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１３４．１１４１−１１５６　（１９７８Ｎおよびその誘導株ｐＪＰ２９　（Ｅ、ｃｏ±１）のｐｈｏＥ遺伝子を含む、Ｄ、Ｂｏｓｃｈら、ジャーナル・オブ・モレキヱラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ、＞１８旦、４４９−４５５　（１９８６）、ｐＫＰ２　（クレブシェラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｎｅｕｍｏｎＩａｅ＞、Ｐ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌｅｙら、ヨーロピアンジャーナル・オブ・バイオケミストリ　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１６４，４６９−４７５　（１９８７）ｌ、およびｐＥｃ１７（舌Ｚデロバタ　−・クロアカニ（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）のｌ九旦旦遺伝子を含む、Ｃ，Ｖｅｒｈｏｅｆら、ジーン（Ｇｏｎｅ）３２　：１０７−１２５（１９８４））、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｆ、Ｂｏｌ　１ｖａｒら、ジーン（Ｇｅｎｅ）　ｌ又：９５−１１３　（１９７７））、およびその誘導株ｐｓＴｌ　（サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｌ立！旦遺伝子部分を含む、Ｑ、５ｐｉｅｒｉｎｇｓ、未公釦。

スロートーブロートハイプ１　イゼーシッ゛（ミニホールド（Ｍｉｎｉｈｏｌｄ）Ｉ　Ｌ　シュライヒャー＆ジェニル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｈｕｅｌ　ｌ）内のニトロセルロース（Ｎ　Ｃ）フィルターＭ（ＢＡ８５−シェライヒヤー・エンド・ジェニル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｈｕｅｌｆ）、カセル（Ｋａｓｓｅｌ）、ドイツ連■を介してゆっくりとろ過した、このフィルター類は、Ｐ、Ｊ、Ｃａｒｔｅｒら、セル（Ｃｅｌ　１）３８．８３５−８４０　（１９８４）　の方法を用いて調製した。、：、のＤＮＡを、４分間（７）ＵＶ照射（λ３２０ｎｍ、Ｌ２７２３．アンカーズミフト（Ａｎｋｅｒｓｍｊ　ｔ））ニヨって、ＮＣフィルターに付着させた。このフィルター類は、０．２５％プロチフ７−（Ｐｒｏｔｉｆａｒ）　（ヌトリシア（Ｎｕｔｒｉｃｊａ）ＮＶ、　ゾーエターメア（Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ）１．６ｘＳＳＣ（９０ｍＭ塩化ナトリウム。

９０ｍＭクエン酸ナトリウム　ｐＨ７，０）中で６０℃で４５分間プレハイブリダイズした。プローブ（１０ｐｍｏｌ　ＤＮＡ）を添加後、このフィルターを６０℃で１．５時間ハイブリダイズさせた。このフィルター類を６ｘｓｓｃで６０ ℃で２回洗浄し、フィルターのオートラジオグラムを、フジ（Ｆｕｊｉ）ＸＡＩフィルムに３日間露出することによって作製した。

ｐざＡノ」（ムＵ承作ニブラスミド溶液１μｌ　（−０，５μｇ／μｍ）をＮＣ上にスポットした。このフィルター類を次にスロット−プロ７トハイプリダイゼーンｇ／法で述べたように処理し、ハイブリダイズさせた。

ボ１メ一一ゼチェーンリアクシッン（ＰＣＲ）　：１土１ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンｘｎｔマー　（Ｐｅｒｋｔｎ　Ｅｌｍａｒ）ＣＲＴＵＳ、ノーオーク（Ｎｏｒｗａ　ｌｋ）、ＵＳＡＩを、ｐＨ８，４の代わりにｐＨ８，８のトリス塩酸を、２単位の代わりに１単位の１見１ＤＮＡポリメラーゼを使用したことおよび最終容量を５０μｍから２５μｌに減量したことを除き、製造業者のインストラフシランに従い使用した０Ｍａｒｍａｒの方法（Ｍａ　ｒ　ｕｍｕ　ｒ、Ｊ、ら、ジャーナＪし・オブ・モレキエラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ｂ　ｉ　ｏ、ンユ、２０８−２１８　（１９６１）ｌにしたがって大腸菌コ旦、三主 ±土）Ｋ−１２株ＣＧ５Ｃ４２３４から単離した染色体ＤＮＡ　Ｓ　１０　ｎ　ｇ＞を本反応における基質として使用した。ＳＴＩ／５Ｔ３ｃおよびＳＴ２／５Ｔ３ｃはプライマーカップルとして使用し、それぞれ２８５個および１５６個の塩基対の断片類が復製された。９２°Ｃで１分間、４２＠Ｃで２分間および６５ °Ｃで２分間の４０サイクルを、プログラム可能なインキュベータブロック（Ｐｆ（Ｃ−１，ニューフ゛ランスウィンクサイエンチフィ７り（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｓｎｔｌｉｃ）Ｂ、Ｖ、　、ソエスト（３ｏｅｓｔ）、オラン列の補助によって行った０反応混合物ｌＯμｍを、１．３％アガロースゲル上で分析した。

ｈ　ｉ　ｍｕ　ｒ　ｉ　ｕｍ）のＯｍｐＡタンパク質の第１、第２および第３断片に基づき合成した。これらの断片類のＤＮＡ配列匣ば、それぞれ１図にＳＴ１．ＳＴ２および５Ｔ３ｃとして示されている。５Ｔ３ｃの包含性および排除性を、スロノトープロソトハイブリダイゼーシラン操作で試験した。４図は、このプローブとのハイブリダイゼーソヨン後のフィルターのオートラジオグラムを示している、下記の株を、フィルターにのせた：ＩＡ、旦工Ａう占」ノ仕（ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、１Ｂ、　Ｓ、パ　７　（ａｎａｍａ）；　ＩＣ，Ｓ、チフィムリウム（ｔｍａｎｉａｅ）；３Ａ、Ｅ、−゛（ｔａｒｄａ）；　３Ｂ、旦、ヱエ三ゲ９；５Ａ、Ｓ、−ビ（ｄｅｒｂ　；５Ｂ、Ｓ、チフィムＴウム　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２；５Ｃ，Ｓ、チフィムリウム（ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｂｐｒｏ；６Ａ、Ｐ、バルガリス　ｖｕｌ　ａｒｉｓ）；６Ｂ、ｇ（ｆ　１ｅｘｎｅｒｉ）；６Ｃ，Ｓ、ゾンネイ　（ｓ　ｏｎｎｅ　ｉ）＠オートラジオグラムにおけるストリークは、このプロープカＷ中の相補性ヌクレオチド配列に結合したことを示している０図は、このプローブカ（鉦のプローブは、他のエン−ロバクー１アセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に反応しない、しかし、使用した試験条件下において、このプローブは、Ｓ。パ　マ（ａｎａｍａ）に反応しない、しかし、ＰＣＲ反応に使用した条件（５に下において、Ｓ、パナマ（ａｆｌａｍａ）から単離した染色体ＤＮＡ（スロット５および６）およびＳ９　チクイム１ウム（ｔ　ｈｉｍａｒｉｕｍとから単離した染色体ＤＮＡ　（スロット３および４）は、基質として使用できることがわかった０人間−Ｌ延！、ｃｏｌｉ）から単離した染色体ＤＮＡ７！ｌ堪質として提供されるとき、２８５個の塩基対の断片（スロット１）の増幅がプロー１ＳＴ１および５Ｔ３ｃを使用したときに日帰に起こり、１５６個の塩基対の断片（スロット２）の増幅がプローブ’ １ＩｓＴ２および５Ｔ３ｃを使用したときに同様に起ごった。この結果は、この３種のプローブ類が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的であることを示している。

大施例一旦存在する極めて近縁の関係を使用した＋Ｗ、Ｊ、Ｂｒｅｎｎｅｒ、科［玉Ｚ之三バクーｉアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、バージエイの系統微生物学７二、フル（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、Ｉｔ’、４１０−４１１頁、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍｓ社、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｓ）　（１９８４）ジャーナル・オプ・バイオケミストリ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｓｍ、）１６４．４６９−４７５　（１９８７））の対応する配列とともにその配列を図２に示しの特異性は、スロットープロントハイブリダイゼーシタン操作の補助によって、試験した。このオートラジオグラムを、図６に示した。下記の株をフィルターにのせた：ＩＡ、旦、Ａう占Ｗノ―堕り口ヨしＬ辷ｒｉｓ）；ＩＢ、旦、バ±ヱバ立ｎｄ上上）　；　２Ｃ，Ｋ、　＝ｓ−モニアエ（ｎｓｕｍｏｎｉａｅ）；３Ａ、旦。

−”（ｔａｒｄａ）；３Ｃ，Ｐ、スチュア−ｆ４　（ｓｔｕａｒｔｉｉ）；４Ａ、ＣＥ１１９５ｉ４Ｂ、ＣＥ１１９４ｉ４Ｃ，ＥＩＥＣ；５Ａ、Ｓｈ、　ゾンネイ（ｓｏｎｎｅ　ｉ）；　Ｉ　；５Ｂ、Ｓｈ、　ゾンネイ　（ｓｏｎｎｅｉ）；５Ｃ，Ｓｈ、−ソ゛ン　イ　５ｏｎｎｅｉ）ｉ６Ａ、Ｓｈ、ジセント盲アエ（ｄ　５ｅｎｔｅｒｉａｓ）；　６Ｂ、Ｓｈ、　ボイジ（ｂＯｄｉｉ）；　６Ｃ，Ｓｈ、７１／クスネＩＪ（ｆｌｅｘｎｅｒｉ）；７Ａ、Ｓｈ、フレクスふり　（ｒ　ｌ　ｅｘｎｅ　ｒ　ｉ）　Ｉ　；　７Ｂ。

ｓｈ、　フレクスネリ　（ｆ　１ｅｘｎｅｒ　ｉ）　■；７Ｃ，Ｓｈ、フレクスネリ　（ｆｌｅｘｎｅｒｉ）［［［；８Ａ、Ｓｈ、フレクスネリ　（ｆ　１ｅｘｎｅｒｉ）ＩＶ；８Ｂ。

ｓｈ、７Ｌ／クスネＩ　（ｆ　１ｅｘｎｅｒｉ）Ｘ；８Ｃ，Ｌ−培地；９Ａ、Ｓｈ、ゾンネイ　（ｓｏｎｎｅｉ）；９Ｂ　Ｓｈ、　ジン不イ　（ｓｏｎｎｅｉ）；９Ｃ，Ｓｈ、フレクスネ’　（ｆ　１ｅｘｎｅｒｉ）Ｖ、このプローブは、試験した全ての之ゲ−（Ｓｈｉ　ｅｌｌａ）株と反応し、および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２　ＣＥ１１９５および腸侵聾性の人騙−ＬαＬヱＬ虹１ｉ）株（ＥＩ　ＥＣ）と反応した患者の尿から単離したい（つかの大騙慎り延Ｌ」と虹Ｌ１）株に付いて、このプローブを試験したこれらの菌株は、種々の０およびに血液型を示した（ＱｖａｒｂｅａｋｓおよびＬｕｇｔａｎｂｓｒｇ　（ジャーナル・オブ・ジェネラルマイクロバイオロジー（Ｊ、Ｇａｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）上２１　３７３−３８０（１９８０）に記載されているように）、７図は、このプローブがこれら全ての異なる菌株類と反応したことを示している。

この結果は、このプローブがシ゛−Ｓｈｉ　ｅｌｌａ）／大腸菌Ｊ旦、！！土工）種に特異的であることを示している。

大施磨里応する配列とともに３図に示してあり、それぞわ−細胞表面に露出した旦、１９アカエ　ｃｌｏａｃａｅ）およびに、　二ｓ−モニアエ（ｎｓｕｍｏｎｉａｅ）のＰｈｏＥタンパク質の第８番目の断片に基づいている０本プローブ類の特異性を、ＤＮＡスポフト試験によって調べた。エンーロバク　−　Ｅｎｔｅｒｏｂａ旦１見Ｌ）プローブとハイブリダイズしかつ？ｌ、＝フ沫プｊヨ身（し＝ｂｓＬｉ上土瓢左側写真および右側写真に８図に示しである。下記のプラスミド類を、前記フィルターにのせた。ＩＡ、ｐＥｃ１７；ＩＢ、ｐＢＲ３２２；ｐＪＰ２９；２Ｂ、ｐＡｃＹｃ１８４；３Ａ、ｐＫＰ２；３Ｂ、ｐｓ７１．８図の左から、このエン−ロバフタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）プローブが、ｐＥｃ１７とのみ反応して他のプラスミド類と反応しないことがわかる。８図の右側から、％グン工立コに上皇互王土！士１主）プローブがｐＫＰｔとのみ反応することがわかる。

このことから、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）プローブおよと交差反応しないと結論できる。

ＳＴＩ　ＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＧＡＣＴＳＴ２　ＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＡＴＡＡＡＳＴ　３ｃ　ＴＴｒＡＧＴＡＧＡＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＡＫ、ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ　ＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＣＡＥ、Ｃ０ＬＩ　ＡＣＧＣＴＴＧＣＣＴＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＴＴＴＥ、ＣＬＯＡＣＡＥ　ＴＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＣＧＣＣＡＫ、ＰＮＥＵＭＯＮＩＡＥ　ＧＡＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＥ、Ｃ０ＬＩ　ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＥ、ＣＬＯＡＣＡＥ　ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＡＧ１　 −　Ｅ、ｃｏｌｉＢ　Ｓｌ　８２２　、、−．５３　５４　Ｓ５３　−　ｓｓ　ｓａ　５９４−ＣＥ１１９５　ＣＥ１１９４　ＥＩＥＣ５−−ＦＩ　Ｆ５　Ｆ６６−　・　−Ｆ９　ＦＩ２　Ｕ６７　−−　−　Ｕ７　Ｕ８　Ｌ１１１８　Ｕ１３　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＣＬ−ｂｒｏｔｈ手続争甫正書（方　式）再差し出し国際調査報告 −−・問−一−Ｉ−−ａｅｅｍ−０・−ｗ−ＰＣＴ／ＮＬ９０１０００３３国際調査報告ＮＬ　９００００３３

Claims

【特許請求の範囲】

１．グラム陰性細菌類の属または種を特異的に認識するポリヌクレオチドプローブで、このプローブが前記グラム陰性細菌の外膜タンパク賞をコードする遺伝子またはメッセンジャーＲＮＡの断片に一致するかまたは相補性であるポリヌクレオチドを含有するプローブ。
２．前記遺伝子またはメッセンジャーＲＮＡの断片が、細胞表面に本質的に露出されている外膜タンパク質部分をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のプローブ。
３．前記グラム陰性細菌が腸内細菌科に属することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のプローブ。
４．請求の範囲第１−３項のひとつに記載の１種以上のプローブ類が使用されることを特徴とするグラム陰性細菌類の検出および／または同定のための方法。
５．腸内細菌科が請求の範囲第３項に記載のプローブ類を用いて検出されおよび／または同定されることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
６．前記プローブ頬によって認識される遺伝子またはメッセンジャ−ＲＮＡの断片が次にポリメラーゼチェーンリアクションを用いることによって、複製されることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載の方法。
７．請求の範囲第１−３項に記載の１種以上のポリヌクレオチドプローブ類を含有するグラム陰性細菌類の検出および／または同定のためのキット。
８．請求の範囲第３項に記載の１種以上のポリヌクレオチドプローブ類を含有する腸内細菌科の検出および／または同定のためのキット。