JP4895291B2 - Ｒｎａインターフェラーゼおよびその使用方法 - Google Patents

Ｒｎａインターフェラーゼおよびその使用方法 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は分子生物学分野、特に、新規の酵素活性の発見に関する。詳細には、本発明は、本明細書中でｍＲＮＡインターフェラーゼと呼ばれる新規のタンパク質ファミリーの同定に関する。本明細書中に記載のファミリーのメンバーの例には、ＭａｚＦ、ＰｅｍＫ、ならびにそのホモログおよびオルソログが含まれる。より詳細には、本発明は、エンドリボヌクレアーゼまたはｍＲＮＡインターフェラーゼとしてのＭａｚＦおよびＰｅｍＫポリペプチドの生化学的特徴づけに関する。ｍＲＮＡインターフェラーゼによる活性を阻害するように作用する関連タンパク質の分析も含まれる。詳細には、ＭａｚＦ活性におけるＭａｚＥタンパク質の機能およびそれに対する効果の特徴づけおよびＰｅｍＫ活性におけるＰｅｍＩタンパク質の機能およびそれに対する効果の特徴づけを本明細書中に記載する。研究および治療への適用で使用される新規のｍＲＮＡインターフェラーゼ（ＭａｚＦおよびＰｅｍＫなど）ならびにＭａｚＦおよびＰｅｍＫ活性のモジュレーター（ＭａｚＥおよびＰｅｍＩ）の使用方法も提供する。
（発明の背景）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）では、プログラム細胞死は、一方が安定な毒素タンパク質（毒素）をコードし、他方が短命の抗毒素をコードする２つの遺伝子からなる「アディクションモジュール（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅｓ）」を介して媒介される（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５３，４３−７０（１９９９））。毒素および抗毒素はオペロンから同時発現され、互いに相互作用して安定な複合体を形成し、その発現は毒素−抗毒素複合体または抗毒素のみのいずれかによって自己調節される。その同時発現がストレス条件で阻害される場合、例えば、抗毒素は、プロテアーゼによって分解され、毒素がその標的に対して作用することができる。細菌プログラム細胞死のこのような遺伝子系は、いわゆる分離後死滅効果（ｐｏｓｔｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）について、多数の大腸菌染色体外エレメントで報告されている（Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １７０，１４６１−６（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １７４，８１１９−３２（１９９２）。細菌がプラスミドまたは他の染色体外エレメントを喪失している場合、不安定な抗毒素がその同族の安定な毒素よりも速く分解するので、細胞は選択的に死滅する。したがって、細胞は、そのｄｅ ｎｏｖｏ合成が細胞生存に不可欠であるので、短命の抗毒素に依存する。
大腸菌染色体上で見出された公知のアディクションモジュール（Ｇｏｔｆｒｅｄｓｅｎ ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９，１０６５−７６（１９９８）；Ｍｉｔｔｅｎｈｕｂｅｒ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １，２９５−３０２（１９９９））のうち、大腸菌ＭａｚＥＦ系は最初の公知の原核生物染色体アディクションモジュールである（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６０５９−６３（１９９６））。ｍａｚＥＦ モジュールは、ｒｅｌＡ遺伝子の下流に存在する２つの重複遺伝子（ｍａｚＥおよびｍａｚＦ）からなる。ＭａｚＦは安定な毒素であるのに対して、ＭａｚＥはＡＴＰ依存性ＣｌｐＰＡセリンプロテアーゼによってインビボで容易に分解される不安定な抗毒素である（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６０５９−６３（１９９６））。ｍａｚＥＦ発現は、厳しいアミノ酸枯渇下でＲｅｌＡによって合成されたグアノシン３’，５’−ビオスピロホスフェート（ｐｐＧｐｐ）によって負に調節される（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６０５９−６３（１９９６））。さらに、ｍａｚＥＦ媒介性細胞死を、いくつかの抗体（リファンピシン、クロラムフェニコール、およびスペクチノマイシンが含まれる）によって誘発することができる（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３，２０４１−５（２００１））。大腸菌細胞を使用したインビボ実験由来の血管により、ＭａｚＦがタンパク質合成およびＤＮＡ複製の両方を阻害することが示唆されている（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５，５０１−１０（２００２））。チミン飢餓死はｍａｚＥＦモジュールによって媒介されることが最近報告された（Ｂ．Ｓａｔ，Ｍ．Ｒｅｃｈｅｓ，Ｈ．Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８５，１８０３−７（２００３））。
大腸菌では、いくつかの染色体外エレメントは、アディクションモジュールを含み、いわゆる分離後死滅効果を介して細菌のプログラム細胞死を引き起こすことが公知である。最も研究された染色体外アディクションモジュールには、バクテリオファージＰ１におけるｐｈｄ−ｄｏｃ系（Ｌｅｈｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３３，４１４−４２８；Ｇａｚｉｔ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，１６８１３−１６８１８；Ｍａｇｎｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１，１８７０５−１８７１０；Ｌｅｈｎｈｅｒｒ ａｎｄ Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，３２７４３２７７）、Ｆ因子におけるｃｃｄＡ−ｃｃｄＢ系（Ｔａｍ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅ．（１９８９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１，２３５３−２３６０；Ｂａｈａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，１０９３６−１０９４４；Ａｆｉｆ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４１，７３−８２；Ｄａｏ−Ｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，３７３３−３７４２）、プラスミドＲ１におけるｋｉｓ−ｋｉｄ系（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５，２６８５−２６９３；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）１０，１４２５−１４３３；Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２４７，５６８−５７７；Ｓａｎｔｏｓ−Ｓｉｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｓｍｉｄ ５０，１２０−１３０）、およびプラスミドＲ１００におけるｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系（Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １７４，４２０５４２１１；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７０，１４６１−１４６６；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ．（１９９３）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３７，８１−８８；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ．（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１５，４６３−４６８）が含まれる。興味深いことに、大腸菌染色体はまた、ｒｅｌＢＥ系（Ｇｏｔｆｒｅｄｓｅｎ ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ．（１９９８）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９，１０６５−１０７６；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，１４３２８−１４３３３；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ．（２００３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４８，１３８９−１４００；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１２，１３１−１４０）、ｍａｚＥＦ系（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６０５９−６０６３；Ｍａｒｉａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，５９７５−５９８４；Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，８７５−８８４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，３２３００−３２３０６）、およびｃｈｐＢ系（Ｓａｎｔｏｓ Ｓｉｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １６８，５１−５８；Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，６８５０−６８５６；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３２，８０９−８１９）などのいくつかのアディクションモジュール系を含む。
アディクションモジュールに関連する毒素の細胞効果は非常に広範に研究されている。ｃｃｄＢ（ｃｃｄＡ−ｃｃｄＢ系における毒素）は、ＤＮＡギラーゼと相互作用してＤＮＡ複製を遮断し（Ｂａｈａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｓｕｐｒａ；Ｋａｍｐｒａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，７３３−７４４）、ＲｅｌＥ（ｒｅｌＢＥ系における毒素）は高いコドン親和性でリボゾームＡ部位中のｍＲＮＡを切断するが、遊離ＲＮＡを分解することができない（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。しかし、Ａ部位のｍＲＮＡ切断がＲｅｌＥの非存在下で起こり得ることが最近証明された。（Ｈａｙｅｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，９０３−９１１）。したがって、正確なＡ部位ｍＲＮＡ切断の正確な機構は依然として知られていない。ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）（ｍａｚＥＦ系によってコードされる毒素）およびＣｈｐＢＫ（ｃｈｐＢ系によってコードされる毒素）がリボゾーム依存性様式およびコドン特異的様式でＲｅｌＥと非常に類似した機構によって翻訳を阻害することが提案されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。しかし、本発明者らは、ＭａｚＦが一本鎖ＲＮＡのみに対して機能的な配列特異的エンドリボヌクレアーゼであり、リボゾームおよびコドンに依存した様式にてＡＣＡ配列でｍＲＮＡを優先的に切断するので、ＲｅｌＥと機能的に異なることを最近証明した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＭｏｌＣｅｌｌ １２，９１３−９２３）。
ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系およびｋｉｓ−ｋｉｄ系は、２つの密接に関連したｉｎｃＦＩＩ低コピープラスミドであるプラスミドＲ１００（Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ｓｕｐｒａ）およびプラスミドＲ１（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｂｒａｖｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１０，１０１−１１０）の安定な維持に関与する。これら２つの系は現在同一であることが公知である（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ．（１９９９）ｓｕｐｒａ）。Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）はインビトロにてＤＮＡ合成開始で作用するＣｏｌＥ１プラスミド複製を阻害するが、Ｐ４ ＤＮＡ合成を阻害しないことが証明されている（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｓｕｐｒａ）。今日まで、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）が染色体ＤＮＡ複製を阻害するという証拠は存在しない。毒素Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）および解毒剤Ｋｉｓ（ＰｅｍＩ）は細菌で機能するだけでなく、広範な真核生物でも有効に機能する。Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）は、酵母、アフリカツメガエル、およびヒトの細胞での増殖を阻害する一方で、Ｋｉｓ（ＰｅｍＩ）はこの阻害を無効にする（ｄｅ ｌａ Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｍｂｏ Ｊ ２２，２４６−２５１）。Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）はヒト細胞におけるアポトーシスを誘発することも証明されている（ｄｅ ｌａ Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。これらの結果により、原核生物および真核生物の両方でＫｉｄ（ＰｅｍＫ）に共通の標的が存在することが示唆される。
本明細書中の参考文献の引用は、このような引用が本発明を先行技術とすると解釈すべきではない。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
（発明の要旨）
第１の態様では、本発明は、本明細書中で「ＲＮＡインターフェラーゼ」と呼ばれる酵素の新規のファミリーの発見に関する。本明細書中に記載されるように、ｍＲＮＡインターフェラーゼファミリーの例示的エンドリボヌクレアーゼには、ＭａｚＦ、ＰｅｍＫ、ならびにそのホモログおよびオルソログが含まれる。したがって、本発明は、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫポリペプチドのいずれかに配列相同性および／または構造相同性を有するエンドリボヌクレアーゼを含む。
注目すべきことは、本発明の発見前にＭａｚＦの細胞標的が同定されていなかったことである。さらに、本発明はまた、ＰｅｍＫが配列特異的様式で細胞ｍＲＮＡの切断によってタンパク質合成を有効に遮断するという発見に関する。したがって、本発明の新規の所見は、ｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦおよび／またはＰｅｍＫ）の核酸配列およびアミノ酸配列ならびにその組成物を使用して利益をもたらすことができる新規の適用を示す。このような有用性には、下記の種々の研究および治療への適用が含まれるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、Ｍａｚおよび／またはＰｅｍＫ）の核酸配列および／またはアミノ酸配列、ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性適合緩衝液、および取扱い説明書を含むキットも提供する。
本発明はまた、活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を検出する方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の核酸配列を発現する工程と、
（ｃ）発現した工程（ｂ）の核酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｄ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供するかその正の指標であることとを含む方法を提供する。
活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の核酸配列を発現する工程と、
（ｃ）エンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で発現した工程（ｂ）の核酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を潜在的に調節することができる少なくとも１つの薬剤を添加する工程と、（ｅ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供するかその正の指標であり、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができる少なくとも１つの薬剤の存在下での切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤が同定されることとを含む方法も本発明に含まれる。このような方法をインビトロまたは細胞内で行う。
ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができる本発明の方法を使用して同定したこのような薬剤は、基質切断を増加または減少させる。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された薬剤を含む。
別の態様では、活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節する方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の核酸配列を発現する工程と、
（ｃ）エンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で発現した工程（ｂ）の核酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができる薬剤を添加する工程と、
（ｅ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供するかその正の指標であり、前記薬剤の存在下での切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節する手段が提供されることとを含む、方法を提供する。
ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列の例には、本明細書中の以下に記載の配列番号１または３、配列番号２または４をコードする核酸配列、ならびにそのホモログおよびオルソログが含まれるが、これらに限定されない。そのホモログ／オルソログの例は、それぞれ配列番号６９および７４を含む核酸配列およびアミノ酸配列を含むＭａｚＦ−ｍｔ１である。
別の実施形態では、活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を検出する方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼを含むアミノ酸配列を提供する工程と、
（ｂ）エンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）のアミノ酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｃ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供するか、その正の指標であることとを含む方法を提供する。
本発明はまた、活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼを含むアミノ酸配列を提供する工程と、
（ｂ）エンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）のアミノ酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｃ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を潜在的に調節することができる少なくとも１つの薬剤を添加する工程と、（ｄ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供し、少なくとも１つの薬剤の存在下での切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤が同定されることとを含む、方法を含む。
ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができるこれらの方法を使用して同定した薬剤は、基質切断を増減させることができる。このような調節剤は本発明の範囲内である。このような薬剤は、例えば、ｍＲＮＡインターフェラーゼ（毒素）もしくはその抗毒素（例えば、ＰｅｍＩ、ＭａｚＥ、またはその機能的および／または構造的ホモログもしくはオルソログの抗毒素）に対する作用または自己調節フィードバック機構の変化によって毒素−抗毒素複合体が毒素および抗毒素の遺伝子発現を下方制御することによってｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＰｅｍＫ、ＭａｚＦ、または機能的および／または構造的ホモログもしくはオルソログ）のエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができると理解すべきである。自己調節フィードバック機構の変化によって毒素−抗毒素複合体が毒素および抗毒素の発現を下方制御することができる薬剤は、これらの遺伝子の協調的調節を変化させることができる。本発明の態様では、毒素−抗毒素複合体形成を減少させることができる薬剤は抗毒素の効果を阻害し、その結果毒素活性を増加させ、最終的に細胞が死滅する。別の態様では、抗毒素および毒素の遺伝子発現を遮断することができる薬剤（この薬剤は毒素の安定な性質によって抗毒素と比較して毒素レベルを増加させる）を想定する。このような不均衡により細胞毒性も得られる。
従って、このような薬剤を、細菌感染症（特に、抗生物質耐性細菌株）の被験体の治療に有利に使用することができる。このような薬剤は本発明の範囲内であり、単独または組み合わせて使用することができる。
活性がエンドリボヌクレアーゼ活性であるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節する方法において、
（ａ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼのアミノ酸配列を提供する工程と、
（ｂ）エンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）のアミノ酸配列をエンドリボヌクレアーゼ基質とインキュベートする工程と、
（ｃ）前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができる薬剤を添加する工程と、
（ｄ）前記基質の切断を測定する工程と、
前記基質の切断が、エンドリボヌクレアーゼ活性を示し、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性の検出手段を提供するかその正の指標となり、前記薬剤の存在下での切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節する手段が提供されることとを含む方法も提供する。このような方法を、細胞ベースのアッセイ（培養または非ヒト動物もしくはヒト患者などの被験体）またはインビトロで行うことができる。
本発明によれば、ｍＲＮＡインターフェラーゼを含む例示的アミノ酸配列には、本明細書中の以下に記載の配列番号２または４ならびにそのホモログおよびオルソログが含まれるが、これらに限定されない。そのホモログ／オルソログの例は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＭａｚＦ−ｍｔ１である。
本発明はまた、細胞中のｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を検出する方法において、
（ａ）発現ベクターを含む細胞を提供する工程と、前記ベクターがｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を含み、そして／またはｍＲＮＡインターフェラーゼを含むアミノ酸配列をコードし、任意選択的に少なくとも１つの調節配列を含むことと、
（ｂ）少なくとも１つの細胞基質のエンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）の細胞をインキュベートする工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つの細胞基質の切断を測定する工程と、
前記少なくとも１つの細胞基質の切断がエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、細胞中でのｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を検出する手段が提供されることとを含む方法を含む。
１つの態様では、細胞中のｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節する方法において、
（ａ）発現ベクターを含む細胞を提供する工程と、前記ベクターがｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を含み、そして／またはｍＲＮＡインターフェラーゼを含むアミノ酸配列をコードし、任意選択的に少なくとも１つの調節配列を含むことと、
（ｂ）少なくとも１つの細胞基質のエンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）の細胞をインキュベートする工程と、
（ｃ）ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節することができる薬剤を添加する工程と、
（ｄ）前記少なくとも１つの細胞基質の切断を測定する工程と、
前記少なくとも１つの細胞基質の切断がエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、細胞中でのｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を検出する手段が提供され、前記薬剤の存在下での少なくとも１つの切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節する手段が提供されることとを含む方法を含む。
細胞中のｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法において、
（ａ）発現ベクターを含む細胞を提供する工程と、前記ベクターがｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を含み、そして／またはｍＲＮＡインターフェラーゼを含むアミノ酸配列をコードし、任意選択的に少なくとも１つの調節配列を含むことと、
（ｂ）少なくとも１つの細胞基質のエンドリボヌクレアーゼ活性を促進することができる条件下で工程（ａ）の細胞をインキュベートする工程と、
（ｃ）ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を潜在的に調節することができる少なくとも１つの薬剤を添加する工程と、
（ｄ）前記少なくとも１つの細胞基質の切断を測定する工程と、
前記少なくとも１つの細胞基質の切断がエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、細胞中でのｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントのエンドリボヌクレアーゼ活性を検出する手段が提供され、前記薬剤の存在下での少なくとも１つの切断基質量の変化によって前記ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントの活性を調節することができる薬剤が同定されることとを含む方法も提供する。
本発明によれば、ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を発現ベクターを含む細胞は、本明細書中に記載の配列番号１または３ならびにそのホモログおよびオルソログが含まれるが、これらに限定されない核酸配列；ならびに本明細書中に記載の配列番号２または４、そのホモログおよびオルソログをコードする核酸を含む。そのホモログ／オルソログの例は、それぞれ配列番号６９および７４の核酸配列およびアミノ酸配列を含むＭａｚＦ−ｍｔ１である。
少なくとも１つのｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメント、核酸配列をコードするｍＲＮＡインターフェラーゼ、および／または本発明の方法を使用して同定されたｍＲＮＡインターフェラーゼ調節剤、ならびの薬学的に許容可能な緩衝液を含む組成物も提供する。
１つの態様では、障害の症状を緩和するために治療有効量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む、障害を有する患者の治療方法を提供する。組成物は、障害の症状を緩和するための患者が罹患した障害に依存してエンドリボヌクレアーゼ基質切断を増減することができる少なくとも１つの薬剤を含む。
したがって、本発明は、障害の症状を緩和するために障害を有する患者の治療で使用するための薬物の調製における治療有効量のｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメント、ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列、またはｍＲＮＡインターフェラーゼ調節剤の使用を含む。このような薬物は、さらに、薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含み得る。
細菌感染症などの障害は、例えば、患者中の細菌数の減少によって細菌感染症の症状を緩和するための治療有効量のエンドリボヌクレアーゼ基質切断を増加させることができる少なくとも１つの分子または薬剤を含む本発明の組成物の投与によって治療可能である。細菌感染症が少なくとも１つの抗生物質耐性細菌株を含む場合、このような方法を使用することが特に有利である。
本発明の方法はまた、治療有効量のエンドリボヌクレアーゼ基質切断を増加させることができる少なくとも１つの分子または薬剤を含む本発明の組成物の投与によって患者中の過剰増殖障害細胞数の減少によって過剰増殖障害の症状が緩和される、過剰増殖障害の治療で有用である。無秩序な細胞増殖によって特徴づけられ、かつ本発明の組成物および方法を使用して治療可能な過剰増殖障害には、異なる組織の形成異常および化生、炎症性状態、自己免疫疾患、過剰増殖性皮膚障害、乾癬、アレルギー／喘息、アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、および癌が含まれるが、これらに限定されない。
障害の症状を緩和するために治療有効量の本発明の組成物を患者に投与する工程と、前記組成物の少なくとも１つの薬剤がエンドリボヌクレアーゼ基質切断を減少させることとを含む、障害を有する患者の治療方法も含まれる。
（ａ）細胞をポリペプチドをコードする核酸配列でトランスフェクトする工程と、前記ポリペプチドをコードする核酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異していることと、前記変異核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が前記変異によって変化しないことと、
（ｂ）前記細胞をｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列でトランスフェクトする工程と、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼが前記ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を認識することと、
（ｃ）前記細胞中で工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列を発現する工程と、前記細胞中での工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列の発現により前記細胞中でのポリペプチドの産生手段が得られることとを含む、細胞中でのポリペプチドの作製方法も含まれる。
本発明によれば、ポリペプチドまたはｍＲＮＡインターフェラーゼのいずれかをコードする核酸配列を、それぞれ第１および第２の発現ベクターに含めることができる。さらに、工程（ａ）および（ｂ）のトランスフェクション工程を、個別または同時に（例えば、同時トランスフェクション）行うことができる。上記に示すように、核酸配列中のｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列の異なるトリプレットと配列またはコドンへの変異により、変異核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は変化しない。したがって、変異は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントである。核酸配列変異の目的は、問題のｍＲＮＡインターフェラーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性に対するこれらから転写されたＲＮＡメッセージの感受性を劇的に減少させることである。工程（ｂ）の核酸配列（例えば、ＰｅｍＫポリペプチドもしくはその機能的フラグメント、ＭａｚＦポリペプチドもしくはその機能的フラグメント、またはＭａｚＦもしくはＰｅｍＫのいずれかのホモログもしくはオルソログをコードする核酸配列）の発現は、ｍＲ
ＮＡインターフェラーゼ認識配列を含む核酸配列によってコードされる細胞ポリペプチドの合成を減少または阻害する。したがって、この方法によって、ＲＮＡ転写物が発現されたｍＲＮＡインターフェラーゼによって認識されるｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を含む本質的に細胞タンパク質の非存在下で所望のポリペプチドが産生される。したがって、この方法は、細胞中での「精製」ポリペプチドの作製を提供する。いくつかの適用のために、この方法は、工程（ｃ）の前または間に少なくとも１つの放射性標識同位体を含む培地中で細胞をインキュベートする工程をさらに含む。このような適用には、核磁気共鳴（ＭＮＲ）テクノロジーを使用したその後の分析のための標識ポリペプチドの作製が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞中でのポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡ認識配列であるアデニン−シトシン−アデニン（ＡＣＡ）および配列番号２またはその機能的フラグメントを含むｍＲＮＡインターフェラーゼであるＭａｚＦを使用する。この実施形態では、ＭａｚＦまたはその機能的フラグメントをコードする核酸の発現により、ＡＣＡ配列を含む核酸配列によってコードされる細胞ポリペプチドの合成が減少または阻害される。
別の実施形態では、細胞中でのポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡ認識配列であるウラシル−アデニン−Ｘ（ＵＡＸ）（式中、Ｘはシトシン（Ｃ）、Ａ、またはＵである）、配列番号４を含むｍＲＮＡインターフェラーゼであるＰｅｍＫまたはその機能的フラグメントを使用する。この実施形態では、ＰｅｍＫおよびその機能的フラグメントをコードする核酸の発現により、ＵＡＸ配列を含む核酸配列によってコードされる細胞ポリペプチドの合成が減少または阻害される。
さらに別の実施形態では、細胞中でのポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列であるウラシル−アデニン−Ｃ（ＵＡＣ）およびｍＲＮＡインターフェラーゼである配列番号７４を含むＭａｚＦ−ｍｔ１またはその機能的フラグメントを使用する。この実施形態では、ＭａｚＦ−ｍｔ１またはその機能的フラグメントをコードする核酸の発現により、ＵＡＣ配列を含む核酸によってコードされる細胞ペプチドの合成が減少または阻害される。
本発明の１つの態様では、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する工程と、前記ポリペプチドをコードする核酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異していることと、前記変異核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が前記変異によって変化しないことと、
（ｂ）ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を提供する工程と、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼが前記ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を認識することと、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列を発現する工程と、工程（ａ）および（ｂ）の核酸配列の発現によりポリペプチドの産生手段が得られることとを含むポリペプチドの作製方法を提供する。この方法を、インビトロで（例えば、試験管など）行うことができる。適切なインビトロ転写／翻訳系または無細胞発現系は当該分野で公知であり、以下に記載する。ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはそのフラグメントを、任意選択的に、発現する必要がある核酸配列の形態よりもむしろ発現タンパク質として提供することができる。
特定の実施形態では、ポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡ認識配列であるＡＣＡおよびｍＲＮＡインターフェラーゼである配列番号２を含むＭａｚＦまたはその機能的フラグメントを使用する。
別の実施形態では、ポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡ認識配列であるＵＡＸ（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）およびｍＲＮＡインターフェラーゼである配列番号４を含むＰｅｍＫまたはその機能的フラグメントを使用する。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドの作製方法は、ｍＲＮＡ認識配列であるＵＡＣおよびｍＲＮＡインターフェラーゼである配列番号７４を含むＭａｚＦ−ｍｔ１またはその機能的フラグメントを使用する。
本発明はまた、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼを使用した複数のポリリボヌクレオチド配列の作製方法に関する。この方法は、（ａ）第１および第２の核酸配列を提供する工程と、前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列領域と相補的であり、前記第１または第２の核酸配列の相補領域がｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位と相補的な配列を含まず、前記第１および第２の核酸配列がそれぞれその５’末端でリン酸化されていることと、
（ｂ）前記第１および第２の核酸配列の相補領域を介して前記第１および第２の核酸配列をアニーリングして、一本鎖オーバーハングに隣接する相補領域を含む二本鎖核酸配列を形成する工程と、前記一本鎖オーバーハングがそれぞれｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位に相補的な少なくとも１つの配列を含み、前記一本鎖オーバーハングが互いに相補的であることと、
（ｃ）アニーリングした前記第１および第２の核酸配列を相補一本鎖オーバーハングを介してライゲーションして、アニーリングした前記第１および第２の核酸配列の複数の縦列反復を含むコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）を形成する工程と、
（ｄ）Ｔ７プロモーターおよび前記第１の核酸配列に相補的な領域を含む第１のプライマーならびに前記第２の核酸配列に相補的な第２のプライマーを使用して前記コンカテマーを増幅する工程と、前記増幅によってＴ７プロモーターを含む複数のコンカテマーが産生されることと、
（ｅ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して複数の前記コンカテマー由来のＲＮＡ分子を転写する工程と、前記ＲＮＡ分子はそれぞれｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位に隣接するポリリボヌクレオチド配列の複数の縦列反復を含むことと、
（ｆ）前記ＲＮＡ分子を前記インターフェラーゼ認識部位でＲＮＡを切断することができるｍＲＮＡインターフェラーゼで消化する工程と、前記消化によって複数の前記ポリリボヌクレオチド配列が産生されることとを含む。
複数のポリリボヌクレオチド配列の作製方法の特定の態様では、ｍＲＮＡ認識配列はＡＣＡであり、ｍＲＮＡインターフェラーゼは配列番号２を含むＭａｚＦまたはそのフラグメントである。
複数のポリリボヌクレオチド配列の作製方法の別の態様では、ｍＲＮＡ認識配列はＵＡＸであり（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）、ｍＲＮＡインターフェラーゼは配列番号４を含むＰｅｍＫまたはそのフラグメントである。
複数のポリリボヌクレオチド配列の作製方法のさらに別の態様では、ｍＲＮＡ認識配列はＵＡＣであり、ｍＲＮＡインターフェラーゼは配列番号７４を含むＭａｚＦ−ｍｔ１またはそのフラグメントである。
本発明はまた、エンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができる、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに対して配列相同性および／または構造相同性を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列に関する。１つの実施形態では、配列番号２に対して配列相同性および／または構造相同性を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントは、エンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるＭａｚＦオルソログであえる。エンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるポリペプチドには、バチルス・ハロデュランスＭａｚＦ（ＮＰ＿２４４５８８．１）、表皮ブドウ球菌ＭａｚＦ（ＡＡＧ２３８０９．１）、黄色ブドウ球菌ＭａｚＦ（ＮＰ＿３７２５９２．１）、枯草菌ＭａｚＦ（１ＮＥ８＿Ａ）、髄膜炎菌ＭａｚＦ（ＮＰ＿２６６０４０．１）、モルガネラ・モルガニイＭａｚＦ（ＡＡＣ８２５１６．１）、結核菌ＭａｚＦ（ＮＰ＿２１７３１７．１）が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、配列番号４に対して配列相同性および／または構造相同性を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントは、エンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるＰｅｍＫホモログまたはオルソログである。エンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるポリペプチドには、ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）、ＣｈｐＢＫ、および他のＰｅｍＫ様タンパク質が含まれるＰｅｍＫタンパク質ファミリーの７３種の公知のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。以下は、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔｄｅｓｃ？ａｃｃ＝ＰＦ０２４５２）で見出されたこれらのタンパク質の名称のリストである：
。
ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができる、配列番号２または配列番号４のいずれかと配列相同性および／または構造相同性を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列を含む発現ベクターも本発明に含まれる。核酸配列がトランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞で発現される、これらの発現ベクターを含む細胞も、本発明の単離核酸配列を含むトランスジェニック動物と同様に想定する。
本発明の別の態様では、ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができる、配列番号２または配列番号４のいずれかと配列相同性および／または構造相同性を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含む単離アミノ酸配列を提供する。アミノ酸配列の発現が発現ベクター中の調節配列によって制御される本発明のアミノ酸配列をコードする発現ベクター、このような発現ベクターを含む細胞、およびアミノ酸配列がトランスジェニック動物中の少なくとも１つの細胞中で発現される本発明のアミノ酸配列を含むトランスジェニック動物も含まれる。
本発明の別の態様では、核酸配列がエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードする、配列番号１または配列番号３を含む単離核酸配列を提供する。
核酸配列がエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードし、配列番号１または配列番号３が調節配列に作動可能に連結された、配列番号１または配列番号３の核酸配列を含む発現ベクターも記載する。さらに、このような発現ベクターを含む細胞も本発明の範囲内に含まれる。
別の態様では、核酸配列がエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードし、核酸配列がトランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞中で発現される、配列番号１または配列番号３を含むヌクレオチド配列を含むトランスジェニック動物を提供する。
ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントである、配列番号２または配列番号４を含むポリペプチドをコードする単離核酸配列も提供する。
別の態様では、ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントであり、核酸配列が調節配列に作動可能に連結されている、配列番号２または配列番号４を含むポリペプチドをコードする単離核酸配列を含む発現ベクターを提供する。このような発現ベクターを含む細胞も含まれる。
さらに別の態様では、ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントであり、核酸配列がトランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞中で発現される、配列番号２または配列番号４を含むポリペプチドをコードする単離核酸配列を含むトランスジェニック動物を提供する。
本発明の１つの実施形態では、アミノ酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントであり、ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができる、配列番号２または配列番号４を含む単離アミノ酸配列を提供する。
アミノ酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントであり、ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントがエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、アミノ酸配列の発現が発現ベクター中で調節配列によって制御される、配列番号２または配列番号４を含む単離アミノ酸配列をコードする発現ベクターも記載する。このような発現ベクターを含む細胞も本発明に含まれる。
別の態様では、ポリペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を示すことができるｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントであり、ポリペプチドがトランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞中で発現される、配列番号２または配列番号４を含む単離ポリペプチドを含むトランスジェニック動物を提供する。
本発明はまた、核酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントをコードする配列番号１または配列番号３を含む単離核酸配列、アミノ酸配列がｍＲＮＡインターフェラーゼまたはその機能的フラグメントである配列番号２または配列番号４を含む単離核酸配列、ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性適合緩衝液、および取扱い説明書を含むキットを含む。
本発明はまた、遺伝子治療を対象にする適用における本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼの使用を含む。被験体（例えば、ヒト被験体）で欠陥または欠損している分子を発現するように操作された細胞を、その発現が誘導性調節配列によって制御される本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼの組み込みを介して自己破壊するようにデザインすることもできる。遺伝子治療への適用のために使用される細胞破壊のための誘導性手段の組み込みにより、このような細胞が被験体に有利な効果を付与した後および／または悪影響をもたらし得る前に消失することができるフェイルセーフ機構が得られる。
（発明の詳細な説明）
本発見およびその使用方法を記載する前に、本発明は特定のアッセイ方法、または記載の試験化合物および試験条件に制限されず、そのようなものとして方法および化合物が変化し得ると理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみに制限されるので、本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、かつ制限されないとも理解すべきである。
したがって、本明細書中および特許請求の範囲で使用される、用語「ＭａｚＦ」または「ＰｅｍＫ」は、一般的なエンドリボヌクレアーゼクラスおよび特定の名称を有する特定の酵素をいい、それらと構造相同性および配列相同性を有する酵素が含まれることが意図される。同様に、本発明に含まれる酵素ファミリーを、本明細書中で、「ＲＮＡインターフェラーゼ」（本発明者らによって本明細書中で同定された新規のファミリー）という。さらに、本発明は、本発明におけるその役割と一致する構造類似性および機能類似性を有する分析に拡大されることが意図される。
さらに、本明細書中および特許請求の範囲で使用される、用語「ＭａｚＥ」または「ＰｅｍＩ」は、ＭａｚＥ（またはＭａｚＦ調節分子）およびＰｅｍＩ（ＰｅｍＫ調節分子）の一般的クラスならびにこの名称を有する特定の分子をいい、配列番号６または配列番号８と構造相同性および／または配列相同性を有するＭａｚＥ（またはＭａｚＦ調節分子）またはＰｅｍＩ（ＰｅｍＫ調節分子）が含まれることが意図される。実際、本発明は、本発明におけるその役割と一致する構造類似性および機能類似性を有する分析に拡大されることが意図される。
細菌細胞の死および成長阻害は、一定のストレス条件に応答する細菌ゲノム中の内因性有毒遺伝子によって誘発される。ＭａｚＦは、細胞死を引き起こす内因性毒素であり、大腸菌における「ＭａｚＥＦアディクションモジュール」と呼ばれるオペロンによってコードされる。ＭａｚＥは、ＭａｚＦに対する不安定な抗毒素である。本明細書中に記載のように、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の合成に対するＭａｚＦの効果を、透過性細胞で試験した。簡単に述べれば、ＭａｚＦ誘導から１０分後、ＡＴＰ依存性３５Ｓ−メチオニン組み込みが完全に阻害されるのに対して、［α− ３２ Ｐ］ｄＴＴＰおよび［α−３２Ｐ］ＵＴＰ組み込みは阻害されず、このことは、ＭａｚＦがタンパク質合成の特異的インヒビターであることを示す。さらに、精製ＭａｚＦは無原核細胞系および無真核細胞系の両方におけるタンパク質合成を阻害し、この阻害はＭａｚＥの存在下で遮断された。スクロース密度勾配遠心分離によって分析した場合、ＭａｚＦ誘導によってポリソームの形成が阻害されると共に７０Ｓリボゾーム画分が増加する一方で、５０Ｓおよび３０Ｓリボゾーム画分はＭａｚＦ発現に影響をうけなかった。
注目すべきことに、トゥープリンティング分析により、ＭａｚＦがリボゾームとは無関係にＡＣＡの配列および機能を認識する配列特異的エンドリボヌクレアーゼであることが明らかになった。さらに、ノーザンブロット分析により、ＭａｚＦ誘導時に全細胞ｍＲＮＡが分解されることが示された。したがって、本発明者らは、ＭａｚＦがエンドリボヌクレアーゼの新規のファミリーの最初に定義されたメンバーであるという驚くべき発見をし、細胞ｍＲＮＡの機能を妨害するその能力を考慮して、本明細書中で「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と命名した。本明細書中で示すように、インターフェラーゼ機能は、急速な細胞成長の停止および／または細胞死を引き起こす特定の配列（ＡＣＡ）でのｍＲＮＡ転写物の切断に起因する。本明細書中で証明されるように、ｍＲＮＡインターフェラーゼの役割は、通常の細胞生理学および／またはストレス条件によって誘導された損傷した細胞生理学において広範に関与する。
本発明者らは、精製ＰｅｍＫ（「ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫアディクションモジュール」によってコードされる毒素）が無大腸菌細胞系におけるタンパク質合成を阻害する一方で、ＰｅｍＩ（ｐｅｍＫの抗毒素）の添加によりタンパク質合成が修復されることも発見した。本明細書中に記載のさらなる研究により、ＰｅｍＫがｍＲＮＡを切断することによってタンパク質合成を阻害する配列特異的エンドリボヌクレアーゼであることが明らかになった。ＰｅｍＩはＰｅｍＫ媒介性エンドリボヌクレアーゼ活性を遮断し、それによってタンパク質合成を修復する。ＰｅｍＫは、優先的に「ＵＡＸ（Ｘは、Ｃ、Ａ、またはＵである）」認識部位中のＡ残基の５’側または３’側で一本鎖ＲＮＡのみを切断することが示されている。誘導時、ＰｅｍＫは、大腸菌中で細胞ｍＲＮＡを切断してタンパク質合成を有効に遮断する。広範な細菌のゲノムでｐｅｍＫホモログが同定されており、本発明者らは、本明細書中で、ＰｅｍＫおよびそのホモログ形態が配列特異的様式で細胞ｍＲＮＡの切断によってｍＲＮＡ機能を妨害する新規のエンドリボヌクレアーゼファミリーを形成すると提案している。
本発明のパラメータをより明白に記載するために、以下の定義を使用する。
句「隣接核酸配列」は、エンドヌクレアーゼ切断部位に対して５’および３’である連続核酸配列をいう。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈で別なふうに明確に示されていない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及には、本明細書中に記載され、そして／または本開示などを読んだ際に当業者明らかとなる１つまたは複数の方法および／または本明細書中に記載の型の工程が含まれる。
用語「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡを内部で切断することができる酵素をいう。
用語「エンドリボヌクレアーゼ」は、ＲＮＡを内部で切断することができる酵素をいう。
用語「相補的」は、実質的に正常な塩基対合特性を示す２つのＤＮＡ鎖をいう。しかし、相補的ＤＮＡは、１つまたは複数のミスマッチを含み得る。
用語「ハイブリッド形成」は、２つの相補性ＤＮＡ鎖間で生じる水素結合をいう。
本明細書中で使用される、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖の任意のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をいい、一本鎖の場合、線状または環状形態のその相補配列の分子をいう。核酸分子の考察では、特定の核酸分子の配列または構造を、本明細書中で５’から３’方向で配列を提供する通常の慣習にしたがって記載することができる。本発明の核酸に関して、用語「単離核酸」を時折使用する。この用語は、ＤＮＡに適用する場合、起源となる生物の天然に存在するゲノム中の直接連続する配列から分離されたＤＮＡ分子をいう。例えば、「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれるか、原核細胞もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
ＲＮＡに適用する場合、用語「単離核酸」は、主に、上記定義の単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子をいう。あるいは、この用語は、一般にその天然の状態で（すなわち、細胞または組織中）会合した他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子をいうことができる。単離核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、さらに、生物学的手段および合成手段によって直接産生されたか、その産生時に存在する他の成分から分離され
た分子を示し得る。
核酸の特定の配列の「天然の対立遺伝子変異型」、「変異体」、および「誘導体」は、特定の配列と密接に関連するが、配列または構造が天然またはデザインによって変化し得る核酸配列をいう。「密接に関連した」は、密接に関連した核酸配列間の所定の長さのヌクレオチド配列における配列適合の少なくとも約６０％であるが、しばしば８５％を超えるヌクレオチドが、特定の核酸配列の事実上の一連の正常な複製または重複時に生じる配列中のヌクレオチドの変化を示し得ることを意味する。核酸の調節領域中のアミノ酸のコドンまたは配列を変化させるためなどの特定の目的のために他の変化を具体的にデザインして配列に移入することができる。このような特定の変化を、種々の変異誘発技術を使用してインビトロで行うか、変化を誘導するか選択する特定の選択条件下に置かれた宿主生物で得ることができる。特異的に作製されたこのような配列変異型を、元の配列の「変異体」または「誘導体」ということができる。
特定の配列をいう場合、用語「類似率」、「同一率」、および「相同率」をＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧＣＧソフトウェアプログラムに記載のように使用し、これらは当該分野で公知である。
本発明には、本発明のＭａｚＦポリペプチドまたはタンパク質の活性な部分、フラグメント、誘導体、および機能的または非機能的模倣物も含まれる。ＭａｚＦポリペプチドの「活性部分」は、全長ＭａｚＦポリペプチド未満であるが、無視できない生物活性を保持するペプチドを意味する。
ｍＲＮＡインターフェラーゼの「フラグメント」または「一部」は、少なくとも約５〜７個の連続アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の連続アミノ酸配列、典型的には少なくとも約９〜１３個の連続アミノ酸配列、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個またはそれ以上の連続アミノ酸配列のアミノ酸残基ストレッチを意味する。ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはそのフラグメントの「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列の変化（例えば、タンパク質をコードする核酸の操作による）またはタンパク質自体の変化によって修飾されたポリペプチドを意味する。このような天然のアミノ酸配列の誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失、または置換を含むことができ、元のｍＲＮＡインターフェラーゼの不可欠な活性が変化していても変化していなくても良い。
ｍＲＮＡインターフェラーゼの異なる「変異型」は天然に存在する。これらの変異型は、タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の相違によって特徴づけられる対立遺伝子であり得るか、異なるＲＮＡプロセシングまたは翻訳後修飾を含み得る。当業者は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または代替（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有する変異型を産生することができる。これらの変異型には、特に、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異型、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸がｍＲＮＡインターフェラーゼに付加された変異型、（ｃ）１つまたは複数アミノ酸が置換基を含む変異型、および（ｄ）ｍＲＮＡインターフェラーゼが、ｍＲＮＡインターフェラーゼに有用な性質を付与することができる融合パートナー、タンパク質タグ、または他の化学的部分（例えば、抗体のエピトープ、ポリヒスチジン配列、およびビオチン部分など）などの別のペプチドまたはポリペプチドと融合した変異型が含まれ得る。本発明の他のｍＲＮＡインターフェラーゼには、ある種由来のアミノ酸残基が保存または非保存部分で別の種の対応する残基に置換された変異型が含まれる。別の実施形態では、非保存部分でのアミノ酸残基が保存または非保存残基と置換される。これらの変異型を得るための技術（遺伝的（抑制、欠失、変異など）、化学的、酵素的技術が含まれる）は、当業者に公知である。
このような対立遺伝子の変異物、アナログ、フラグメント、誘導体、変異体、および修飾物（核酸の選択的プロセシング形態および別の翻訳後修飾形態が含まれる）によってｍＲＮＡインターフェラーゼの任意の生物学的性質が保持されるｍＲＮＡインターフェラーゼの誘導体が得られる範囲で、これらは本発明の範囲内に含まれる。
本明細書中で使用される、用語「オルソログ」または「ホモログ」は、ポリペプチド産物がＭａｚＦコード配列と６０％を超えて同一であり、そして／または遺伝子産物がＭａｚＦと類似の三次元構造および／または生物活性を有する核酸配列によってコードされたヌクレアーゼをいう。オルソログ／ホモログの例には、バチルス・ハロデュランス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＰ＿２４４５８８．１）、表皮ブドウ球菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ２３８０９．１）、黄色ブドウ球菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿３７２５９２．１）、枯草菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１ＮＥ８＿Ａ）、髄膜炎菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２６６０４０．１）、モルガネラ・モルガニイ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ８２５１６．１）、および結核菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２１７３１７．１）のＭａｚＦが含まれるが、これらに限定されない。図２２および２３を参照のこと。用語「オルソログ」および「ホモログ」を使用して、任意の種のＭａｚＦ核酸配列またはアミノ酸配列のオルソログ／ホモログをいうことができる。このような種には、大腸菌、バチルス・ハロデュランス、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、枯草菌、髄膜炎菌、モルガネラ・モルガニイ、結核菌、ハツカネズミ、およびホモ・サピエンスが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法におけるこのようなオルソログ／ホモログによってコードされた核の使用は、本明細書中で意図される。
本明細書中で使用される、用語「オルソログ」または「ホモログ」はまた、ポリペプチド産物がＰｅｍＫコード配列と６０％を超えて同一であり、そして／または遺伝子産物がＰｅｍＫと類似の三次元構造および／または生物活性を有する核酸配列によってコードされたヌクレアーゼをいう。用語「オルソログ」および「ホモログ」を使用して、任意の種のＰｅｍＫ核酸配列またはアミノ酸配列のオルソログ／ホモログをいうことができる。
本発明の方法におけるＰｅｍＫのホモログまたはオルソログによってコードされるヌクレアーゼの使用が本明細書中で意図される。例示的ホモログおよびオルソログには、ＰｅｍＫタンパク質ファミリーの７３種の公知のメンバー（ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）、ＣｈｐＢＫ、および他のＰｅｍＫ様タンパク質が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。以下は、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔｄｅｓｃ？ａｃｃ＝ＰＦ０２４５２）で見出されるこれらのタンパク質の名称のリストである：
（図３３および３４を参照のこと）。
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ番号の後にＮＣＢＩ番号を示す：
。
本明細書中で使用される、用語「オルソログ」またはホモログはまた、ポリペプチド産物がＭａｚＥコード配列と６０％を超えて同一であり、そして／または遺伝子産物がＭａｚＥと類似の三次元構造および／または生物活性を有する核酸配列によってコードされたヌクレアーゼの結合パートナー（ヌクレアーゼの抗毒素またはモジュレーター）をいう。例示的オルソログ／ホモログには、デイノコッカス・ラジオデュランスのｍａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２９４１３９）；バチルス・ハロデュランスのＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２４４５８７）；プラスミドＲ１００のＰｅｍＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５２９９３）；プラスミドＲ４６６ｂのＰｅｍＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ８２５１５）；大腸菌のＣｈｐＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２９０８５６）；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７４２９３１）；フォトバクテリウム・プロファンダムのＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ３４５５４）が含まれるが、これらに限定されない。図２４および２５を参照のこと。用語「オルソログ」および「ホモログ」を使用して、任意の種のＭａｚＥ核酸配列またはアミノ酸配列のオルソログ／ホモログをいうことができる。このような種には、大腸菌、デイノコッカス・ラジオデュランス、バチルス・ハロデュランス、シュードモナス・プチダ、フォトバクテリウム・プロファンダム、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、枯草菌、髄膜炎菌、モルガネラ・モルガニイ、結核菌、ハツカネズミ、およびホモ・サピエンスが含まれる。本発明の方法におけるこのようなホモログ／オルソログによってコードされるヌクレアーゼ調節分子（抗毒素）の使用は本明細書中で意図される。
本明細書中で使用される、用語「オルソログ」またはホモログはまた、ポリペプチド産物がＰｅｍＩコード配列と６０％を超えて同一であり、そして／または遺伝子産物がＰｅｍＩと類似の三次元構造および／または生物活性を有する核酸配列によってコードされたヌクレアーゼの結合パートナー（ヌクレアーゼの抗毒素またはモジュレーター）をいう。ＰｅｍＩの例示的オルソログ／ホモログには、ＭａｚＥ（抗毒素）タンパク質ファミリーの公知のメンバー（ＭａｚＥ（ＣｈｐＡＩ）、ＣｈｐＢＩ、および他のＭａｚＥホモログが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。用語「オルソログ」および「ホモログ」を使用して、任意の種のＰｅｍＩ核酸配列またはアミノ酸配列のオルソログ／ホモログをいうことができる。本発明の方法におけるこのようなホモログによってコードされるヌクレアーゼ調節分子の使用は本明細書中で意図される。本発明の方法におけるこのようなホモログ／オルソログによってコードされるヌクレアーゼ調節分子（抗毒素）の使用は本明細書中で意図される。
本明細書中で使用される、用語「機能的」は、核酸配列またはアミノ酸配列が引用されたアッセイまたは目的で機能的であることを意図する。
本明細書中で使用される、用語「機能的フラグメント」は、核酸配列またはアミノ酸配列が全長ポリペプチドの一部またはサブドメインであり、引用されたアッセイまたは目的で機能的であることを意図する。
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸をいう場合、句「本質的に〜なる」は、所与の配列番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用する場合、この句には、配列自体ならびに配列の基本的および新規の特徴に影響を与えない分子修飾物が含まれる。
「レプリコン」は、そのコントロール下で大量に複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルス）である。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡでのいずれかであってよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
「ベクター」は、結合した配列またはエレメントを複製するために別の配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を結合することができるレプリコン（プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなど）である。
「発現ベクター」または「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始部位（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳調節配列を保有することができ、かつ宿主細胞または宿主生物中でのポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントをいう。
本明細書中で使用される、用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現を媒介することができ、かつコード配列を発現するためにコード配列と比較して適切な位置でＤＮＡ分子（例えば、発現ベクター）中に存在する調節配列をいう。この同一の定義を、しばしば、発現ベクター中のコード配列および転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターエレメント）の配置に適用する。この定義を、しばしば、ハイブリッド核酸分子が作製される第１および第２の核酸分子の核酸配列の配置にも適用する。
本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプライマーおよびプローブをいい、２つまたはそれ以上、好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは種々の要因、特定の適用、およびオリゴヌクレオチドの使用に依存する。
本明細書中で使用される、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在するか合成され、かつプローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか特異的にハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、あまたは核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）をいう。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブの長さは、多数の要因（温度、プローブ供給源、および方法の使用が含まれる）に依存する。例えば、診断への適用のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。本明細書中に記載のプローブを、特定の標的核酸配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プローブが所定の条件下でその核標的鎖と「特異的にハイブリッド形成する」か、アニーリングすることができるために十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、標的の正確な相補配列を反映する必要はない。例えば、非相補ヌクレオチドフラグメントをプローブの５’末端または３’末端に結合することができ、プローブ配列の残りが標的鎖に相補的である。あるいは、プローブ配列が標的核酸配列と特異的にアニーリングするために十分に相補的である場合、非相補塩基またはより長い配列をプローブに散在させることができる。
用語「特異的にハイブリッド形成する」は、当該分野で一般に使用されている所定の条件下でこのようなハイブリッド形成が行われるために十分に相補的な（時折、「実質的に相補的な」と呼ばれる）配列の２つの一本鎖核酸分子間の会合をいう。特に、この用語は、非相補配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を実質的に除外した、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成をいう。
本明細書中で使用される、用語「プライマー」は、適切な環境下におかれた場合に温度依存性核酸合成のイニシエーターとして機能的に作用することができる生体系に由来するか、制限酵素消化によって作製されるか、合成された一本鎖または二本鎖のいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであるオリゴヌクレオチドをいう。適切な核酸テンプレート、核酸の適切なヌクレオチド酸リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、ならびに適切な温度およびｐＨなどの条件を使用した場合、プライマーをポリメラーゼの作用または類似の活性によるヌクレオチドの添加によってその３’末端を伸長してプライマー伸長産物を得ることができる。プライマーの長さは、特定の条件および適用要件に依存して変化し得る。例えば、診断への適用では、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、典型的には、１５〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドである。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始するための（すなわち、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成の開始で使用するための適切な並列でのプライマーの３’ヒドロキシル部分を得るために十分な様式で所望のテンプレート鎖とアニーリングすることができるための）所望のテンプレートに十分に相補的でなければならない。プライマー配列は所望のテンプレートと正確な相補性を示すことは必要ない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列を、別の相補的プライマーの５’末端に結合することができる。あるいは、プライマー配列が伸長産物の合成のためのテンプレート−プライマー複合体が機能的に提供されるのに十分に所望のテンプレート鎖の配列が相補的である場合、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させることができる。
プライマーを、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）で蛍光標識することができる。あるいは、プライマーを、４，７，２’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）で標識することができる。他の別のＤＮＡ標識方法が当該分野で公知であり、本発明の範囲内であることが意図される。
用語「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」を、本明細書中で時折使用する。この用語は、主に、本発明の単離核酸配列の発現によって産生されたタンパク質をいう。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するために天然に会合した他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質をいうことができる。「単離された」は、他の化合物もしくは材料との人工的または合成混合物または基本的活性を妨害せず、かつ例えば、完全な精製、安定剤の添加、例えば免疫原性調製物もしくは薬学的に許容可能な調製物への配合によって存在し得る夾雑物の存在を排除することを意味しない。
用語「実質的に純粋な」は、少なくとも５０〜６０重量％の所与の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物をいう。より好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９５重量％の所与の化合物を含む。所用の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィ法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＨＰＬＣ分析など）によって純度を測定する。「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、ポリペプチド前駆体由来のタンパク質分解プロセシングなどのその一連の発生時にポリペプチドが通常発生する任意のプロセシング事象後にポリペプチド配列を保有するポリペプチドを意味するものとする。成熟タンパク質の配列または境界線の指名において、成熟タンパク質配列の第１のアミノ酸をアミノ酸残基１と指名する。
用語「タグ」、「タグ配列」、または「タンパク質タグ」は、特に、配列の検出または単離に関する方法に関して、別の配列に付加した場合にさらなる有用性が得られるか配列に有用な特性を付与する化学的部分（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、または他の化学物質）をいう。したがって、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的なホモポリマー核酸配列または核酸配列を、その後の伸長産物またはハイブリッド形成産物の単離を容易にするためにプライマーまたはプローブに付加することができる。タンパク質タグの場合、ヒスチジン残基（例えば、４〜８個の連続ヒスチジン残基）を、キレート化金属クロマトグラフィによるタンパク質単離を容易にするためにタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに付加することができる。あるいは、特定の抗体分子または他の分子との反応性を示すエピトープまたは結合決定基を示すアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質、または融合パートナー（例えば、フラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡ型血球凝集素タンパク質の膜貫通エピトープ、タンパク質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）を、アフィニティまたは免疫アフィニティクロマトグラフィなどの手順によるタンパク質単離を容易にするためにタンパク質に添加することができる。化学的タグ部分には、核酸またはタンパク質のいずれかに付加してアビジン試薬などとの相互作用による単離または検出を容易にすることができるビオチンなどの分子が含まれる。多数の他のタグ部分が当業者に公知であり、想定することができ、本発明の範囲内に含まれることを意図する。
用語「形質転換する」、「トランスフェクトする」、「形質導入する」は、細胞または宿主に核酸が移入される任意の方法または手段をいうものとし、同一の意味を伝えるために交換可能に使用することができる。このような方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、ＰＥＧ融合が含まれるが、これらに限定されない。
移入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれて（共有結合して）いても組み込まれていなくても良い。細菌、酵母、植物、および哺乳動物の細胞では、例えば、組み込まれた核酸を、エピソームエレメントまたはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持することができる。あるいは、組み込まれた核酸がレシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれてその細胞または生物中で安定に維持され、レシピエント細胞または生物の子孫細胞または生物にさらに継代されるか遺伝するようになり得る。他の適用では、移入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物中に一過性にのみ存在し得る。
「クローン」または「クローン細胞集団」は、有糸分裂による１つの細胞または共通の祖先由来の細胞集団である。
「細胞株」は、インビトロで多世代にわたって安定に成長することができる初代細胞または細胞集団のクローンである。
本発明の分子または化合物を含む組成物を、予防および／または治療上の処置のために投与することができる。１つの治療への適用では、例えば、組成物を疾患およびその合併症を治癒するかその症状を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で過剰増殖障害（例えば、癌など）を既に罹患している患者に投与する。これを達成するための適量を、「治療有効量または治療有効用量」と定義する。この用途に有効な量は、疾患の重症度ならびに患者の体重および一般的症状に依存する。
本明細書中で使用される、用語「癌」は、制御不能の進行性増殖に起因する異常な成長をいう。本発明の方法によって治療することができる癌の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸腫瘍、胃癌（ｇａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、乳癌、（最も一般に汎発性胸あるいは肺癌と結び付けられる）髄膜癌腫症（播種性乳癌または肺癌と最も一般に関連する）、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、肝転移、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、未分化甲状腺癌などの甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫と網膜芽細胞腫などの肉腫、芽細胞腫、および癌腫が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法にしたがって治療することができる血液悪性腫瘍の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病およびホジキンリンパ腫（ＨＤ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が含まれる。
「免疫応答」は、機能的免疫系を有する宿主内でタンパク質抗原などの抗原によって得られた任意の反応を示す。免疫応答は、免疫グロブリンまたは抗体の産生を含む体液性、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞などを含む細胞性、またはその両方であり得る。免疫応答はまた、サイトカインおよびリンホカインなどの種々のエフェクター分子の産生または加工（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を含み得る。免疫応答を、インビトロおよび種々の細胞系または動物系の両方で測定することができる。
「抗体」または「抗体分子」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン（抗体およびそのフラグメントが含まれる）である。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および二重特異性抗体が含まれる。本明細書中で使用される、「抗体または抗体分子」は、インタクトな免疫グロブリン分子および当該分野で公知のものなど（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ｖ））の免疫グロブリン分子の免疫活性部分を意図する。
用語「細胞基質」は、酵素または関連酵素ファミリーの酵素標的である細胞中の分子をいう。ｍＲＮＡインターフェラーゼに関して、「細胞基質」には、内因性または外因性核酸配列から発現された細胞中のポリリボヌクレオチドが含まれる。
本明細書中で使用される、句「エンドリボヌクレアーゼ活性を促進する条件下」には、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼがエンドリボヌクレアーゼ活性を示す細胞（細胞培養またはインビボ）またはインビトロ（試験かまたは他の類似の容器）中の任意の条件が含まれる。このような条件を、本明細書中に示す実施例に記載する。同様に、「ｍＲＮＡインターフェラーゼ適合緩衝液」は、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼがエンドリボヌクレアーゼ活性を示す緩衝液である。
本明細書中で使用される、用語「ｍＲＮＡインターフェラーゼ調節剤」は、ｍＲＮＡインターフェラーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性を調節する（例えば、増加または減少する）ことができる薬剤をいう。このような薬剤のスクリーニング／同定方法を、本明細書中の以下に記載する。例示的内因性ｍＲＮＡインターフェラーゼ調節剤には、ＭａｚＥ（ＭａｚＦ活性を阻害する）およびＰｅｍＩ（ＰｅｍＫ活性を阻害する）が含まれる。ＭａｚＦおよびＰｅｍＫ活性を阻害することができるＭａＥおよびＰｅｍＩの機能的部分もそれぞれ本明細書中に記載する。
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語及び科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができ、好ましい方法および材料を本明細書中に記載する。本明細書中に記載の全ての刊行物は、引用された刊行物と共に開示および記載の方法および／または材料に対して本明細書中で参照として援用される。
（Ｉ．ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸分子およびｍＲＮＡインターフェラーゼの調節）
（核酸分子）
本発明のエンドリボヌクレアーゼ（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）をコードする核酸分子を、以下の２つの一般的方法によって調製することができる：（１）適切なヌクレオチド三リン酸からの合成、または（２）生物供給源からの単離。両方法は、当該分野で周知のプロトコールを使用する。
配列番号１または３の全長ｃＤＮＡなどのヌクレオチド配列情報の利用により（図２０Ａおよび３１Ａを参照のこと）、オリゴヌクレオチド合成によって本発明の単離核酸分子を調製することができる。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０ＡＤＮＡ合成機または類似のデバイスで使用したホスホラミダイト法によって合成オリゴヌクレオチドを調製することができる。得られた構築物を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）などの当該分野で公知の方法によって精製することができる。現在のオリゴヌクレオチド合成法に固有のサイズ制限に起因して、本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドを段階的に合成することができる。次いで、このような方法によって構築された合成ＤＮＡ分子を、適切なベクターにクローン化および増幅することができる。ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸配列を、当該分野で公知の方法を使用して適切な生物供給源から単離することができる。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡクローンを、細菌供給源のｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離する。別の実施形態では、ｃＤＮＡ配列によって提供された配列情報を使用して、ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードするゲノムクローンを単離することができる。あるいは、ｍＲＮＡインターフェラーゼと相同なｃＤＮＡまたはゲノムのクローンを、ｍＲＮＡインターフェラーゼ遺伝子内の所定の配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを使用して、他の種から単離することができる。
本発明によれば、配列番号１または３のタンパク質コード領域と適切なレベルの配列相同性を有する核酸を、適切なストリンジェンシーのハイブリッド形成および線状条件の使用によって同定することができる。例えば、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５〜１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、および５０％までのホルムアミドを含むハイブリッド形成溶液を使用して、ハイブリッド形成を行うことができる。一般に、３７〜４２℃で少なくとも６時間ハイブリッド形成を行う。ハイブリッド形成後、以下のようにフィルターを洗浄する：（１）２×ＳＳＣおよび０．５〜１％ＳＤＳ中にて室温で５分間、（２）２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中にて室温で１５分間、（３）１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中にて３７℃で３０分〜１時間、（４）１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中にて４２〜６５℃で２時間（３０分毎に溶液を交換する）。
特定した配列相同性の核酸分子間でハイブリッド形成させるために必要なストリンジェンシー条件の１つの一般的計算式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）は、
Ｔｍ＝８１．５℃１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中のｂｐ数
である。
上記式の例示のように、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミド、ＧＣ含有率４２％および平均プローブサイズ２００塩基を使用して、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍが１〜１．５℃減少するにつれて相同性が１％減少する。したがって、４２℃のハイブリッド形成温度を使用して、配列同一性が約７５％を超える標的が認められる。このような配列を、本発明の核酸配列と実質的に相同であると見なす。
上記で認められるように、ハイブリッド形成および洗浄のストリンジェンシーは、主に、溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、２つの核酸分子のアニーリング率を最大にするために、通常、計算したハイブリッドのＴｍより２０〜２５℃低い温度でハイブリッド形成を行う。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一度のためにできるだけストリンジェントにすべきである。一般に、ハイブリッドのＴｍより約１２〜２０℃低い温度となるように線状条件を選択すべきである。本発明の核酸に関して、中ストリンジェンシーハイブリッド形成を、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリッド形成ならびに２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける５５℃で１５分間の洗浄と定義する。高ストリンジェンシーハイブリッド形成を、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリッド形成ならびに１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃で１５分間の洗浄と定義する。非常に高いストリンジェンシーハイブリッド形成を、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡにおける４２℃でのハイブリッド形成ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにおける６５℃で１５分間の洗浄と定義する。
本発明の核酸を、任意の都合の良いクローニングベクター中のＤＮＡとして維持することができる。好ましい実施形態では、適切な大腸菌宿主細胞中で増殖されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）などのプラスミドクローニング／発現ベクター中でクローンを維持する。ｍＲＮＡインターフェラーゼ遺伝子をコードする本発明のゲノムクローンを、λファージＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に維持することができる。
本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸分子には、一本鎖または二本鎖であり得るｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのフラグメントが含まれる。したがって、本発明は、配列番号１または３のいずれかのｃＤＮＡの選択されたセグメントなどの少なくとも１つの本発明の核酸分子配列とハイブリッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡインターフェラーゼ遺伝子の検出または単離のためのプローブとして有用である。
これらの配列の変異型（例えば、対立遺伝子変異型）が細菌の集団／種に存在し、本発明のオリゴヌクレオチドをデザインおよび／または使用する場合に考慮しなければならないことが当業者に認識される。したがって、本明細書中に開示のｍＲＮＡインターフェラーゼ配列または各遺伝子もしくはＲＮＡ転写物上の特定の位置にターゲティングされたオリゴヌクレオチドに関して、このような変異型を含むことが本発明の範囲内である。このような変異型を含めることに関して、用語「天然の対立遺伝子変異型」を、所与のＤＮＡ集団中で起こる種々の特異的ヌクレオチド配列およびその変異型をいうために本明細書中で使用する。コードされたタンパク質中の保存的または天然のアミノ酸置換が起こる遺伝的多型は、このような変異型の例である。さらに、用語「実質的に相補的な」は、標的配列と完全に適合することができないが、ミスマッチが記載の条件下でオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリッド形成する能力に実質的に影響を与えないオリゴヌクレオチド配列をいう。
したがって、コード配列は、配列番号１または３に示すものであり得るか、これらのいずれかの配列の変異体、変異型、誘導体、または対立遺伝子であり得る。この配列は、示した配列の１つまたは複数のヌクレオチドの１つまたは複数の付加、挿入、欠失、および置換である変化によって示した配列と異なり得る。遺伝コードによって決定したところ、ヌクレオチド配列の変化により、タンパク質レベルでアミノ酸が変化しても変化しなくても良い。
したがって、本発明の核酸には、配列番号１または３に示す配列と異なるが同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列が含まれ得る。
他方では、コードされたポリペプチドは、配列番号２または４に示すアミノ酸配列と１つまたは複数のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み得る。図２０Ｂおよび３１Ｂを参照のこと。配列番号２または４に示す配列のアミノ酸配列の変異体、変異型、誘導体、または対立遺伝子であるポリペプチドをコードする核酸を、本発明によってさらに提供する。このようなポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１または３に示すコード配列と６０％を超えて同一、約７０％を超えて同一、約８０％を超えて同一、約９０％を超えて同一、または約９５％を超えて同一であり得る。
本発明は、配列番号１または３に示す配列の一部または全部またはその相補配列を有するプローブの標的核酸とのハイブリッド形成を含む、目的の核酸を得る方法を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の１つまたは複数の工程を含み得る首尾の良いハイブリッド形成によって、プローブとハイブリッド形成した核酸が単離される。
このようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、全長配列（および変異型、対立遺伝子、変異型、および誘導体）と同様に、ｍＲＮＡインターフェラーゼの対立遺伝子、変異体、または変異型の存在について核酸を含む試験サンプルのスクリーニングで有用であり、細胞、組織、または生物から得たサンプル由来の標的配列とハイブリッド形成するプローブを試験する。ハイブリッド形成条件を、非特異的結合を最小にするように調節することができる。好ましくは、中ストリンジェンシーハイブリッド形成条件を使用する。当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９２）などのテキストを利用してこのようなプローブを容易にデザインし、標識し、ハイブリッド形成条件に適切な条件を案出することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、配列番号１または３に示す配列のフラグメントまたはエンドリボヌクレアーゼ活性に関連する任意の対立遺伝子である本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長である。このようなフラグメント自体は、本発明の態様を個別に示す。フラグメントおよび他のオリゴヌクレオチドを、考察のようにプライマーまたはプローブとして使用することができるが、ｍＲＮＡインターフェラーゼのホモログまたはオルソログをコードする配列の試験サンプル中の存在の決定を考慮した方法（例えば、ＰＣＲによる）で作製することもできる。
（Ｂ．タンパク質）
ＭａｚＦは、高い特異性で特定の核酸配列（すなわち、ＡＣＡ）でＲＮＡを切断する最初に同定されたヌクレアーゼである。ＰｅｍＫは、高い特異性で特定の核酸配列（すなわち、ＵＡＸ（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである））でＲＮＡを切断する最初に同定されたヌクレアーゼである。本発明の全長ｍＲＮＡインターフェラーゼタンパク質（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）を、公知の方法にたがった種々の方法で調製することができる。適切な供給源からタンパク質を精製することができる。しかし、所与の細胞型に常に存在する可能性が高いタンパク質の量が少ないので、これは好ましい方法ではない。ＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードする核酸分子の利用によって、当該分野で公知のインビトロ発現方法を使用してこれらのいずれかのタンパク質を産生することができる。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子をインビトロ転写のためのｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５などの適切なインビトロ転写ベクターにクローン化し、その後に小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶解物などの適切な無細胞翻訳系で無細胞翻訳することができる。インビトロ転写系および翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．またはＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから市販されている。
あるいは、好ましい実施形態によれば、適切な原核生物系または真核生物系における発現によってより大量のｍＲＮＡインターフェラーゼを産生することができる。例えば、配列番号１または３のｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部または全部を、大腸菌などの細菌細胞における発現に適合させたプラスミドベクターに挿入することができる。このようなベクターは、宿主細胞でＤＮＡを発現させる様式などで配置した宿主細胞（例えば、大腸菌）におけるＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。発現に必要なこのような調節エレメントには、プロモーター配列、転写開始配列、および任意選択的にエンハンサー配列が含まれる。
組換え原核生物系または真核生物系における遺伝子発現によって産生されたｍＲＮＡインターフェラーゼを、当該分野で公知の方法によって精製することができる。好ましい実施形態では、市販の発現系／スクリーニング系を使用して、組換えタンパク質の発現後に宿主細胞から分泌させ、周囲の培地から容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用する場合、別のアプローチは、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用などの親和性分離またはそのＮ末端もしくはＣ末端で６〜８個のヒスチジン残基でタグ化した組換えタンパク質の単離のためのニッケルカラムによる組換えタンパク質の精製を含む。別のタグは、ＦＬＡＧエピトープまたは血球凝集素エピトープを含み得る。このような方法は、当業者が一般に使用している。
上記方法によって調製された本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼを、標準的な手順によって分析することができる。例えば、このようなタンパク質を、公知の方法にしたがってアミノ酸配列分析に供することができる。
アミノ酸配列の変異型、対立遺伝子、誘導体、または変異体であるポリペプチドも本発明によって提供する。変異型、対立遺伝子、誘導体、または変異体であるポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の付加、置換、欠失、および挿入によって配列番号２とアミノ酸配列が異なり得る。好ましいこのようなポリペプチドはＭａｚＦ機能を有し、言い換えると、１つまたは複数の以下の性質を有する：ＲＮＡ中のＡＣＡ配列を切断する能力；配列が配列番号２を与えられたポリペプチドと反応性を示す抗体との免疫学的交差反応性；エピトープを配列が配列番号２を与えられたポリペプチドと共有すること（例えば、２つのポリペプチド間の免疫学的交差反応性によって決定）。
あるいは、変異型、対立遺伝子、誘導体、または変異体であるポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の１つまたは複数の付加、置換、欠失、および挿入によって配列番号４とアミノ酸配列が異なり得る。好ましいこのようなポリペプチドはＰｅｍＫ機能を有し、言い換えると、１つまたは複数の以下の性質を有する：ＲＮＡ中のＵＡＸ配列（式中、Ｘは、Ｃ、Ａ、またはＵである）を切断する能力；配列が配列番号４を与えられたポリペプチドと反応性を示す抗体との免疫学的交差反応性；エピトープを配列が配列番号４を与えられたポリペプチドと共有すること（例えば、２つのポリペプチド間の免疫学的交差反応性によって決定）。
配列番号２または４に示すアミノ酸配列の変異型、対立遺伝子、誘導体、または変異体であるポリペプチドは、示した配列と約３５％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えて、または約９５％を超えて配列が同一なアミノ酸配列を共有し得る。特定のアミノ酸配列変異型は、１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、または１５０個を超えるアミノ酸の挿入、付加、置換、または欠失によって配列番号２または４と異なり得る。アミノ酸「相同性」について、これを、（例えば、アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して決定した確立されたアミノ酸類似性の原理にしたがって）同一性または類似性と理解することができる。ＧＡＰは、２つの完全な配列のアラインメントを行うためにマッチ数を最大にし、かつギャップ数を最小にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する。一般に、ギャップ作製ペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータを使用する。ＧＡＰの使用が好ましいが、他のアルゴリズムを使用することができる（一般にデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０）；ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８）、またはＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｏｇｒｉｔｈｍ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が含まれるが、これらに限定されない）。本明細書中の用語、「相同性」および「相同な」のいずれかの使用は、比較される配列間のいかなる必要な進化関係も意味しない。この用語を、句「相同組換え」と同様に使用する（すなわち、この用語は単に２つのヌクレオチド配列が適切な条件下での組換えのために十分に類似することが必要である）。
本発明のポリペプチドを、その活性または機能に影響を与えるか調節する分子のスクリーニングで使用することができる。このような分子は、研究目的で有用であり得る。
本発明はまた、本発明のタンパク質と免疫特異的に結合することができる抗体を提供する。ｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）に指向するポリクローナル抗体を、標準的な方法によって調製することができる。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡインターフェラーゼの種々のエピトープと免疫特異的に反応するモノクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体を、標準的なプロトコールにしたがって、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎの一般的方法によって調製することができる。ｍＲＮＡインターフェラーゼを免疫特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をこのようなタンパク質の同定および精製に使用することができる。例えば、免疫特異的に相互作用するタンパク質の親和性分離に抗体を使用することができる。抗体を使用して、タンパク質と他の生体分子との混合物を含むサンプルからタンパク質を免疫沈降することもできる。抗ｍＲＮＡインターフェラーゼ抗体の他の使用を以下に記載する。
本発明の抗体を、多数の方法で修飾することができる。実際、用語「抗体」を、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合物質を対象とすると解釈すべきである。したがって、本発明は、抗体のフラグメント、誘導体、機能的等価物、およびホモログ（合成分子およびその形状が抗原またはエピトープに結合可能な抗体の形状を模倣した分子が含まれる）を対象とする。
抗原または他の結合パートナーに結合することができる例示的抗体フラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１、およびＣＨ１からなるＦａｂフラグメント、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離ＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである。単鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
（ＩＩ．ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸、ｍＲＮＡインターフェラーゼ、およびそれに対する抗体の使用）
例えば、ＭａｚＦおよびＰｅｍＫは、細胞、組織、または器官でのタンパク質合成の減少または阻害を有利にするために使用することができるＲＮＡエンドヌクレアーゼである。さらに、ターゲティングされた組織中でのタンパク質合成を特異的に減少または阻害するために、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼを、被験体中の特定の組織に特異的にターゲティングすることができる。いくつかの適用のために、ＭａｚＦによるエンドヌクレアーゼ的切断のための特定のＲＮＡ転写物のターゲティングに有利である。このような配列は、高い頻度でＡＣＡ配列を含み得るので、ＭａｚＦ活性の天然の好ましい標的である。あるいは、切断のためにターゲティングした転写物を特異的または優先的に結合および／または切断するためのＭａｚＦポリペプチドの変化によるＭａｚＦの切断のために、ＲＮＡ転写物をターゲティングすることができる。あるいは、ＰｅｍＫによるエンドヌクレアーゼ的切断のために特定のＲＮＡ転写物をターゲティングすることが有利であり得る。このような配列は高い頻度でＵＡＸ配列（式中、Ｘは、Ｃ、Ａ、Ｕである）を含み得るので、ＰｅｍＫ活性の天然の好ましい標的である。あるいは、切断のためにターゲティングした転写物を特異的または優先的に結合および／または切断するためのＰｅｍＫポリペプチドの変化によるＰｅｍＫの切断のために、ＲＮＡ転写物をターゲティングすることができる。
詳細には、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼ分子（ＭａｚＦおよびＰｅｍＫなど）および組成物を使用して、過剰増殖障害患者を有利に治療することができる。このような障害には、異なる組織の形成異常および化生、炎症性状態、自己免疫疾患、過剰増殖性皮膚障害、乾癬、アレルギー／喘息、アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、および癌が含まれるが、これらに限定されない。本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼ分子（ＭａｚＦおよびＰｅｍＫなど）および組成物を使用して、細菌感染患者を有利に治療することもできる。
さらに、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼの核酸、タンパク質、およびそれに対する抗体を、ＲＮＡの認識および切断反応に密接に関与する他のタンパク質を同定するための研究ツールとして使用することができる。
（Ａ．ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸）
ＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードする核酸を、本発明の種々の目的に使用することができる。ＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのフラグメントを、ＭａｚＦ様タンパク質およびＰｅｍＫ様タンパク質の存在および／または発現を検出するためのプローブとして使用することができる。ＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードする核酸このようなアッセイのプローブとして使用することができる方法には、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成、（２）サザンハイブリッド、（３）ノーザンハイブリッド形成、および（４）ＰＣＲなどの種々の増幅反応が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸を、他の細菌、植物、または動物種由来の関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用することもできる。当該分野で周知のように、ハイブリッド形成ストリンジェンシーを、種々の程度の相同性で核酸プローブが相補配列とハイブリッド形成するように調節することができる。したがって、ＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードする核酸を使用して、種々の程度でＭａｚＦおよび／またはＰｅｍＫと関連する他の遺伝子を有利に同定および特徴づけることができ、それによって、ＲＮＡ分解系をさらに特徴づけることができる。さらに、これらを使用して（例えば、「相互作用トラップ」技術によって）ＭａｚＦおよび／またはＰｅｍＫと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子を同定することができ、ＲＮＡ切断に関与する成分の同定がさらに促進されるはずである。
ＭａｚＦまたはＰｅｍＫをコードする核酸分子またはそのフラグメントを使用して、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫの産生を調節し、それによってＲＮＡ切断配列に関わるためのタンパク質の使用量を調節することができる。ＭａｚＦまたはＰｅｍＫタンパク質の生理学適量の変化は、ＲＮＡ切断に関与する他のタンパク質因子の活性に劇的な影響を与え得る。
（Ｂ．ｍＲＮＡインターフェラーゼおよびそれに対する抗体）
本発明のＭａｚＦまたはＰｅｍＫをコードする核酸の発現を介した単離したＭａｚＦまたはＰｅｍＫなどの精製ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはそのフラグメントを使用して、細菌細胞におけるＭａｚＦ（またはＭａｚＦを含む複合体）またはＰｅｍＫ（またはＰｅｍＫを含む複合体）の存在および蓄積の感度の高い検出試薬として使用することもできるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生することができる。組換え技術により、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫタンパク質の一部または全部を含む融合タンパク質を発現することができる。全長タンパク質またはタンパク質のフラグメントを使用して、タンパク質の種々のエピトープに特異的なモノクローナル抗体のアレイを有利に作製し、それによって細胞中のタンパク質の検出感度をさらにより高くすることができる。
ｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）に免疫学的に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、タンパク質を検出および定量するためにデザインした種々のアッセイで使用することができる。このようなアッセイには、（１）フローサイトメトリー分析、（２）例えば、細菌細胞におけるｍＲＮＡインターフェラーゼの免疫化学的局在化、および（３）種々の細胞由来の抽出物の免疫ブロット分析（例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、上記のように、例えば、抗ＭａｚＦ抗体および抗ＰｅｍＫ抗体を、ＭａｚＦおよびそのオルソログまたはＰｅｍＫおよびそのオルソログの精製（例えば、アフィニティカラム精製、免疫沈降）に使用することができる。
上記考察のように、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫタンパク質などのｍＲＮＡインターフェラーゼを使用して、細胞、組織、または器官におけるタンパク質合成を有利に減少または阻害することができる。
上記考察から、ＲＮＡ切断に関与する遺伝子とタンパク質との相互作用を確認する目的で、本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸、ｍＲＮＡインターフェラーゼを発現するベクター、および抗ｍＲＮＡインターフェラーゼ抗体を使用して、大量のｍＲＮＡインターフェラーゼタンパク質を産生し、ｍＲＮＡインターフェラーゼ遺伝子発現を検出し、ｍＲＮＡインターフェラーゼの蓄積を変化させることができることが認められた。
本発明者らは、細菌由来の安定な毒素ＭａｚＦがエンドリボヌクレアーゼであるという驚くべきことを発見した。本明細書中に記載のように、ＭａｚＦは、「ＲＮＡインターフェラーゼ」と呼ばれる新規の酵素ファミリーの第１のメンバーとして指定された。さらに、ＭａｚＦは「ＲＮＡインターフェラーゼ」の新規のファミリーの範例であることが提案されている。注目すべきことは、本発明の発見前に、ＭａｚＦの細胞標的は同定されていなかった。本明細書中に示すように、ＭａｚＦはＡＣＡ部位で細胞ｍＲＮＡを切断する高度に配列特異的なエンドリボヌクレアーゼとして機能する。このような活性は、細胞中でのタンパク質合成を部分的または完全に阻害をすることができる。ＲＮＡ転写物中のＡＣＡ配列の予想される頻度は、４つのヌクレオチドのうちの任意の１つが３つのヌクレオチド位置にそれぞれ組み込まれる確率が等しいと予想する標準的な計算に基づいて１／６４である。いくつかのＲＮＡ転写物は予想される頻度と比較してＡＣＡ配列の頻度が低いか高いと理解すべきである。したがって、特異的ＲＮＡ転写物または関連するＲＮＡ転写物ファミリーのＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼによる切断に対する感受性は、転写物中のＡＣＡ配列またはＭａｚＦ標的配列の頻度に依存する。さらに、当業者は、ＲＮＡ転写物の配列に基づいて、ＭａｚＦ媒介切断に対する転写物の感度を予想することができる。
本発明者らは、ＰｅｍＫが本明細書中で「ＲＮＡインターフェラーゼ」と命名された新規の酵素ファミリーのメンバーであることも発見した。本明細書中に示すように、ＰｅｍＫは、ＵＡＸ部位（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）で細胞ｍＲＮＡを切断する配列特異性の高いエンドリボヌクレアーゼとして機能するする。このような活性により、細胞中のタンパク質合成の部分的または完全な阻害を達成することができる。ＲＮＡ転写物中のＵＡＸ部位（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである配列）の予想される頻度は、４つのヌクレオチドのうちの任意の１つが３つのヌクレオチド位置にそれぞれ組み込まれる確率が等しいと予想する標準的な計算に基づいて１／６４である。いくつかのＲＮＡ転写物は予想される頻度と比較してＵＡＸ配列の頻度が低いか高いと理解すべきである。したがって、特異的ＲＮＡ転写物または関連するＲＮＡ転写物ファミリーのＰｅｍＫエンドリボヌクレアーゼによる切断に対する感受性は、転写物中のＵＡＸ配列（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）またはＰｅｍＫ標的配列の頻度に依存する。さらに、当業者は、ＲＮＡ転写物の配列に基づいて、ＰｅｍＫ媒介切断に対する転写物の感度を予想することができる。
したがって、本発明者らの新規の所見は、ｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦおよびＰｅｍＫ）の核酸配列およびアミノ酸配列ならびにその組成物を有利に使用することができる新規の適用を提供する。このような有用性には、本明細書中に記載の種々の研究および治療への適用が含まれるが、これらに限定されない。ＭａｚＦおよびＰｅｍＫ核酸および／またはアミノ酸配列、ＭａｚＦおよび／またはＰｅｍＫ活性適合緩衝液、および取扱い説明書を含むキットも提供する。
（ＩＩＩ．ｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビターをコードする核酸分子およびｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビタータンパク質の調製）
ＭａｚＥおよびＰｅｍＩをコードする核酸分子ならびにＭａｚＥおよびＰｅｍＩポリペプチドおよびそのフラグメントを、本質的にＭａｚＦおよびＰｅｍＫをコードする核酸配列およびＭａｚＦおよびＰｅｍＫポリペプチドについて記載のように作製する。本発明によれば、ＭａｚＥタンパク質をコードし、かつ配列番号５を含む核酸配列を提供する。図２１Ａを参照のこと。配列番号６およびその機能的フラグメントを含むアミノ酸配列も提供する。図２１Ｂを参照のこと。したがって、ＰｅｍＩタンパク質をコードし、かつ配列番号７を含む核酸を提供する。図３２Ａを参照のこと。配列番号８を含むアミノ酸配列およびその機能的フラグメントも提供する。図３２Ｂを参照のこと。
（ＩＶ．ｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビターをコードする核酸およびｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビタータンパク質の使用）
配列番号５によってコードされるＭａｚＥポリペプチド、配列番号６を含むＭａｚＥポリペプチドをコードする核酸配列およびその機能的フラグメント、ならびに配列番号６を含むＭａｚＥポリペプチドおよびその機能的フラグメントが本発明に含まれる。本明細書中に記載のように、ＭａｚＥポリペプチドおよびその機能的フラグメントは、ＭａｚＦ活性を調節する能力を示す。以下の実施例ＩＩＩおよびまとめを参照のこと。
簡単に述べれば、本明細書中で証明されるように、精製（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡの結合を、ＭａｚＦによって増強させた。ＭａｚＥのＮ末端領域中の保存アミノ酸残基（Ｋ７Ａ、Ｒ８Ａ、Ｓ１２Ａ、およびＲ１６Ａ）での部位特異的変異誘発により、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の両方のＤＮＡ結合能が破壊され、ＭａｚＥがＮ末端ドメインを介してｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡと結合することが示唆される。溶液中で、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体中のＭａｚＥとＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６との比は約１：２である。ＭａｚＥおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は共にホモに量体として存在するので、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体（７６．９ｋＤａ）は、１つのＭａｚＥ二量体および２つのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６二量体からなると予想される。酵母２ハイブリッド系を使用して、ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の相互作用も特徴づけた。ＭａｚＥの残基３８から７５までの領域はＭａｚＦの結合に必要であることが見出された。この領域での部位特異的変異誘発により、Ｌｅｕ５５およびＬｅｕ５８がＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体形成に重要な役割を果たすが、ｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡへのＭａｚＥ結合にはそうではないことが明らかとなった。この結果は、ＭａｚＥが２つのドメイン（Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびＣ末端ＭａｚＦ相互作用ドメイン）から構成されることを証明する。
したがって、１つの実施形態では、本発明のＭａｚＥポリペプチドおよびＭａｚＥ機能的フラグメントはＭａｚＦ活性を阻害する。特定の態様では、本発明のＭａｚＥポリペプチドおよびＭａｚＥ機能的フラグメントはＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害するか、エンドリボヌクレアーゼ活性を減少させる。実際、ＭａｚＥおよびその機能的フラグメントは、本発明によって特徴づけられた第１の分子であり、エンドリボヌクレアーゼ活性を減少させることによってエンドリボヌクレアーゼ基質切断を減少させることができることが本明細書中で証明された。エンドリボヌクレアーゼ基質切断を減少させることができる例示的ＭａｚＥ機能的フラグメントには、Ｃ末端ＭａｚＦ相互作用ドメインが含まれるが、これに限定されない。特定の実施形態では、Ｃ末端ＭａｚＦ相互作用ドメインは、ＭａｚＥの残基３８から７５までの領域を含む。本明細書中に記載のように、この領域中で同定された重要な残基には、Ｌｅｕ５５およびＬｅｕ５８が含まれる。別の実施形態では、Ｃ末端ＭａｚＦ相互作用ドメインは、ＭａｚＥ分子のＨｐ−Ｂｏｘおよびその中で同定された重要な残基を含む。
本発明の特定の態様では、ＭａｚＥの２つのＣ末端ペプチド（一方は、Ｔ５４−Ｋ７７（２４アミノ酸残基；
配列番号９）および他方はＮ６０−Ｋ７７（１８アミノ酸残基；
配列番号１０）を使用する）を化学合成することができる。これらのペプチドは、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造に基づいて、ＭａｚＦ二量体と安定な阻害複合体を形成すると予想される。前者のペプチドはヘリックス２およびＣ末端酸性テールを含み、後者のペプチドはヘリックス２を欠く。これらのペプチドを、基質として合成３０塩基ＲＮＡ（
配列番号１１）を使用してＭａｚＦのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を阻害する能力について試験する。阻害活性を、コントロールとしてのインタクトなＭａｚＥと比較する。
別の実施形態では、本発明のＭａｚＥポリペプチドおよびＭａｚＥ機能的フラグメントは、ＭａｚＦ活性を増強または減少させる。特定の態様では、本発明のＭａｚＥポリペプチドおよびＭａｚＥ機能的フラグメントは、ＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼ活性を増強するか、エンドリボヌクレアーゼを減少させる。実際、ＭａｚＥポリペプチドの変異体およびその機能的フラグメントは、本発明のよってエンドリボヌクレアーゼ活性を増加させ、それによってエンドリボヌクレアーゼ基質切断を増加させることができると特徴づけられた第１の分子である。エンドリボヌクレアーゼ基質切断を増加させることができる例示的ＭａｚＥポリペプチドには、Ｃ末端ＭａｚＦ相互作用ドメイン、ＭａｚＥ残基３８〜７５の領域、Ｈｐ−ｂｏｘ、またはＬｅｕ５５またはＬｅｕ５８（またはその相同な位置）の変異（このような変異によってＭａｚＥのＭａｚＦに結合する能力が減少または阻害する）を含むＭａｚＥポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。エンドリボヌクレアーゼ基質切断を増加させることができる例示的ＭａｚＥフラグメントには、ＭａｚＥフラグメントのＭａｚＦに結合する能力を減少または阻害する変異を含むＭａｚＥフラグメントが含まれるが、これに限定されない。このような変異を含むこのようなＭａｚＥフラグメントには、Ｃ末端ＭａｚＥ相互作用ドメインまたはＭａｚＥの残基３８〜７５の領域が含まれるが、これらに限定されない。ＭａｚＥフラグメントのＭａｚＦに結合する能力を減少または阻害することが公知の残基中の例示的変異には、Ｌｅｕ５５およびＬｅｕ５８の変異が含まれる。このようなＭａｚＥ変異ポリペプチドおよびフラグメントを、本明細書中でドミナントネガティブ活性を有するという。一般に、ドミナントネガティブポリペプチドは、依然として基質および／または相互作用タンパク質もしくは分子に結合して競合するが、少なくとも部分的に野生型機能を失っているので、対応する野生型ポリペプチドの活性が減少または阻害するように作用する。
配列番号７によってコードされるＰｅｍＩポリペプチド、配列番号８を含むＰｅｍＩポリペプチドをコードする核酸配列およびその機能的フラグメント、ならびに配列番号８を含むＰｅｍＩポリペプチドおよびその機能的フラグメントが本発明に含まれる。本明細書中に記載のように、ＰｅｍＩポリペプチドおよびその機能的フラグメントは、ＰｅｍＫ活性を調節する能力を示す。ＰｅｍＫ活性（拡大してＰｅｍＫ活性）を調節することができ
る例示的ＰｅｍＩ機能的フラグメントには、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびＣ末端ＰｅｍＫ相互作用ドメインが含まれる。以下の実施例ＩＶを参照のこと。
したがって、１つの実施形態では、本発明のＰｅｍＩポリペプチドおよびＰｅｍＩ機能的フラグメントはＰｅｍＫ活性を阻害する。特定の態様では、本発明のＰｅｍＩポリペプチドおよびＰｅｍＩ機能的フラグメントはＰｅｍＫエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害するか、エンドリボヌクレアーゼ活性を減少させる。実際、ＰｅｍＩおよびその機能的フラグメントは、本発明によって特徴づけられた第１の分子であり、エンドリボヌクレアーゼ活性を減少させることによってエンドリボヌクレアーゼ基質切断を減少させることができることが本明細書中で証明された。
別の実施形態では、ＰｅｍＩ活性を阻害することができるＰｅｍＩポリペプチドまたはそのフラグメントの変異形態または誘導体を想定する。このようなＰｅｍＩ変異ポリペプチドおよびフラグメントを、本明細書中でドミナントネガティブ活性を有するという。一般に、ドミナントネガティブポリペプチドは、依然として基質および／または相互作用タンパク質もしくは分子に結合して競合するが、少なくとも部分的に野生型機能を失っているので、対応する野生型ポリペプチドの活性が減少または阻害するように作用する。ＰｅｍＩは通常ＰｅｍＫと結合してその毒作用を阻害するので、ＰｅｍＫのＰｅｍＩ媒介阻害の妨害はこの負の調節からＰｅｍＫを放出するように作用する。したがって、ＰｅｍＩ活性の阻害により、ＰｅｍＫ活性が増加する。
（Ｃ．ＭａｚＦ活性を調節することができる化合物の一般的な同定方法）
大腸菌染色体ＭａｚＥ／ＭａｚＦアディクションモジュールの構造は、１．７Åの分解能で決定されている（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，８７５−８８４（２００３））。本明細書中に記載のように、アディクションモジュールは、細菌の細胞死を支配する安定な毒素および不安定な解毒タンパク質からなる。ＭａｚＥ（解毒剤）およびＭａｚＦ（毒素）は、交互の毒素と解毒剤から構成される線状ヘテロ二量体（ＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２）を形成する。Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．は、ＭａｚＥホモ二量体は、２つが隣接するＭａｚＦホモ二量体と相互作用するＣ末端突起を伸長したβバレルを含むことを示している。このような相互作用は、プラスミドコード毒素ＣｃｄＢおよびＫｉｄの相互作用と類似する。ＭａｚＥ／ＭａｚＦヘテロ六量体構造は、解毒剤−毒素認識機構が染色体およびプラスミド保有アディクションモジュールに共通しており、毒素の機能、毒素の非存在下での解毒剤の分解、および解毒剤／毒素複合体によるプロモーターＤＮＡ結合を提供すると報告されている。
本明細書中に示した情報に基づいて、ＭａｚＥ中の適切なペプチド標的には、以下に列挙した残基および領域が含まれるが、これらに限定されない。ＭａｚＥ中の適切なペプチド標的には、Ｎ−ｂｏｘ（ＤＮＡ結合を媒介する残基７から１８までのＭａｚＥ中の高度に保存されたＮ末端領域）およびその中の重要な残基が含まれる。ＭａｚＥのＮ−ｂｏｘ中の重要な残基には、その変異がＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＤＮＡ結合活性を破壊する、Ｋ７Ａ、Ｒ８Ａ、Ｓ１２Ａ、およびＲ１６Ａが含まれる。Ｈｐ−Ｂｏｘ（疎水性残基が豊富な残基５３から６４までのＭａｚＥ中の保存Ｃ末端領域）もペプチドベースの治療のための適切な標的である。Ｈｐ−Ｂｏｘ領域は、ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の一見したところ最も安定な界面に関与する。Ｈｐ−Ｂｏｘ中の疎水性アミノ酸残基（Ｌｅｕ５５、Ｌｅｕ５８、Ｖａｌ５９、およびＩｌｅ６２）の側鎖は、ＭａｚＦホモ二量体中の疎水性残基のクラスターと相互作用する。
本明細書中に示した情報に基づいて、ＭａｚＦ中の適切なペプチド標的には、以下に列挙した残基および領域が含まれるが、これらに限定されない。ＭａｚＦ中の適切なペプチド標的には、Ｒ２９Ｓ、Ｎ４０Ｄ、Ｔ５２Ｋ、Ｑ７７Ｈ、Ｒ８６Ｇ、Ｉ１１０Ｎ、Ｅ２４Ａ、およびＫ７９Ａ残基ならびにこれらの重要な残基を含む小ペプチド（例えば、これらの残基およびその隣接残基を含む５〜１０残基のペプチド）が含まれる。
本発明の１つの実施形態では、２：４ ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体の結晶構造（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、その構造組成、およびＭａｚＥとＭａｚＦとの間で同定された界面を、コンピュータドッキング法によって高親和性で標的部位に結合する広範な化合物ライブラリーから候補化合物を同定しようとする仮想リガンドスクリーニング手順での標的として使用する。
別の実施形態では、ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体の構造情報（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、その構造組成、およびＭａｚＥとＭａｚＦとの間で同定された界面を使用して、ＭａｚＦおよび／またはＭａｚＥ／ＭａｚＦ界面に結合すると予想される化合物をデザインし、このような化合物を高親和性結合について試験する。
特定の実施形態では、ＭａｚＦのＲＮＡへの結合を調節する候補化合物および「デザインした化合物」を選択する。このような化合物は、ＭａｚＦのＲＮＡへの結合増強または阻害することができる。このような化合物は、同様に、基質（すなわち、ＲＮＡ）切断を増加または減少させることができる。次いで、ドッキング手順で最高を記録したいずれかのアプローチに由来するかこれらから得た化合物を、そのＭａｚＦ活性調節の有効性を決定するために細胞ベースおよび無細胞のアッセイ（下記）で試験する。
生物学的アッセイにおいて有効性を示す任意の化合物を、結合部位を同定するためにＭａｚＦと同時に結晶化することができる。本発明のさらなる実施形態では、固有の性質をさらに改良するために（例えば、有効性および／または特異性および／または可溶性を増加させるために）、ＭａｚＦに結合することができる候補化合物を、当該分野で公知の方法によって修飾する。最も望ましい特徴を示す選択された化合物をリード化合物と命名し、例えば、その有効性を測定するために、過剰増殖障害の動物モデルでさらに試験する。
（Ｄ．ＰｅｍＫ活性を調節することができる化合物の一般的同定方法）
本明細書中に示した情報に基づいて、ＰｅｍＩ中の適切なペプチド標的には、以下に列挙した残基および領域が含まれるが、これらに限定されない。ＰｅｍＩ中の適切なペプチド標的には、ポリペプチドのＰｅｍＩファミリーのメンバー間で保存されている領域が含まれる。
本明細書中に示した情報に基づいて、ＰｅｍＫ中の適切なペプチド標的には、以下に列挙した残基および領域が含まれるが、これらに限定されない。β鎖であるＳ１とＳ２との間の保存ループ（Ｓ１−Ｓ２ループと命名する）およびその中の残基は適切なペプチド標的である。保存領域のアミノ酸配列アラインメントおよびその中のアミノ酸配列については図３３および３４を参照のこと。
本発明の１つの実施形態では、２：４ ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体の結晶構造（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、その構造組成、およびＭａｚＥとＭａｚＦとの間で同定された界面を、ＰｅｍＩ／ＰｅｍＫ複合体の試験に適用することができる。したがって、このような推定を使用して、コンピュータドッキング法により、高親和性で標的部位に結合する広範な化合物ライブラリーから候補化合物を同定しようとする仮想リガンドスクリーニング手順で標的を同定することができる。
別の実施形態では、ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体の構造情報（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、その構造組成、およびＭａｚＥとＭａｚＦとの間で同定された界面を、ＰｅｍＩ／ＰｅｍＫ複合体の試験に適用することができる。このような推定を使用して、ＭａｚＫおよび／またはＭａｚＩ／ＭａｚＫ界面に結合すると予想される化合物をデザインし、このような化合物を高親和性結合について試験することができる。
特定の実施形態では、ＰｅｍＫのＲＮＡへの結合を調節する候補化合物および「デザインした化合物」を選択する。このような化合物は、ＰｅｍＫのＲＮＡへの結合増強または阻害することができる。このような化合物は、同様に、基質（すなわち、ＲＮＡ）切断を増加または減少させることができる。次いで、ドッキング手順で最高を記録したいずれかのアプローチに由来するかこれらから得た化合物を、そのＰｅｍＫ活性調節の有効性を決定するために細胞ベースおよび無細胞のアッセイ（下記）で試験する。
生物学的アッセイにおいて有効性を示す任意の化合物を、結合部位を同定するためにＰｅｍＫと同時に結晶化することができる。本発明のさらなる実施形態では、固有の性質をさらに改良するために（例えば、有効性および／または特異性および／または可溶性を増加させるために）、ＰｅｍＫに結合することができる候補化合物を、当該分野で公知の方法によって修飾する。最も望ましい特徴を示す選択された化合物をリード化合物と命名し、例えば、その有効性を測定するために、過剰増殖障害の動物モデルでさらに試験する。
（フレキシブルドッキングテクノロジーによる仮想リガンドスクリーニング）
現在のドッキングおよびスクリーニング法は、特定のタンパク質構造を使用して巨大な化合物ライブラリーからリードの可能性が高い候補化合物の小集団を選択することができる。このような方法は、例えば、Ａｂａｇｙａｎ ａｎｄ Ｔｏｔｒｏｖ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３７５−３８２（特にその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
高処理フレキシブルドッキングに基づいた仮想リガンドスクリーニング（ＶＬＳ）は、特定のタンパク質構造に結合することができる化合物のデザインおよび同定に有用である。ＶＬＳを使用して、それぞれを合成および実験する異なる多数の化学的分子を仮想的にサンプリングすることができる。一般に、この方法は、従来の手段（例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、ホモロジーモデリング）由来の選択されたペプチド構造を使用するポリペプチドモデリングから開始する。次いで、化合物および／または分子フラグメント組を、既存のドッキングプログラム（例えば、ＭＣＤＯＣＫ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１３：４３５−４５１）、ＳＥＥＤ（Ｍａｊｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３７：８８−１０５；ＤＡＲＷＩＮ（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：１７３−１９１；ＭＭ（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１５：１５７−１７１など）の任意の１つを使用して選択した結合部位にドッキングする。化合物をリガンドとしてスコアリングし、さらなるインビトロおよびインビボ試験および／または化学修飾のために、最も高い結合親和性を保有すると予想される候補化合物のリストを作成する。
ＶＬＳの１つのアプローチでは、化学的生成の前に化合物を選択された結合ポケットに「嵌め込む」。リガンドを原子単位（例えば、ＧＥＮＳＴＡＲ（Ｐｅａｒｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌ（１９９３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１４：１１８４）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２９２１−２９２８）、ＭＣＤＮＬＧ（Ｒｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．７：２３−４３）、ＣＯＮＣＥＰＴＳ（Ｇｅｈｌｈａａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３８：４６６−４７２を参照のこと）またはフラグメント単位（例えば、ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（Ｒｏｔｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００−１７１０）、ＳＰＲＯＵＴ（Ｇｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．７：１２７−１５３）、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ（１９９２）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．６：６１−７８）、ＢＵＩＬＤＥＲ（Ｒｏｅ（１９９５）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．９：２６９−２８２）、およびＳＭＯＧ（ＤｅＷｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１１７３３−１１７４４を参照のこと）で「成長させる」ための多数のプログラムがデザインされている。
タンパク質構造に結合することができる少数の分子と多数の非結合剤とを区別する特定のタンパク質のスコアリング方法が公知である。仮想リガンドドッキングおよびスクリーニング法によって同定した首尾の良いリガンド数の増加についての報告については、例えば、Ａｇａｇｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａを参照のこと。
例えば、Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３６：２９２１−２９２８は、分子（ジヒドロ葉酸還元酵素）の活性部位の三次元構造に基づいて阻害分子を作製する構造構築プログラムの能力を記載している。プログラムは、酵素の４つの公知のインヒビターに対する類似の構造を有する分子を予想することができ、それにより、標的の三次元構造の知識を使用して新規のリード化合物を得ることができることが強く支持される。同様に、Ｇｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ７：１２７−１５３は、立体障害に基づいた人工知能技術による構造の作成（ＳＰＲＯＵＴ）を記載している。
（本発明のスクリーニング方法によって同定された薬剤）
本発明は、高親和性でｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）またはｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビター（例えば、ＭａｚＥまたはＰｅｍＩ）と結合する薬剤（例えば、候補化合物または試験化合物）の同定方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって同定された薬剤は、候補抗過剰増殖障害治療薬および抗細菌治療薬として有用である。
薬剤、候補化合物、または試験化合物の例には、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、および他の薬物が含まれるが、これらに限定されない。当該分野で公知の組合わせライブラリー法での任意の多数のアプローチ（生物ライブラリー；空間的に指定可能な並列固相または液相ライブラリー；解析が必要な合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィ選択を使用した合成ライブラリー法が含まれる）を使用して、薬剤を得ることができる。生物ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方で、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５；米国特許第５，７３８，９９６号；および米国特許第５，８０７，６８３号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される））。
分子ライブラリーの合成方法の例を、当該分野で見出すことができる（例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；ａｎｄ Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される））。
化合物のライブラリーを、例えば、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；おおび同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；および Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）に存在し得る。
（スクリーニングアッセイ）
上記仮想リガンドドッキングおよびスクリーニング方法によって同定した小分子を、インビトロおよびインビボアッセイでさらに試験する。１つの実施形態では、ｍＲＮＡインターフェラーゼ（ＭａｚＦおよびＰｅｍＫ）またはｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビター（ＭａｚＥまたはＰｅｍＩなど）と相互作用する（すなわち、結合する）薬剤を、細胞ベースのアッセイ系で同定する。明確および簡潔にするために、これらのアッセイの残りを、ＭａｚＦおよびＭａｚＦフラグメントに関して記載するが、このようなアッセイ／方法を他のｍＲＮＡインターフェラーゼおよびそのフラグメント（ＭａｚＥおよびＭａｚＥフラグメント、ＰｅｍＫおよびＰｅｍＫフラグメント、ならびにＰｅｍＩおよびＰｅｍＩフラグメントなど）にも適用することができると理解すべきである。
この実施形態によれば、ＭａｚＦまたはその機能的フラグメントを発現する細胞を候補化合物またはコントロール化合物と接触させ、候補化合物のＭａｚＦと相互作用する能力を決定する。所望ならば、このアッセイを使用して、複数（例えば、ライブラリー）の候補化合物をスクリーニングすることができる。例えば、細胞は、原核生物起源（例えば、大腸菌）または真核生物起源（例えば、酵母または哺乳動物）であり得る。さらに、細胞は、ＭａｚＦまたはそのフラグメントを内因的に発現することができるか、ＭａｚＦまたはＭａｚＦフラグメントを発現するように遺伝子操作することができる。一定の例では、ＭａｚＦと候補化合物との間の相互作用を検出することができるようにするために、ＭａｚＦまたはＭａｚＦフラグメントを、例えば、放射性標識（３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）または蛍光標識（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、またはフルオレサミンなど）で標識する。候補化合物のＭａｚＦへの結合能力を、当業者に公知の方法によって決定することができる。例えば、候補化合物とＭａｚＦとの間の相互作用を、フローサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈降、またはウェスタンブロット分析によって決定することができる。
別の実施形態では、ＭａｚＦまたはその関連フラグメントと相互作用する（すなわち、結合する）薬剤を無細胞アッセイ系で同定する。この実施形態によれば、天然または組換えＭａｚＦまたはそのフラグメントを候補化合物またはコントロール化合物と接触させ、候補化合物のＭａｚＦと相互作用する能力を決定する。所望ならば、このアッセイを使用して、複数の候補化合物をスクリーニングすることができる。１つの実施形態では、例えば、特異的に認識して結合する固定化抗体との接触またはＭａｚＦまたはそのフラグメントの精製調製物とタンパク質に結合するようにデザインした表面との接触によってＭａｚＦまたはそのフラグメントを最初に固定する。ＭａｚＦまたはそのフラグメントを部分的あまたは完全に精製することができるか（例えば、他のポリペプチドを部分的または完全に含まない）、細胞溶解物の一部であり得る。さらに、ＭａｚＦまたはそのフラグメントは、ＭａｚＦまたはその生物活性部分を含む融合タンパク質およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのドメインであり得る。あるいは、ＭａｚＦまたはそのフラグメントを、当業者に周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してビオチン化することができる。候補化合物のＭａｚＦと相補作用する能力を、当業者に周知の方法によって決定することができる。
別の実施形態では、動物モデルにおいてＭａｚＦ活性を調節する薬剤を同定する。適切な動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ、およびネコが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、使用した動物は、過剰増殖障害モデルを示す。この実施形態によれば、試験化合物またはコントロール化合物を適切な動物に投与し（例えば、経口、直腸、または腹腔内もしくは静脈内などの非経口）、活性レベルに対する効果を決定する。
（Ｅ．ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはｍＲＮＡインターフェラーゼインヒビターに結合することができる薬剤の治療における使用）
本発明は、上記方法によって同定された治療化合物の投与による過剰増殖障害の治療「を提供する。このような化合物には、タンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの誘導体またはアナログ、抗体、核酸、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明によって同定された有効量の化合物を被験体に投与する工程を含む、過剰増殖障害を罹患した患者の治療方法を提供する。好ましい態様では、化合物は実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するか望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は、好ましくは、動物（ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどが含まれるが、これらに限定されない）であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物が被験体である。
化合物が核酸を含む場合に使用することができる処方物および投与方法を上に記載し、さらなる適切な処方物および投与経路を以下に記載する。
種々の送達系（例えば、リポソーム中へのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、およびレトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物）が公知であり、これを使用して本発明の化合物を投与することができる。移入方法は、経腸または非経口であり、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物を、任意の都合の良い経路（例えば、注入またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜上皮（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および調粘膜など））によって投与することができ、他の生物活性薬とともに投与することができる。投与は全身または局所であり得る。さらに、本発明の薬学的組成物を任意の適切な経路（脳室内注射およびクモ膜下注射が含まれる）によって中枢神経系に移入することが望ましく、Ｏｍｍａｙａリザーバなどに取りつけた脳室内カテーテルによって脳室内注射を容易にすることができる。例えば、吸入器またはネブライザーおよびエアゾール化された薬剤の使用によって肺投与を使用することもできる。
特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を、局所（例えば、手術時の局所注入）、局所適用（例えば、注射、カテーテル手段、またはインプラント手段（インプラントは多孔質、非多孔質、またはゲル状材料であり、シアラスティック膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）またはファイバーが含まれる））で投与することが望ましい。１つの実施形態では、投与は、ＣＳＦまたは腫瘍部位（例えば、ＣＮＳ組織）への直接注射であり得る。
別の実施形態では、化合物を小胞（特に、リポソーム）で送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ
ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７（一般に同章を参照のこと）を参照のこと）。
さらに別の実施形態では、化合物を制御放出系で送達させることができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。さらに別の実施形態では、治療標的（すなわち、標的組織または腫瘍）付近に制御放出系を配置することができるので、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）に概説されている。
（Ｆ．薬学的組成物）
本発明はまた、薬学的組成物も提供する。このような組成物は、治療有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容可能な」は、動物、より詳細にはヒトへの使用について連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または賦形薬をいう。このような薬学的キャリアは、水およびオイルなどの滅菌液体（石油、動物油、植物油、または合成油（ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、およびゴマ油など）が含まれる）であり得る。薬学的組成物を静脈内に投与する場合、水は好ましいキャリアである。生理食塩水および水性デキストランおよびグリセロール溶液を、特に注射液のための液体キャリアとして使用することもできる。
適切な薬学的賦形剤には、デンプン、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれる。所望ならば、組成物はまた、少量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、
丸薬、カプセル、粉末、および徐放性処方物などの形態を取ることができる。組成物を、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのキャリアと共に座剤として処方することができる。経口処方物には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なキャリアが含まれる。適切な薬学的キャリアの例は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（その全
体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。このような組成物は、被験体への適切な投与形態を得るための適量のキャリアと共に好ましくは精製形態の有効量の化合物を含む。処方は、投与様式に適合させるべきである。
好ましい実施形態では、日常的手順にしたがってヒトへの静脈内投与に適合させた薬学的組成物として組成物を処方する。典型的には、静脈内投与のための組成物は、溶液を含む滅菌等張水性緩衝液を含み得る。必要に応じて、組成物は、可溶化剤および注射部位の痛みを緩和するためのリドカインなどの局所麻酔も含み得る。一般に、成分を個別または単位投薬形態中に共に混合して（例えば、活性成分の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封コンテナ中に凍結乾燥粉末または無水濃縮物として）供給する。組成物を注入によって投与すべき場合、医薬品グレードの滅菌水または滅菌生理食塩水を含む注入ボトルに分注することができる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合物ことができるような注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明の化合物を、中性または塩形態として処方することができる。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来の遊離アミノ基を使用して形成された塩および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来の遊離カルボン酸を使用して形成された塩が含まれる。
過剰増殖障害（例えば、癌）の治療で有効な本発明の化合物の量を、本説明に基づいた標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、任意選択的にインビトロアッセイを使用して、眼科投薬範囲の同定を補助することができる。処方物中での正確な使用量は、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、実施者の判断および各被験体の環境にしたがって決定すべきである。しかし、静脈内投与に適切な投薬範囲は、一般に、約２０〜５００μｇの活性化合物／ｋｇ／体重である。鼻腔内投与に適切な投薬範囲は、一般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ／体重〜１ｍｇ／ｋｇ／体重である。座剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲の有効成分を含み、経口処方物は、好ましくは、１０％〜９５％の有効成分を含む。インビトロまたは動物モデル試験系由来の用量応答曲線から有効用量を推定することができる。
（核酸）
本発明は、ｍＲＮＡインターフェラーゼのリボエンドヌクレアーゼ活性を増加させるためのｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＭａｚＦまたはＰｅｍＫ）に結合することができる薬剤の同定方法を提供する。したがって、本発明は、ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはそのオルソログのペプチドまたはタンパク質アクチベーターをコードする核酸配列ならびにｍＲＮＡインターフェラーゼの内因性インヒビター（ＭａｚＥまたはＰｅｍＩ）またはそのオルソログの発現を妨害することができるアンチセンス配列または触媒ＲＮＡの投与を含む。
１つの実施形態では、ｍＲＮＡインターフェラーゼに競合的に結合することができるペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む核酸を投与する。当該分野で利用可能な核酸配列の任意の適切な投与方法を本発明にしたがって使用することができる。
核酸配列の投与および発現方法は、一般に、遺伝子治療領域で公知である。遺伝子治療方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５を参照のこと。本発明で使用することができる組換えＤＮＡテクノロジー分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｌｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；ａｎｄ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに記載されている。
特定の態様では、化合物は、ｍＲＮＡインターフェラーゼのリボエンドヌクレアーゼ活性を増加させるためにｍＲＮＡインターフェラーゼに結合することができるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含み、このような核酸は適切な宿主中でペプチドまたはたタンパク質を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、コード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有し、誘導性または構成性（任意選択的に、組織特異的）である。別の特定の実施形態では、ゲノム中のコード配列および任意の他の所望の部位がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接する核酸分子を使用する（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
被験体への核酸の送達は直接であってよく、その場合、被験体を核酸または核酸保有ベクターに直接曝露し、このアプローチはインビボ遺伝子治療として公知である。あるいは、被験体への核酸の送達は間接的であってよく、その場合、最初に細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸で形質転換してその後に被験体に移植し、これは「ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療」として公知である。
別の実施形態では、コードされた産物を産生するように発現する核酸をインビボで直接投与する。当該分野で公知の任意の多数の方法（例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内となるようにこれを投与すること（例えば、欠損または弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用した乾癬）（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと；裸のＤＮＡの直接注射；微粒子銃の使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）；脂質、細胞表面受容体、またはトランスフェクション剤でのコーティング；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルへのカプセル化；核に侵入することが公知のペプチドへの投与；または特異的に受容体を発現する細胞型をターゲティングするために使用することができる受容体媒介性エンドサイトーシスに供されるリガンドへの投与（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）））によってこれを行うことができる。
別の実施形態では、リガンドが核酸のリソソーム分解を回避するエンドソームを破壊するための膜融合ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、特定の受容体のターゲティングによって、細胞特異的取り込みおよび発現のために核酸をインビボでターゲティングすることができる（例えば、１９９２年４月１６日付けのＰＣＴ 公開ＷＯ９２／０６１８０（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．）；１９
９２年１２月２３日付けのＷＯ９２／２２６３５（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）；１９９２年１１月２６日付けのＷ０９２／２０３１６（Ｆｉｎｄｅｉｓ ｅｔ ａｌ．）；１９９３年７月２２日付けのＷ０９３／１４１８８（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年１０月１４日付けのＷＯ ９３／２０２２１（Ｙｏｕｎｇ）を参照のこと）。あるいは、相同組換えによって核酸を細胞内に移入し、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
さらなる実施形態では、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターを、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主ＤＮＡへの組み込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するように修飾した。遺伝子治療で使用すべきｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸を、被験体への遺伝子の送達を促進するベクターにクローン化する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、幹細胞を化学療法に対してより耐性を持たせるためにｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達させるためのレトロウイルスベクターの使用を記載しているＢｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２に見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示した他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４である。
アデノウイルスを遺伝子治療で有効に使用することもできる。アデノウイルスは、特に、気道上皮への遺伝子送達のための魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染して軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３は、アデノウイルスベースの遺伝子治療を示す。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルス使用の他の例を、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４；ＰＣＴ ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＷＯ９４／１２６４９；およびＷａｎｇ，ｅｔａｌ：（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３で見出すことができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子治療での使用が提案されている（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４３６，１４６）。
遺伝子治療への別の適切なアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法による組織培養中の細胞への遺伝子の導入を含む。通常、導入方法は、細胞への選択マーカーの導入を含む。次いで、取り込まれたて導入遺伝子を発現する細胞を単離するために細胞を選択下におく。次いで、これらの細胞を被験体に送達させる。
この実施形態では、得られた組換え細胞のインビボ投与前に核酸を細胞に移入する。当該分野で公知の任意の方法（トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージでの感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが含まれるが、これらに限定されない）によって、このような移入を行うことができる。細胞への外来遺伝子の移入のための多数の技術が当該分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照のこと）、レシピエント細胞に必要な発生および生理学的機能が破壊されない場合、本発明にしたがって使用することができる。この技術により核酸配列が細胞に安定に導入され、その結果細胞が核酸を発現することができ、好ましくは、その細胞の子孫に受け継がれて発現することができる。
当該分野で公知の種々の方法によって、得られた組換え細胞を被験体に送達することができる。好ましい実施形態では、上皮細胞を、例えば、皮下注射する。別の実施形態では、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として被験体に適用することができ、組換え血球（例えば、造血間細胞または前駆細胞）を好ましくは静脈内投与する。想定した細胞の使用量は、所望の効果、被験体の健康状態などに依存し、当業者が決定することができる。
遺伝子治療の目的のために核酸を移入することができる細胞は、任意の所望の適用可能な細胞型を含み、神経細胞、膠細胞（例えば、神経細胞、膠細胞（例えば、乏突起膠細胞または星状細胞）、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血球；例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、または胎児の肝臓から得えた種々の幹細胞または前駆細胞）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は、治療をうける被験体の自己のものである。
別の実施形態では、遺伝子治療のために移入すべき核酸は、核酸が適切な転写インデューサー濃度の調節によって調節可能であるようにコード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含み得る。
例えば、米国特許第５，５８９，４６６号に記載の技術にしたがって、ｍＲＮＡインターフェラーゼまたはｍＲＮＡインターフェラーゼの内因性インヒビター（例えば、ＭａｚＥ、ＰｅｍＩ、またはそのオルソログ）の発現を妨害することができる薬剤に結合することができるペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡの直接注射を行うこともできる。これらの技術は、適切なキャリアに加えて、リポソーム、細胞、または任意の他の材料の非存在下での「裸のＤＮＡ」（すなわち、単離ＤＮＡ分子）の注射を含む。適切なプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡの注射によって、注射部位付近の細胞中でタンパク質が産生される。
（Ｇ．キット）
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つまたは複数の成分で満たした１つまたは複数のコンテナを含む薬学的パックまたはキットを提供する。任意選択的に、このようなコンテナは、（ａ）機関によるヒト投与のための製造、使用、または販売の承認、（ｂ）使用説明書、またはその両方を反映した、医薬品または生物製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された様式での通知書を同封することができる。
以下の実施例は、当業者に提供するために記載し、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法の作製および使用を完全に開示および説明するが、本発明者らが発明と見なす範囲を制限することを意図しない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確であるように努めたが、実験誤差および偏差がいくらか存在するはずである。他で記載しない限り、単位は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
本発明の実施を容易にするために、以下のプロトコールを提供する。
（実施例Ｉ）
本明細書中に記載するように、トルエン処理によって透過処理した大腸菌を使用して、ＭａｚＦは翻訳を阻害するが、ＲＮＡ合成やＤＮＡ複製を阻害しないことを証明した。さらに、ＭａｚＦは、リボゾームに無関係の様式でＡＣＡ配列のＡとＣとの間でｍＲＮＡを特異的に切断することを示した。したがって、本発明は、ＭａｚＦが特定の部位での切断によってｍＲＮＡを妨害することを証明する。したがって、本発明者らは、ＭａｚＦは新規のエンドリボヌクレアーゼであることを発見し、これを本明細書中で「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と命名した。
（材料および方法）
（株およびプラスミド）
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＷ２５１１３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，６６４０−５（２０００））、およびＭＲＥ６００（Ｓｗａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４２，３２５１−５（１９９８））を使用した。プラスミドｐＥＴ−２１ｃｃ−ＭａｚＥＦを、Ｔ７プロモーターの調節下でＭａｚＥおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を発現するように修飾したｐＥＴ−２１ｃｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）から構築した。しかし、シャイン−ダルカルノ（ＳＤ）配列は、ｍａｚＥＦオペロンに由来していた。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥを発現させるためにｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、プラスミドｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＥを構築した。アラビノース（０．２%）添加後のＭａｚＦ発現を強く調節するために、ｐＢＡＤ（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７，４１２１−３０（１９９５））を使用してｐＢＡＤ−ＭａｚＦを構築した。
（トルエン処理細胞中のタンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡ合成のアッセイ）
ｐＢＡＤ−ＭａｚＦプラスミドを含む５０ｍｌの大腸菌ＢＷ２５１１３の培養物を、グリセロール−Ｍ９培地中にて３７℃で成長させた。培地のＯＤ６００が０．６に到達した場合、最終濃度０．２％のアラビノースを添加した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、細胞を１％トルエンで処理した（Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９，１６３−７（１９７６））。トルエン処理細胞を使用し、以前に記載のように３５Ｓ−メチオニンを使用してタンパク質合成を行った（Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １２６，１８３−９１（１９７６））。トルエン処理細胞を、室温にて０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、同一の緩衝液に再懸濁し、以前に記載のように［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰを使用してＤＮＡ合成を試験した（Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６７，６７４−８１（１９７０））。ＲＮＡ合成のアッセイのために、トルエン処理細胞を室温にて０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）で１回洗浄し、同一の緩衝液に再懸濁し、以前に記載のようにＲＮＡへの［α−３２Ｐ］ＵＴＰ組み込みを測定した（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０７，５８５−８（１９７１））。
（インビボタンパク質合成アッセイ）
ｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞を、グリセロール−Ｍ９培地中にて３７℃で成長させた。培地のＯＤ６００が０．６に到達した場合、培養物を２等分した。第１の部分に最終濃度０．２％のアラビノースを添加し、第２の部分に水を添加した。図２Ｄに示す異なる時間間隔後、１ｍｌの培養物を２μＣｉの３５Ｓ−メチオニンを含む試験管に移し、混合物を３７℃で１分間インキュベートした。次いで、５０μｌの反応混合物を濾紙ディスク（Ｗｈａｔｍａｎ ３ｍｍ、直径２．３ｃｍ）にアプライした。以前に記載のように濾紙を５％ＴＣＡ溶液で処理し（Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２４２，４０５−７（１９７３））、液体シンチレーションカウンターを使用して放射能を定量した。残りの５００μｌの反応混合物を、２５μｌの１００％ＴＣＡ溶液および１００μｇ／ｍｌの非放射性メチオニンを含む冷却試験管に入れた。混合物を氷中で６０分間インキュベートした。遠心分離後にペレットを回収し、混合物をボイルした水浴中での３０分間のインキュベーションによって５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に溶解した。不溶物の除去後、上清（１０μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
（ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥタンパク質の精製）
Ｃ末端をタグ化したＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を、ＥＴ−２１ｃｃ−ＭａｚＥＦを保有するＢＬ２１株（ＤＥ３）から精製した。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６とＭａｚＥとの複合体を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂にて最初に精製した。６Ｍ塩酸グアニジン中のＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６からのＭａｚＥの分離後、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６をＮｉ−ＮＴＡ樹脂で再精製し、段階的透析によって再折りたたみを行った。Ｎ末端をタグ化した（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥを、ｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＥを保有するＢＬ２１株（ＤＥ３）から精製した。
（原核細胞系および真核細胞系におけるタンパク質合成に対するＭａｚＦの効果）
大腸菌Ｔ７Ｓ３０抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して無原核細胞タンパク質合成を行った。反応混合物は、１０μｌのＳ３０プレミックス、７．５μｌのＳ３０抽出物および２．５μｌのアミノ酸混合物（１ｍＭメチオニン以外の全ての各アミノ酸）、１μｌの３５Ｓ−メチオニン、および異なる量のＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（最終体積２４μｌ）からなる。反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、１μｌのｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧプラスミド−ＤＮＡ（０．１６μｇ／μｌ）の添加によってアッセイを開始した（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １８４，５３２３−９（２００２））。３７℃で１時間反応させ、タンパク質をアセトンで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ウサギ網状赤血球溶解物系ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、無真核細胞タンパク質合成を行った。Ｔ７プロモーターの調節下でヒトタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ｍＲＮＡ転写のテンプレートとして使用した。３７℃で１時間反応させ、タンパク質をアセトンで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
（ポリソームプロフィール）
ｐＢＡＤ−ＭａｚＦプラスミドを含む大腸菌ＢＷ２５１１３の一晩の培養物を、新鮮なグリセロール−Ｍ９培地で５０倍に希釈した。３７℃で５時間のインキュベーション後、最終濃度０．２％のアラビノースを添加した。ＭａｚＦを１０分間インキュベートした後、最終濃度１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した。遠心分離後に細胞ペレットを回収し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に再懸濁した。液体窒素を使用した２回の凍結融解後、溶解物を、ＢｅｃｋｍａｎＴＬＡ１００．３ローターにて２４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ポリソームプロファイリングのために、上清（３００μｌ）を、５〜４０％のスクロース勾配にロードした。アラビノースを添加しないで類似の実験を行った。ＯＤ２８０によってリボゾームパターンを検出し、左（４０％）から右（５％）に勾配を持たせた。表示されている場合、最終濃度５００μｇ／ｍｌのカスガマイシンを添加した。
（大腸菌７０Ｓリボゾームの調製）
わずかに修正しているが以前に記載のように、大腸菌ＭＲＥ６００から７０Ｓリボゾームを調製した（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４６，１０８０−５（２００２）；Ｄｕ ａｎｄ Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，２０４９４−５０３（１９９８）；Ｈｅｓｔｅｒｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，２１８６５− ７１（１９９７））。細菌細胞（２ｇ）を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、および６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））に懸濁した。フレンチプレスを使用して細胞を溶解した。無ＲＮアーゼＤＮアーゼとのインキュベーション後（０℃で３０分間）、細胞残屑を、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターにおける２ラウンドの４℃、３０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって除去した。次いで、上清（上部から３／４）を、同体積の１．１Ｍスクロースを含む緩衝液Ｂ（０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌを含む緩衝液Ａ）上に重層し、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターにて、４℃、４５，０００ｒｐｍで１５時間遠心分離した。緩衝液Ａでの洗浄後、リボソームペレットを緩衝液Ａ中に再懸濁し、緩衝液Ａ中に調製した１０〜３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロース直線勾配にアプライし、ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４０Ｔｉローターにて４℃、２０，０００ｒｐｍで１５時間遠心分離した。勾配を分画し、７０Ｓリボゾーム画分をプールし、Ｂｅｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターにて、４℃、４５，０００ｒｐｍで２０時間ペレット化した。７０Ｓリボゾームペレットを緩衝液Ａに再懸濁し、−８０℃で保存した。
（プライマー伸長阻害（トゥープリンティング）アッセイ）
少し修正したが、以前に記載の用のトゥープリンティングを行った（Ｍｏｌｌ ａｎｄ
Ｂｌａｓｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｌｚｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９７，１０２１−１０２６（２００２））。ｍａｚＧｍＲＮＡおよびｍａｚＧｍＲＮＡの塩基６５〜８５に相補的な３２Ｐ末端標識ＤＮＡプライマーを含むプライマー−テンプレートアニーリングのための混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、室温にゆっくり冷却した。リボゾーム結合混合物は、２μｌの１０×緩衝液（１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、６００ｍＭ ＮＨ４Ｃ１、および１０ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８））、異なる量のＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６、０．３７５ ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ ７０Ｓリボゾームサブユニット、２．５μＭ ｔＲＮＡｆＭｅｔ、および２μｌのアニーリング混合物（最終体積２０μｌ）を含んでいた。最終ｍＲＮＡ濃度は、０．０５μＭであった。このリボゾーム結合混合物を、３７℃で１０分間インキュベートし、逆転写酵素（２Ｕ）を添加した。３７℃で１５分間ｃＤＮＡ合成を行った。１２μｌの配列決定ローディング緩衝液の添加によって反応を停止させた。サンプルを９０℃で５分間インキュベートし、その後に６％ポリアクリルアミド配列決定ゲルで電気泳動を行った。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、Ｔ７プロモーターを含む１７３ｂｐのＤＮＡフラグメントからｍａｚＧｍＲＮＡをインビトロで合成した。ＤＮＡテンプレートとしてｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧプラスミドを使用したＰＣＲ増幅によって、Ｔ７プロモーターおよび＋１〜＋１５３のｍａｚＧｍＲＮＡからなるＤＮＡフラグメントを得た。
（フェノール抽出後のｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティング）
７０ＳリボゾームおよびｔＲＮＡｆＭｅｔを省略すること以外は上記と同一の方法で実験を行った。プライマー伸長前にタンパク質を除去するために反応混合物をフェノール抽出を行った。
（変異プラスミドの構築）
ＤＮＡテンプレートとしてｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧプラスミドを使用して、部位特異的変異誘発を行った。ＤＮＡ配列分析によって変異を確認した。
（ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析）
ｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３を、グリセロール−Ｍ９培地にて３７℃で成長させた。ＯＤ６００値が０．８に到達した場合、最終濃度０．２％のアラビノースを添加した。図４Ｄに示すように、異なる間隔でサンプルを取り出した。以前に記載のように、ホットフェノール法を使用して総ＲＮＡを単離した（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３２，１３３７−４６（１９８３））。以前に記載のように、ノーザンブロット分析を行った（Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｋｉｅ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７，７５−８８（２００３））。
（図面に関する特定の方法の詳細）
図１Ａに示すように、ＭａｚＦ発現は、細胞に有毒である。大腸菌ＢＷ２５１１３（ΔａｒａＢＡＤ）細胞を、ｐＢＡＤ−ＭａｚＦ、ｐＢＡＤ−ＭａｚＦ Ｒ２９Ｓ、またはｐＢＡＤ−ＭａｚＦ Ｒ８６Ｇプラスミドでそれぞれ形質転換した。細胞をアラビノース（０．２％）を含むか含まないグリセロール−Ｍ９培地に広げ、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。図１Ｂは、大腸菌（ＮＰ＿２８９３３６．１）のＭａｚＦとバチルス・ハロデュランス（ＮＰ＿２４４５８８．１）、表皮ブドウ球菌（ＡＡＧ２３８０９．１）、黄色ブドウ球菌（ＮＰ＿３７２５９２．１）、枯草菌（１ＮＥ８＿Ａ）、髄膜炎菌（ＮＰ＿２６６０４０．１）、モルガネラ・モルガニイ（ＡＡＣ８２５１６．１）、および結核菌（ＮＰ＿２１７３１７．１）のＭａｚＦの配列アラインメントを示す。
図２Ａは、トルエン処理細胞への３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込みに対するＭａｚＦ発現の効果を示す。詳細には、ｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３の培養物を、グリセロール−Ｍ９培地中にて３７℃で成長させた。培地のＯＤ６００が０．６に到達した場合、最終濃度０．２％のアラビノースを添加した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、細胞をトルエンで処理した（Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １２６，１８３−９１（１９７６））。トルエン処理細胞を使用し、以前に記載のように ３５ Ｓ−メチオニンを使用してタンパク質合成を行った（Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９，１６３−７（１９７６））。図２Ｂは、トルエン処理細胞への［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰ組み込みに対するＭａｚＦの効果を示す（Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ６７，６７４−８１（１９７０））。図２Ｃは、トルエン処理細胞への［α−３２Ｐ］ｄＵＴＰ組み込みに対するＭａｚＦの効果を示す（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０７，５８５−８（１９７１））。図２Ｄは、インビボでの３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込みに対するＭａｚＦの効果を示す。表示のＭａｚＦ誘導後の種々の測定点でのｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３への３５Ｓ−Ｍｅｔの組み込みを測定した。図２Ｅは、ＭａｚＦ誘導後のインビボタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図２Ｅで使用した培養物は、図２Ｄで示したものと同一である。
図３Ａは、ポリソームプロフィールに対するＭａｚＦの効果を示す。ＯＤ２６０によってリボゾームパターンを検出し、左（４０％）から右（５％）に勾配を持たせた。７０Ｓ、５０Ｓ、および３０Ｓリボゾームの位置を示す。図３Ｂは、大腸菌Ｔ７Ｓ３０抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した無原核細胞タンパク質合成に対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の効果を例示する。レーンＣ、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし；レーン１〜５：７７、１５４、２３１、３０８、および３８４ｎＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６をそれぞれ添加；レーン６〜１０、３８４ｎＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６およびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６に対する（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの比がそれぞれ０．１、０．２、０．４、０．８、および１．２である。図３Ｃは、ウサギ網状赤血球系ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した無真核細胞タンパク質合成に対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の効果を示す。レーン１、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし；レーン２、０．６６μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６；レーン３、０．９μＭ（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよび０．６６μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６に対する（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの比は１．２：１である。
図４Ａは、ＭａｚＦの存在下でのｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティングを示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、Ｔ７プロモーターを含む１７３ｂｐのＤＮＡフラグメントからｍＲＮＡをインビトロで合成した。ＤＮＡフラグメント（Ｔ７プロモーターおよび＋１〜＋１５３のｍａｚＧｍＲＮＡ）を、ｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧプラスミドＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅によって得た。レーン１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン２、２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン３、０．５μＭ ７０ＳリボゾームおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし、およびレーン４〜８、０．５μＭ ７０Ｓリボゾームおよび０．３５μＭ、０．７μＭ、１．４μＭ、２．１μＭ、および２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６。図４Ｂは、フェノール抽出後のｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティングを示す。プライマー伸長前にタンパク質を除去するために反応生成物をフェノール抽出すること以外は図４Ａのレーン１およびレーン２と同一の様式で実験を行った。レーン１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし；レーン２、２．６μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６。図４Ｃは、ｍａｚＧｍＲＮＡのＭａｚＦ切断に対するＭａｚＥの効果を例示する。レーン１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥなし；レーン２、８．８μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ；レーン３、２．２μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６；レーン４〜７、２．２μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６およびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６に対する（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの比がそれぞれ０．２５、０．４、０．８、および１．０。図４Ｄは、インビボでの細胞ｍＲＮＡに対するＭａｚＦの効果を示す。アラビノース添加後の種々の測定点（表示）でｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞から粗細胞ＲＮＡを抽出し、プローブとして放射性標識ｏｍｐＡおよびｌｐｐ ＯＲＦ ＤＮＡを使用したノーザンブロット分析に供した。
図５は、ポリソームプロフィールに対するカスガマイシンの効果を証明する。上記のように実験を行った。リボゾームパターンをＯＤ２６０によって検出し、左（４０％）から右（５％）に勾配を持たせた。７０Ｓ、５０Ｓ、および３０Ｓリボゾームの位置を示す。
図６は、リボゾームによるｍａｚＧｍＲＮＡのＭａｚＦ切断の阻害を示す。上記のように反応を行った。レーン１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン２、２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン３、０．５μＭ ７０ＳリボゾームおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし；レーン４、ｍａｚＧｍＲＮＡおよび７０Ｓリボゾームを３７℃で１０分間インキュベートし、その後プライマー伸長前に２．２μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を３７℃でさらに１０分間混合物に添加した；レーン５、７０ＳリボゾームおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を最初に混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、その後ｍａｚＧｍＲＮＡを添加し、３７℃で１０分間さらにインキュベートし、その後プライマーを伸長させた；レーン６、ｍａｚＧｍＲＮＡおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を混合して３７℃で１０分間インキュベートした後、７０Ｓリボゾームを混合物に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした後に伸長させた。ＦＬ、全長ｍａｚＧｍＲＮＡ；ＴＰ（ｓ）、二次構造に起因する休止部位（ｐａｕｓｅｄ ｓｉｔｅ）；ＴＰ（Ｆ）、ＭａｚＦ切断に起因するトゥープリント部位；およびＴＰ（ｒ）、ｍａｚＧｍＲＮＡへのリボゾーム結合に起因するトゥープリント部位。
図７は、ＭａｚＦ機能に対するｍａｚＧｍＲＮＡのシャイン−ダルカルノ配列のＧＧＡＧからＵＵＵＧへの変異の効果を例示する。上記のように反応を行った。レーン１〜４、野生型ｍａｚＧｍＲＮＡ；レーン５〜８、シャイン−ダルカルノ配列でＧＧＡＧからＵＵＵＧへ変異した変異ｍａｚＧｍＲＮＡ。レーン１および５、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン２および６、２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン３および７、０．５μＭ ７０ＳリボゾームおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし、およびレーン４および８、０．５μＭ ７０Ｓリボゾーム＋２．２μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６。左側のマーカーの注釈は、図６と同一である。
図８は、ＭａｚＦ機能に対するｍａｚＧｍＲＮＡの阻害コドンでの変異の効果を示す。上記のように反応を行った。レーン１〜４、野生型ｍａｚＧｍＲＮＡ；レーン５〜８、開始コドンがＧＵＧに変化した変異ｍａｚＧｍＲＮＡ；レーン９〜１２、開始コドンがＡＧＧに変化した変異ｍａｚＧｍＲＮＡ。レーン１、５および９、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン２、６および１０、２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および７０Ｓリボゾームなし；レーン３、７、および１１、０．５μＭ ７０ＳリボゾームおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし、およびレーン４、８、１２、０．５μＭ ７０Ｓリボゾーム＋２．２μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６。左側のマーカーの注釈は、図６と同一である。
図９は、ＭａｚＦ機能に対するＵＡＣＡＵ（Ｕ１Ａ２Ｃ３Ａ４Ｕ５）切断での変異の効果を示す。上記のように反応を行った。レーン１および２は、コントロールとして野生型ｍａｚＧｍＲＮＡを使用する。全ての変異を矢印示す。レーン１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし；レーン２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２、２．６μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６。左側のマーカーの注釈は、図６と同一である。
図１０は、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの切断に対するＭａｚＦおよびＭａｚＥの効果を示す。１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５μｌヒト胎盤ＲＮアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）、５．６μＭ ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６、および／または１７．６μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）（総体積１０μｌ）中で反応を行った。３７℃で１０分間のインキュベーション後、２μｌのローディング緩衝液を添加して反応を停止させた。サンプルを、３．５％アクリルアミドゲルで分析した。レーン１、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６なし、レーン２、５．２μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６；レーン３、１７．６μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ；およびレーン４、５．２μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６および１７．６μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ。２３Ｓおよび１６ＳのｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを矢印で示す。
（結果）
ｍａｚＦ遺伝子を、アラビノース誘導性ｐＢＡＤプラスミドにクローン化した（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７，４１２１−３０（１９９５））。ｐＢＡＤ−ＭａｚＦを保有する大腸菌ＢＷ２５１１３は、アラビノース（０．２％）の存在下ではグリセロール−Ｍ９培地で成長しなかった（図１Ａを参照のこと）。ＭａｚＦホモログ間で高度に保存されているＡｒｇ２９またはＡｒｇ８６のいずれかがそれぞれＳｅｒまたはＧｌｙで置換された場合（図１Ｂ）、アラビノース感受性が消失した（図１Ａ）。この結果は、認められた細胞成長阻害が野生型ＭａｚＦの存在に起因することを示した。液体培地では、５分間のアラビノースの添加後に、細胞の生存数は１０４個減少した。
ＭａｚＦによって阻害された細胞機能を同定するために、トルエン処理によって透過処理したｐＢＡＤ−ＭａｚＦを保有する大腸菌ＢＷ２５１１３から調製した無細胞系を使用した（Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １２６，１８３−９１（１９７６）；Ｈａｌｅｇｏｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ ＪＢｉｏｃｈｅｍ ６９，１６３−７（１９７６））。ＡＴＰ依存性３５Ｓ−メチオニン組み込みは、トルエン処理前に細胞をアラビノースの存在下で１０分間予備インキュベーションした場合に完全に阻害された（図２Ａ）。しかし、同様の条件下で、［α−３２Ｐ］ ｄＴＴＰ（Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６７，６７４−８１（１９７０））（図２Ｂ）および［α−３２Ｐ］ ＵＴＰ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０７，５８５−８（１９７１））（図２Ｃ）の組み込みは影響を受けなかった。これらの結果は、ＭａｚＦはタンパク質合成を阻害するが、ＤＮＡ複製やＲＮＡ合成を阻害しないことを証明する。３５Ｓ−メチオニンのインビボ組み込み（Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２４２，４０５−７（１９７３））は、トルエン処理していない細胞を使用したアラビノースの添加後に劇的に阻害された（図２Ｄ）。アラビノース添加後の異なる測定点での総細胞タンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２Ｅ）は、ＭａｚＦが本質的に全ての細胞タンパク質に影響を及ぼすタンパク質合成の一般的なインヒビターであることを示した。興味深いことに、より大きなタンパク質の合成は、より小さなタンパク質の合成よりもＭａｚＦ毒性に対して感受性が高かった。
アラビノース誘導から１０分後のスクロース密度勾配によってｐＢＡＤ−ＭａｚＦを保有する大腸菌ＢＷ２５１１３のポリソームパターン分析を行った。図３Ａに示すように、このような細胞中でポリソームは完全に消失し、それに伴って７０Ｓリボゾーム画分が増加し、３０Ｓまたは５０Ｓリボゾーム画分は有意に変化しなかった。細胞をカスガマイシン（翻訳開始を阻害する抗生物質）で処理した場合、ポリソームパターンの類似の変化が認められた（図５）。これらの所見により、ＭａｚＦは翻訳開始阻害またはｍＲＮＡの分解のいずれかによってｍＲＮＡからリボゾームを放出させることが示唆される。
無大腸菌細胞ＲＮＡ／タンパク質合成系において、候補タンパク質（ＭａｚＧ）の合成に対する精製ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の効果も試験した。ＭａｚＥおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の両方を同時発現する細胞からＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を精製した。漸増濃度のＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の非存在下および存在下で大腸菌Ｔ７Ｓ３０抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、プラスミドｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧ由来のＭａｚＧ（３０ｋＤ）（Ｈｉｒａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２４２，４０５−７（１９７３））の合成を３７℃で１時間行った（図３Ｂ）。ＭａｚＧ合成は、２３１ｎＭを超えるＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６濃度で完全に遮断された。この認められたＭａｚＧ合成のＭａｚＦ媒介性阻害に対するＭａｚＥ抗毒素の効果を並行して評価した。興味深いことに、抗毒素（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの同時添加によって、用量依存性様式でＭａｚＧ合成がレスキューされた（図３Ｂ）。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６はまた、無真核細胞タンパク質合成を阻害することができ（図３Ｃ、レーン２）、これも（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの同時添加で回復した（レーン３）。
ＭａｚＦはＭａｚＧ合成を阻害したので（図３Ｂ）、阻害のタイミングを分析した。阻害が翻訳開始工程に影響を与えるかどうかを決定するために、７０ＳリボゾームおよびｍａｚＧｍＲＮＡを使用したトゥープリンティング（ＴＰ）技術を使用した（Ｍｏｌｌ ａｎｄ Ｂｌａｓｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９７，１０２１−１０２６（２００２））。ｍａｚＧｍＲＮＡのみのトゥープリンティングによって、おそらくｍａｚＧｍＲＮＡの５’末端の二次構造に起因して全長バンド（ＦＬ）およびバンドＴＰ（ｓ）が得られた（図４Ａ、レーン１）。７０Ｓリボゾームの存在下で、阻害コドンの下流にトゥープリンティングバンド［ＴＰ（ｒ）］が検出された（レーン３）。７０Ｓリボゾームと共にＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を添加した場合、シャイン−ダルカルノ（ＳＤ）配列と開始コドンとの間の領域に対応する式のバンドＴＰ（Ｆ）が出現した（レーン４〜８）。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６濃度の増加につれて、ＴＰ（ｒ）バンドの強度画壇快適に減少し、３．７５μＭのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６で、ＴＰ（ｒ）バンドがほとんど完全に消滅した（レーン７）。
驚いたことに、７０Ｓリボゾームの非存在下でさえもＴＰ（Ｆ）バンドが検出され（レーン２）、ＭａｚＦが７０Ｓリボゾームに関係なくｍＲＮＡと結合することができるか、ＭａｚＦがＡ残基とＣ残基との間を切断するエンドリボヌクレアーゼであることを示す（図４Ａ）。
これらの可能性を区別するために、図４Ｂに示すように、ｍａｚＧｍＲＮＡをＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６とインキュベートし、フェノール抽出を行ってタンパク質を除去し、プライマー伸長のために使用した。フェノール抽出後でさえもＴＰ（Ｆ）バンドが認められ（レーン２）、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は実際にはｍａｚＧｍＲＮＡを切断していたことを示す。ＭａｚＥを同時添加した場合、ｍａｚＧｍＲＮＡの切断が再度遮断された（図４Ｃ、レーン４〜７）。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのみでは、ｍＲＮＡに対する効果は検出できなかったことに留意のこと（レーン２）。この結果は、ＭａｚＥの抗毒素効果はＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼ活性の阻害に起因することを示した。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６添加前の７０Ｓリボゾームの添加により、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６によるｍＲＮＡ分解が阻害され、これはおそらくｍａｚＧｍＲＮＡ中のＳＤ配列およびＡＣＡ配列が密接して存在することに起因する（図６）。対照的に、ＲｅｌＥの毒性機能にはリボゾームが必要である（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，（２００３））。
表Ｉは、試験した異なるｍＲＮＡ転写物中のＭａｚＦ切断配列を示す。保存切断配列に下線を引いている。
（ｙｅｅＷの第１の行：配列番号８４；ｙｅｅＷの第２の行：配列番号９０；Ｅｎｖｚ：配列番号９１；ｌａｃＺ：配列番号９２）ＭａｚＦ切断の特異性を決定するために、ｍａｚＧｍＲＮＡのＳＤ配列をＧＧＡＧからＵＵＵＧに変異し、ＡＵＧ開始コドンをＧＵＧまたはＡＧＧに変異させた。これらの変異は、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６によるｍａｚＧｍＲＮＡ切断に影響を与えなかった（図７および８）。ｙｅｅＷ、ｅｎｖＺ、およびｌａｃＺのｍＲＮＡを基質として使用した場合、それぞれＳＤ配列および開始コドンと無関係にｍＲＮＡ転写物中の予想されたＡＣＡ配列で切断された（表Ｉ）。これらのｍＲＮＡでは、ＡＣＡ配列は、５’末端でＧ、Ａ、またはＴと隣接し、３’末端でＣまたはＴと隣接する。この所見を考慮して、５’末端および３’末端のＵ残基がＧ、Ａ、またはＣに変異するように切断部位にＵＡＣＡＵ配列を有するｍａｚＧｍＲＮＡを変異した。これらの変異は、切断にいかなる影響も与えなかった（図９）。しかし、中央のＡＣＡ配列を、ＧＣＡ、ＣＣＡ、ＴＣＡ；ＡＧＡ、ＡＴＡ、ＡＡＡ；ＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＴに変化させた場合、切断は認められず（図９）、ＭａｚＦはＡＣＡ配列を認識する配列特異性の高いエンドリボヌクレアーゼであることを示す。
まとめると、上記結果は、ＭａｚＦは、ＡＣＡ部位で細胞ｍＲＮＡを切断し、それによって細胞中の全タンパク質合成を遮断する配列特異性の高いエンドリボヌクレアーゼとして機能することを示す（図２Ｅ）。この所見をさらに試験するために、ＭａｚＦのアラビノース誘導後に異なる時間間隔で抽出した全細胞ＲＮＡを使用して、ノーザンブロット分析を行った（Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｋｉｅ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４７，７５−８８（２００３）；Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３２，１３３７−４６（１９８３））。ｏｍｐＡおよびｌｐｐｍＲＮＡの両方が分解された（図４Ｃ）。これら２つのｍＲＮＡの半減期の認められた相違は、ｍＲＮＡ中に存在する全ＡＣＡ配列数およびｍＲＮＡの長さと相関した。例えば、３２２ｂｐのｌｐｐｍＲＮＡ（Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｃｅｌｌ １８，１１０９−１７（１９７９））がたった１つのＡＣＡ配列を有する一方で、１２２９ｂｐのｏｍｐＡｍＲＮＡ（Ｍｏｖｖａ ｅｔ ａｌ．，ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ １４３，３１７−２８（１９８０））は２１個のＡＣＡ配列を有する。この相関により、より長いｍＲＮＡはより短いｍＲＮＡよりもＭａｚＦによって媒介される切断に対して感受性が高いことが示唆される。
興味深いことに、ＭａｚＦ ＯＲＦ内に全部で９個のＡＣＡ配列が存在し、そのうちの４個がＯＲＦの中央でクラスター化しており、ＭａｚＦ発現をその遺伝子産物自体によって負に自己制御することができることが示唆される。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は、１６Ｓおよび２３ＳのｒＲＮＡをより小さな画分に切断することができるが、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの存在下ではできない（図１０）ことにも留意すべきである。
要するに、ＭａｚＦは固有のトリプレット配列（ＡＣＡ）の切断によってｍＲＮＡ機能を特異的に阻害する新規のエンドリボヌクレアーゼである。そのｍＲＮＡ機能を妨害する能力により、このエンドリボヌクレアーゼカテゴリーを、本明細書中で、「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と命名する。本明細書中に示した結果によって理解されるように、異なる配列特異性を有するさらなるｍＲＮＡインターフェラーゼが存在する可能性が高い。
新規に発見されたエンドリボヌクレアーゼのカテゴリーに加えて、ｍＲＮＡ機能を妨害することが公知のいくつかの他の機構が存在する。１つのこのような機構は、大腸菌における特異的遺伝子発現のためのＲＮＡリプレッサーとして最初に特徴づけられたｍｉｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＲＮＡ）を含む（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１，１９６６−７０（１９８４））。より最近には、真核生物でｍｉＲＮＡ（Ｚｅｎｇ ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ，Ｒｎａ ９，１１２−２３（２００３））およびｓｉＲＮＡ（Ｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，１４４２８−３３（２００１））として類似のＲＮＡエレメントが発見された。本研究において大腸菌について証明したｍＲＮＡによるｍＲＮＡ機能のこの新規の破壊機構が真核生物にも関連するという興味深い可能性が存在する。これは、全てではないが多数の生きた生物の細胞生理学に多く関わる。さらに、配列特異性の高いｍＲＮＡインターフェラーゼを、ＲＮＡの構造研究のための生化学的ツールだけでなく、ヒト疾患の治療のための治療ツールとして使用することができる。特に、２：４のＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体の結晶構造が最近発表された（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，８７５−８８４（２００３））。結晶構造から得られた情報は、どのようにしてＭａｚＦはＡＣＡ配列を特異的に認識して切断するのかということの決定を補助することができる。
（実施例ＩＩ）
注目すべきことは、本発明の発見前に、ＭａｚＦの細胞標的は同定されていなかった。本明細書中に示すように、ＭａｚＦはＡＣＡ部位で細胞ｍＲＮＡを切断する高度に配列特異的なエンドリボヌクレアーゼとして機能する。このような活性は、細胞中でのタンパク質合成を部分的または完全に阻害をすることができる。ＲＮＡ転写物中のＡＣＡ配列の予想される頻度は、４つのヌクレオチドのうちの任意の１つが３つのヌクレオチド位置にそれぞれ組み込まれる確率が等しいと予想する標準的な計算に基づいて１／６４である。いくつかのＲＮＡ転写物は予想される頻度と比較してＡＣＡ配列の頻度が低いか高いと理解すべきである。したがって、特異的ＲＮＡ転写物または関連するＲＮＡ転写物ファミリーのＭａｚＦエンドリボヌクレアーゼによる切断に対する感受性は、転写物中のＡＣＡ配列またはＭａｚＦ標的配列の頻度に依存する。さらに、当業者は、ＲＮＡ転写物の配列に基づいて、ＭａｚＦ媒介切断に対する転写物の感度を予想することができる。
（実施例ＩＩＩ）
上記のように、プログラム細胞死は、大腸菌において、それぞれ同時発現する安定な毒素および不安定な抗毒素をコードする遺伝子組からなる「アディクションモジュール」系によって媒介されると提案されている。その発現は、毒素／抗毒素複合体または抗毒素のみのいずれかによって自己制御される。同時発現が阻害される場合、抗毒素はプロテアーゼによって容易に分解されて毒素がその標的に作用することができる。大腸菌では、染色体外エレメントが細菌プログラム細胞死の主な遺伝子系である。最も研究されている染色体外アディクションモジュールは、バクテリオファージＰ１におけるｐｈｄ−ｄｏｃ（Ｌｅｈｎｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３３，４１４−４２８；Ｌｅｈｎｈｅｒｒ ａｎｄ Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，３２７４−３２７７；Ｍａｇｎｕｓｏｎ ａｎｄ Ｙａｒｍｏｌｉｎｓｋｙ（１９９８）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８０，６３４２−６３５１；Ｇａｚｉｔ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，１６８１３−１６８１８；Ｇａｚｉｔ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（１９９９）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，２６５２−２６５７）、Ｆ因子におけるｃｃｄＡ−ｃｃｄＢ（Ｔａｍ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅ（１９８９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１，２３５３−２３６０；Ｖａｎ Ｍｅｌｄｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１，１１５１−１１５７；Ｂａｈａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，１０９３６−１０９４４；Ｌｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８５，１６６７−１６７７；Ａｆｉｆ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４１，７３−８２；Ｄａｏ−Ｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，３７３３−３７４２；Ｖａｎ Ｍｅｌｄｅｒｅｎ（２００２）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９１，５３７−５４４）、およびプラスミドＲ１００におけるｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ（Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７０，１４６１−１４６６；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ．（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１５，４６３−４６８；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ １７４，４２０５−４２１１；Ｔｓｕｃｈｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ．（１９９３）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３７，８１−８８である。興味深いことに、大腸菌染色体はまた、上記のｒｅｌＢＥ系およびｍａｚＥＦ系などのいくつかのアディクションモジュール系を含む。
２つの隣接遺伝子ｍａｚＥおよびｍａｚＦからなるｍａｚＥＦ系は、大腸菌染色体上のｒｅｌＡ遺伝子から下流に存在する。配列分析によって、これらがプラスミドｐＲ１００上のｐｅｍＩ遺伝子およびｐｅｍＫ遺伝子と部分的に相同であることが明らかとなった（Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，６８５０−６８５６）。上記のように、ｍａｚＥＦ系は、アディクションモジュールの性質を示す：ＭａｚＦは有毒であり、ＭａｚＥは抗毒素性を示す；ＭａｚＦは安定である一方で、ＭａｚＥはＡＴＰ依存性ＣｌｐＰＡセリンプロテアーゼによってインビボで分解される不安定なタンパク質である（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ｓｕｐｒａ）；ＭａｚＥおよびＭａｚＦは同時発現し、互い相互作用して複合体を形成する；ｍａｚＥＦ発現はＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体によって負に自己制御される（Ｍａｒｉａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，５９７５−５９８４）。上記のように、ｍａｚＥＦ媒介性細胞死を、極度なアミノ酸枯渇およびチミン枯渇（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）、有毒タンパク質Ｄｏｃ（Ｈａｚａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３，２０４６−２０５０）、およびリファンピシン、クロラムフェニコール、およびスペクチノマイシンなどの転写および／または翻訳の一般的なインヒビターであるいくつかの抗生物質（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ）によって誘発することができる。
下記のように、ｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡへの結合およびＭａｚＦとの相互作用を担うＭａｚＥ中の機能ドメインを同定するために、ＭａｚＥ、ＭａｚＦ、およびｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡとの間の相互作用を調査した。ＭａｚＥがそのＮ末端領域中にＤＮＡ結合ドメインを有し、ＭａｚＥ中の残基３８〜７５の領域がＭａｚＦへの結合に必要であり、そのうちでＬｅｕ５５残基およびＬｅｕ５８残基が不可欠であることを証明する。本明細書中に示したデータにより、溶液中のＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体が１つのＭａｚＥ二量体および２つのＭａｚＦ二量体を含み得ることも示唆される。
（材料および方法）
試薬および酵素−核酸、アンピシリン、およびカナマイシンをＳｉｇｍａから入手した。クローニングに使用する制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。放射性核種を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。
プラスミドの構築−ｍａｚＥＦ（そのシャイン−ダルカルノ配列領域を含む）を、テンプレートして大腸菌ゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ１１ａのＸｂａＩ−ＮｈｅＩ部位にクローン化し、プラスミドｐＥＴ１１ａ−ＥＦを作製した。ｍａｚＥＦ遺伝子（そのシャイン−ダルカルノ配列領域を含む）をＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ２１ｃｃのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化して、ＭａｚＦのＣ末端に（Ｈｉｓ）６タグを有するインフレーム翻訳物を作製した。このプラスミドを、ｐＥＴ２１ｃｃ−ＥＦ（Ｈｉｓ）６と命名した。ｍａｚＥ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ２８ａのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。このプラスミドを、ｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｅと命名した。ＭａｚＥを、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグおよびその後にトロンビン切断部位を有する融合物（命名された（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ）として発現させた。全長ｍａｚＥ遺伝子およびｍａｚＥ遺伝子の種々のＮ末端およびＣ末端欠失構築物（図１７を参照のこと）をＰＣＲによって作製し、ｐＧＡＤ−Ｃ１ベクターのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位にクローン化してＧａｌ４転写活性化ドメインを有するインフレーム翻訳融合物を作製した。これらのプラスミドを、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥ、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−１３）、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−２４）、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−３７）、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−４６）、ｐＧＡＤ− ＭａｚＥΔ（６８−８２）、およびｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（７６−８２）と命名した。
全長ｍａｚＦ遺伝子およびｍａｚＦ遺伝子の種々のＮ末端およびＣ末端欠失構築物をＰＣＲによって作製し、ｐＧＢＤ−Ｃ１ベクターのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローン化してＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを有するインフレーム翻訳融合物を作製した。これらのプラスミドを、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦ、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦΔ（１−１４）、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦΔ（１−２５）、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦΔ（７２−１１１）、およびｐＧＢＤ−ＭａｚＦΔ（９７−１１１）と命名した。
タンパク質精製−ｐＥＴ１１ａ−ＥＦを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入した。ＭａｚＥおよびＭａｚＦの同時発現を、１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下で４時間誘導した。遠心分離によって細胞を回収し、フレンチプレスを使用して溶解した。細胞溶解物を３７℃で３０分間維持してＭａｚＥを最大に分解し、細胞残屑および未溶解の細胞を、８，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、その後１０，０００×ｇで１時間の超遠心分離によって膜および可溶性画分を除去した。次に、リュ酸アンモニウム分画、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１００カラムでのゲル濾過、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、およびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィによってＭａｚＦを精製した。ＭａｚＦタンパク質を含む画分をプールし、濃縮した。Ｓｕｐｅｒｄｕｘ（商標）２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したゲル濾過によってＭａｚＦをさらに精製した。
（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの精製のために、ｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｅを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入し、１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ発現を４時間誘導した。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥタンパク質を、直ちにＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）アフィニティクロマトグラフィによって精製した。
ｐＥＴ２１ｃｃ−ＥＦ（Ｈｉｓ）６も大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入した。１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で４時間、ＭａｚＥとＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６との同時発現を誘導した。ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体を、直ちにＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）アフィニティクロマトグラフィによって精製し、ゲル濾過によってさらに精製した。精製ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体からＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を精製するために、精製ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体中のＭａｚＥを、６Ｍ塩化グアニジン中でＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６から分離した。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）によって再捕捉し、段階的透析によって再折りたたみを行った。再折りたたみ物の収率は約８０％である。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の生化学活性を、タンパク質合成阻害のための大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）−２つの一本鎖オリゴヌクレオチド（
（配列番号１２）および
（配列番号１３））を合成およびアニーリングして、ｍａｚＥＦプロモーター配列を含む５０ｂｐの二本鎖ＤＮＡを作製した。５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで末端標識し、これを使用してＥＭＳＡによるタンパク質−ＤＮＡ結合を検出した。精製タンパク質、２μｌの１００μｇ／ｍｌポリ（ｄＩ−ｄＣ）、および２μｌの標識ＤＮＡフラグメントを含む結合緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、および５％グリセロール）を用いて結合反応（２０μｌ）を４℃で３０分間行った。６％未変性ポリアクリルアミドゲルを含むＴＡＥ緩衝液中にて１００Ｖで電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムを感光させた。
ネイティブＰＡＧＥ−異なる量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、および５％グリセロール）中にて４℃で３０分間混合し、混合物に２×ローディング溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０８％ブロモフェノールブルー、および８％グリセロール）を添加し、未変性ゲルにローディングした。スタッキングゲルの組成は、５％アクリルアミド−ｂｉｓ（２９：１）を含む６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であり、分離ゲルの組成物は１０％アクリルアミド−ｂｉｓ（２９：１）を含む１８７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）であった。泳動緩衝液は、８２．６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．４）および３３ｍＭグリシンを含んでいた。定電圧（１５０Ｖ）で４℃にて電気泳動を行った。クーマシーブリリアントブルーによってタンパク質バンドを視覚化した。
トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによる低分子量タンパク質の分離−以下のように幾らか修正した以前に記載の方法（Ｓｃｈａｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．（１９８７）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６６，３６８−３７９）にしたがってトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った：スタッキングゲル、５％アクリルアミド−ｂｉｓ（４８：１．５）を含む０．７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）および０．０７５％ＳＤＳ；スペーサーゲル、１０％アクリルアミド−ｂｉｓ（４８：１．５）を含む１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）および０．１％ＳＤＳ；分離ゲル：１６．５％アクリルアミド−ｂｉｓ（４８：１．５）を含む１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）および０．１％ＳＤＳ。アノード泳動緩衝液は０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）であり、カソード泳動緩衝液は０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、０．１トリシン、および０．１％ＳＤＳであった。室温で定電流（２０ｍＡｍｐ）でのゲルの泳動後、クーマシーブリリアントブルーによってタンパク質バンドを視覚化した。
酵母２−ハイブリッド系におけるＭａｚＥ−ＭａｚＦ相互作用のアッセイ−酵母２−ハイブリッドレポーターであるＰＪ６９−４Ａ株（ＭＡＴａ ｔｒｐｌ−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−２００ ｇａｌ４ｇａｌ８０ＬＹＳ２：：ＧＡＬｌ−ＨＩＳ３ＧＡＬ２−ＡＤＥ２ｍｅｔ：：ＧＡＬ７−ｌａｃＺ）およびベクターｐＧＡＤ−Ｃ１およびｐＧＢＤ−Ｃ１を、２−ハイブリッドアッセイのために使用した（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４，１４２５−１４３６）。ＭａｚＥ中のＭａｚＦ結合領域を局在化するために、ｍａｚＥ遺伝子の一連のＮ末端およびＣ末端の欠失をｐＧＡＤ−Ｃ１中に構築し、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦプラスミドでＰＪ６９−４Ａ細胞に形質転換した。図１７を参照のこと。ＭａｚＦタンパク質中のＭａｚＥ結合領域を局在化するために、ｍａｚＦ遺伝子の一連のＮ末端およびＣ末端欠失をｐＧＢＤ−Ｃ１中に構築し、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥプラスミドでＰＪ６９−４Ａ細胞に形質転換した。Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびアデニン（Ａｄｅ）を欠く合成ドロップアウト（ＳＤ）最小培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）における同時形質転換体の成長のモニタリングによって、相互作用のアッセイを行った。培地に１ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ）を補足し、３０℃で５日間インキュベートした。
（図面に関する特定の方法の詳細）
図１１では、レーンに以下のようにローディングした：レーン１、タンパク質分子量マーカー；レーン２、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；レーン３、ＭａｚＦ；およびレーン４、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ。
図１２Ａおよび１２Ｂでは、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを表示のモル比で混合した。混合物を４℃で３０分間インキュベートし、ネイティブＰＡＧＥに供した。複合体のバンドに対応するゲルを切り出し、還元緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ β−ＭＥ）中にて室温で３０分間インキュベートし、二次元電気泳動のために１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。下のパネル中のゲルに示すように、複合体中の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦが分離された。各レーン中の相対タンパク質量を、コントロールとしての（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを使用したデンシトメトリーによって決定した。図１２Ａでは、異なる量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥを、２０μｌの２μＭ ＭａｚＦ溶液に添加した。レーン１〜５、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ：ＭａｚＦはそれぞれ１：１、２：１、４：１、６：１、および８：１であった。図１２Ｂでは、異なる量のＭａｚＦを２０μｌの２μＭ ＭａｚＥ溶液に添加した。レーン１〜５、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ：ＭａｚＦ比はそれぞれ１：１、１：２、１：４、１：６、および１：８であった。図１２Ａおよび図１２Ｂ中の上のパネルは、ネイティブＰＡＧＥの結果を示す。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体の位置を矢印ａで示す。図１２Ａおよび図１２Ｂ中の下のパネルは、二次元電気泳動のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。精製された（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（４０ｐｍｏｌ）およびＭａｚＦ（４０ｐｍｏｌ）を、コントロールとして第１および第２のレーンにアプライした。
図１３では、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したゲル濾過によって、ＭａｚＦおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の分子量を決定した。タンパク質の分子量検量線は、サイログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリチン（４４３ｋＤａ）、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、およびカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を含む。検量線上の縦の矢印は、ＭａｚＦおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の位置を示す。
図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃでは、ｍａｚＥＦプロモーター領域を含む５０ｂｐの［３２Ｐ］標識ＤＮＡフラグメントを、漸増量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（図１４Ａ）、漸増量のＭａｚＦ（図１４Ｂ）、または（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ／ＭａｚＦ比が１：２で一定の漸増量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦの両方とインキュベートした（図１４Ｃ）。
図１５では、アラインメント分析のためにＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。８個の異なるタンパク質の間で同一の残基を黒のボックスで示す。類似の残基を灰色のボックスで示す。アラインメントを最適にするためにギャップ（ダッシュ記号で示す）を導入する。配列は以下である：デイノコッカス・ラジオデュランスのｍａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２９４１３９）；バチルス・ハロデュランスのｍａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２４４５８７）；プラスミドＲ１００におけるＰｅｍＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５２９９３）；プラスミドＲ４６６ｂにおけるＰｅｍＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ８２５１５）；大腸菌のＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２８９３３７）；大腸菌のＣｈｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２９０８５６）；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０のＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７４２９３１）；フォトバクテリウム・プロファンダムのＭａｚＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ３４５５４）。数字は、アミノ酸残基の位置に対応している。
図１６Ａおよび１６Ｂでは、タンパク質のＤＮＡ結合を、ｍａｚＥＦプロモーター領域を含む５０ｂｐの［３２Ｐ］標識ＤＮＡフラグメントを使用したＥＭＳＡによって決定した。図１６Ａでは、ＤＮＡフラグメントを、１μＭの表示の各複合体と２０μｌの混合物中にて４℃で３０分間インキュベートした。レーン１、タンパク質を含まないコントロール；レーン２、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；レーン３、ＭａｚＥ（Ｋ７Ａ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体、レーン４、ＭａｚＥ（Ｒ８Ａ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；レーン５、ＭａｚＥ（Ｓ１２Ａ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；レーン６、ＭａｚＥ（Ｒ１６Ａ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；レーン７、ＭａｚＥ（Ｉ４３Ｎ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体；およびレーン８、ＭａｚＥ（Ｅ５７Ｑ）−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体。図１６Ｂでは、ＤＮＡフラグメントを、表示の４μＭ（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥまたは（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体と２０μｌの混合物中にて４℃で３０分間インキュベートした。レーン１、タンパク質を含まないコントロール；レーン２、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥタンパク質；レーン３、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（Ｋ７Ａ）変異型；レーン４、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（Ｒ８Ａ）変異体；レーン５、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（Ｓ１２Ａ）変異体；およびレーン６、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（Ｒ１６Ａ）変異体。
図１７では、全長ｍａｚＥ遺伝子および短縮ｍａｚＥ遺伝子をｐＧＡＤ−Ｃ１中で構築した。数字は、ＭａｚＥ中のアミノ酸の位置を示す。プラスミドを、酵母ＰＪ６９−４Ａ細胞にｐＧＢＤ−ＭａｚＦで同時形質転換した。Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびＡｄｅの非存在下で１ｍＭ ３−ＡＴを含むＳＤ培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プレート上でタンパク質−タンパク質相互作用を試験した。＋は５日間で形成された視覚可能なコロニーを示す。−は、５日間で形成された視覚可能なコロニーが存在しないことを示す。
図１８Ａでは、ＭａｚＦと（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥまたは（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体との間の相互作用を、ネイティブＰＡＧＥによって決定した。レーン１、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ；レーン２、ＭａｚＦ；レーン３、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦ；レーン４、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体およびＭａｚＦ；レーン５、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｒ４８Ａ変異体およびＭａｚＦ；レーン６、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｅ５７Ｑ変異体およびＭａｚＦ；およびレーン７、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｆ５３Ａ変異体およびＭａｚＦ。
図１８Ｂでは、ＭａｚＦと（Ｈｉｓ） ６ ＭａｚＥまたは（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体との間の相互作用を、ｍａｚＥＦプロモーター領域を含む５０ｂｐの［３２Ｐ］標識ＤＮＡフラグメントを使用したＥＭＳＡによって決定した。レーン１、タンパク質を含まないコントロール；レーン２、４μＭ野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ；レーン３、４μＭ（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異型；レーン４、２μＭ野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよび４μＭＭａｚＦ；およびレーン５、２μＭ（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体および４μＭＭａｚＦ。
ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造を示す図１９では、ＭａｚＥ機能に不可欠な保存アミノ酸残基を示す。１つのＭａｚＥ分子（青色）がＭａｚＦホモ二量体の２つのＭａｚＦ分子（紫色および赤色）と相互作用するＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２複合体の一部のみを示す。ＭａｚＥ分子では、Ｎ−ボックスおよびＨｐ−ボックスはそれぞれ緑色および黄色で示す。Ｎ−ボックス中のＬｙｓ７、Ａｒｇ８、Ｓｅｒ１２、およびＡｒｇ１６の位置ならびにＨｐ−ボックス中のＬｅｕ５５およびＬｅｕ５８の位置を示す。本明細書中に示すように、これらの置換変異によってＭａｚＥ機能が喪失した。
（結果）
ＭａｚＥおよびＭａｚＦは、１：２の比で複合体を形成することができる−精製ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６、ＭａｚＦ、および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを、それぞれ図１１のレーン２、３、および４に示す。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦのサイズは、それぞれ１１．４ｋＤａおよび１２．０ｋＤａの理論的分子量と一致する（図１１のレーン３および４）。ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体を、９．３ｋＤａのＭａｚＥおよび１３．２ｋＤａのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６に分離し（図１１、レーン２）、ＭａｚＥに対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の比は、デンシトメーターを使用して約２であると決定された。
（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦと共に混合してネイティブＰＡＧＥに供した場合、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを互いに混合し、混合物をネイティブＰＡＧＥに供し、ゲルの上部付近に新規のバンドが出現した（図１２中の位置ａ）。新規のバンドに対応するゲルを切り出し、還元緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ β−ＭＥ）中にて室温で３０分間インキュベートし、このゲルをタンパク質組成を分析するための二次元電気泳動を行うためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上部に置いた。クーマシーブリリアントブルーでのゲルの染色後、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦに対応する２つのバンドが認められた一方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥはＭａｚＦよりもゆっくりと移動した。これらの結果は、新規のバンドが（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを含む複合体であることを証明した。ネイティブＰＡＧＥから切断したゲルを還元緩衝液で処理しなかった場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に３つのタンパク質バンド（（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ、ＭａｚＦ、およびＭａｚＦ二量体）が認められた（データ示さず）。ネイティブＰＡＧＥにおいて精製ＭａｚＦの３つのバンドが認められたが、精製ＭａｚＦタンパク質をＨＰＬＣでアッセイした場合、１つのピークしか認められなかった（データ示さず）。
複合体における（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥとＭａｚＦとの比が安定しているかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。図１２Ａに示すように、異なる量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥを一定濃度のＭａｚＦ（２μｌ）を含む同一の溶液に添加して、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ：ＭａｚＦ比が１：１から２：１、４：１、６：１、８：１に変化する一連の溶液を作製した。図１２Ｂに示すように、異なる量のＭａｚＦも一定濃度の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ（２μｌ）を含む同一の溶液に添加して、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ：ＭａｚＦ比が１：１、１：２、１：４、および１：８である一連の溶液を作製した。上記混合物を４℃で３０分間インキュベートし、ネイティブＰＡＧＥによって分析した。新規のバンド（位置ａ）に対応するゲルを切り出し、還元緩衝液中にて室温で３０分間インキュベートし、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。二次元ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色して、タンパク質バンドを検出した。各レーン中の相対タンパク質を、コントロールとして精製（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを使用したデンシトメーターによって決定した。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥまたはＭａｚＦを混合物中に過剰に添加する場合、複合体中のＭａｚＦに対する（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの比をほぼ１．８に維持した（図１２）。上記のように、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＭａｚＥおよびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６に分離し、ＭａｚＥに対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の比は約２であった（図１１、レーン２）。精製ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体およびＭａｚＦの分子量を、Ｓｕｐｅｒｄｕｘ（商標）２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したゲル濾過によって７６．９ｋＤａおよび２７．１ｋＤａであることが決定された（図１３）。ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体からＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６を精製した。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は、大腸菌無細胞系（大腸菌Ｔ７Ｓ３０抽出物系、Ｐｒｏｍｅｇａ）でのタンパク質合成を阻害することができ、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの同時添加によってこのタンパク質合成がレスキューされた（データ示さず）。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の分子量は光散乱によって２８．３ｋＤａであると決定され、ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６が二量体として存在することが示唆される。ＭａｚＥの構造は二量体であることが証明されている（Ｌａｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１４１０１−１４１１１）。したがって、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体（７６．９ｋＤａ）は、１つのＭａｚＥ二量体（ＭａｚＥの分子量が９．３ｋＤａであるので、約１８．６ｋＤａと予想される）および２つのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６二量体（５６．６ｋＤａ）からなることができる。
ＭａｚＦはＭａｚＥのｍａｚＥＦプロモーターへの結合を増強する−本明細書中に記載のように５０ｂｐのｍａｚＥＦプロモーターフラグメントを調製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって「γ−３２Ｐ」ＡＴＰで末端染色した。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ、ＭａｚＦ、およびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体を、ｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡフラグメントに結合する能力について個別に試験した。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥは、２μＭまたはそれ以上の濃度でｍａｚＥＦプロモーターフラグメントをシフトさせることができた（図１４、レーン７）。０．４〜１．０μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥで、不連続な移動度シフトバンドは認められないが、ＤＮＡフラグメントのシグナルは上方に塗り広げられ始め（図１４Ａ、レーン３〜６）、これらの濃度でいくつかの不安定な（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＤＮＡ複合体が認められたことを示す。２〜２０μＭの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥで、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの濃度が高いほどゆっくりと移動する個別の移動度シフト複合体が認められ（図１４Ａ、レーン７〜１２）、より高いＭａｚＥ濃度でＤＮＡフラグメントに結合する（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ分子数が増加することが示唆される。５０ｂｐのｍａｚＥＦプロモーターフラグメント中に１つを超える（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ結合部位が存在することが可能である。
対照的に、ＭａｚＦタンパク質は、２０μＭの濃度でさえも５０ｂｐのｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡに結合することができなかった（図１４Ｂ）。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ／ＭａｚＦ比を１：２に一定に保ちながら漸増量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦタンパク質を添加した。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのみと比較して、ＭａｚＦはｍａｚＥＦプロモーターへの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ結合を有意に増強する。これらの条件下で、５０ｂｐのｍａｚＥＦプロモーターフラグメントが０．２μＭの低濃度の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥでシフトされ（図１４Ｃ）、より高い濃度の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体でスーパーシフトが認められ、これは、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体が多いほど高い濃度でＤＮＡフラグメントに結合し、ｍａｚＥＦプロモーター中に（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のための複数の結合部位が存在することを証明する。
ＭａｚＥホモログ中の保存アミノ酸配列−ＢＬＡＳＴ検索によってＭａｚＥホモログを同定し、そのアミノ酸配列アラインメントを図１５に示す。一般にＭａｚＥは細菌で高度に保存されていないにも関わらず、ＭａｚＥホモログ中に保存領域が存在する。第１に、ＭａｚＥのＮ末端領域は、ＭａｚＥ中の他の領域よりも保存されている。ＭａｚＥは、ｐＩ４．７の酸性タンパク質であるが、Ｎ−ボックスと呼ばれるＮ末端領域中に保存された塩基性残基（Ｋ７、Ｒ８、およびＲ１６）はほとんど存在しない（図１５）。ＭａｚＥはｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡに結合することができるので、Ｎ−ボックスがＤＮＡ結合を担い得る。第２に、いくつかの保存された疎水性残基を含むＨｐ−ボックスと呼ばれる保存されたＣ末端領域が存在する（図１５）。
ＭａｚＥのＮ−ボックスはＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体の両方へのＤＮＡ結合を担う−ｐＥＴ２１ｃｃ−ＥＦ（Ｈｉｓ）６プラスミド中のｍａｚＥ遺伝子中にＮ−ボックス中の保存アミノ酸残基をＡｌａに変換する種々の部位特異的変異を構築した。ＭａｚＥ変異タンパク質およびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６によって形成された複合体を精製した。これらの複合体を、ＥＭＳＡによってｍａｚＥＦプロモーターへの結合能について試験した。図１６Ａ示したように、Ｎ−ボックス中に変異を有するＭａｚＥ変異体（Ｋ７Ａ、Ｂ８Ａ、Ｓ１２Ａ、またはＲ１６Ａ）およびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６によって形成された複合体は、ＭａｚＥＦプロモーターＤＮＡに結合することができなかった（図１６Ａ、レーン３、４、５、および６）。しかし、Ｎ−ボックスの外側の保存アミノ酸の置換変異（ＭａｚＥのＩ４３ＮおよびＥ５７Ｑなど）はこのような変異タンパク質を含む複合体のＤＮＡ結合能力に影響を与えなかった（図１６Ａ、それぞれレーン７および８）。ｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｅプラスミド中のｍａｚＥ遺伝子のさらなる置換変異も構築した。Ｎ−ボックスが置換変異した全ての（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体（Ｋ７Ａ、Ｂ８Ａ、Ｓ１２Ａ、およびＲ１６Ａ）はそのＤＮＡ結合能力を失う一方で（図１６Ｂ、それぞれレーン３、４、５、および６）、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥはｍａｚＥＦプロモーターへの結合能力を保持した（図１６Ｂ、レーン２）。対照的に、Ｎ−ボックスの外側が置換変異された（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体（Ｒ４８Ａ、Ｆ５３Ａ、Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ、およびＥ５７Ｑ）は、ｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡに結合することができた（データ示さず）。これらの結果は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＤＮＡ結合能力が複合体中のＭａｚＥに起因し、Ｎ−ボックスはＭａｚＥのＤＮＡ結合を担うことを示す。
ＭａｚＥとＭａｚＦとの相互作用−ＭａｚＥとＭａｚＦとの相互作用を試験するために、酵母２−ハイブリッドアッセイを行った。ＭａｚＥ領域がＭａｚＦとの相互作用に必要であることを証明するために、全長ｍａｚＥ遺伝子ならびにｍａｚＥ遺伝子の種々のＮ末端およびＣ末端欠失構築物をＰＣＲによって作製し（図１７を参照のこと）、ｐＧＡＤ−Ｃ１ベクターのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位にクローン化部位Ｇａｌ４転写活性化ドメインを有するインフレーム翻訳融合物を作製し、その後これらの各プラスミドｐＧＢＤ−ＭａｚＦプラスミドと共にＰＪ６９−４Ａ酵母細胞に同時形質転換した。ｐＧＢＤ−ＭａｚＦと共にｐＧＡＤ−ＭａｚＥ、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−１３）、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−２４）、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−３７）、またはｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（７６−８２）を保有する同時形質転換体は、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびＡｄｅを欠く合成培地（ＳＤ培地、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で成長することができた一方で、ｐＧＢＤ−ＭａｚＦと共にｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（１−４６）またはｐＧＡＤ−ＭａｚＥΔ（６８−８２）を保有する同時形質転換体は成長することができなかった。これらのデータは、全長ＭａｚＥ、ＭａｚＥΔ（１−１３）、ＭａｚＥΔ（１−２４）、ＭａｚＥΔ（１−３７）、およびＭａｚＥΔ（７６−８２）がＭａｚＦと相互作用することができる一方で、Ｎ末端欠失変異体ＭａｚＥΔ（１−４６）およびさらにＣ末端欠失変異体ＭａｚＥΔ（６８−８２）はできないことを証明した。これらの結果は、ＭａｚＥの残基３８〜７５がＭａｚＦとの相互作用を担うことを示す。
ＭａｚＦのＮ末端およびＣ末端由来の一連の短縮変異体をｐＧＢＤ−Ｃ１中で構築し、ｐＧＡＤ−ＭａｚＥと共にＰＪ６９−４Ａ細胞を同時形質転換した。これらの全形質転換酵母細胞は、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、およびＡｄｅの非存在下では完全合成培地で成長することができず、これらの全ＭａｚＦ変異体がｍａｚＥと相互作用することができないことを示す。したがって、ＭａｚＦのＮ末端およびＣ末端領域はともにＭａｚＥとの相互作用に関与し得るか、欠失変異型はＭａｚＥとの相互作用に有利なＭａｚＦの高次構造を破壊する。
（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのＲ４８Ａ、Ｆ５３Ａ、Ｆ５３Ａ／Ｌ５８Ａ、およびＥ５７Ｑ変異体を構築するために、プラスミドｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｅに部位特異的変異も行った。これらの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体とＭａｚＦとの複合体形成を、ネイティブＰＡＧＥによって試験した。図１８Ａに示すように、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ変異体であるＲ４８Ａ、Ｆ５３Ａ、およびＥ５７ＱはＭａｚＦと複合体を形成することができる一方で（それぞれ図１８Ａ、レーン５、６、および７）、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのＬ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体はできなかった（図１８Ａ、レーン４）。ＥＭＳＡを使用して、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよび（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのＬ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体が共にｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡに結合することができることを証明した（それぞれ図１８Ｂ、レーン２および３）。ＭａｚＦを添加する場合、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥはＭａｚＦと相互作用して複合体を形成し、野生型（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥのみを含むレーン（図１８Ｂ、レーン２）と比較してゲルの上部付近にバンドがスーパーシフトした（図１８Ｂ、レーン４）。しかし、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８ＡへのＭａｚＦの添加によってＤＮＡフラグメントのスーパーシフト種が認められ、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ変異体がＭａｚＦと相互作用して複合体を形成することができないことが確認された。
（考察）
大腸菌のｍａｚＥＦアディクション系は、それぞれ不安定な抗毒素ＭａｚＥおよび安定な毒素ＭａｚＦをコードする２つの遺伝子ＭａｚＥおよびＭａｚＦからなる。ｍａｚＦの毒作用は、ｐｐＧｐｐ（アミノ酸枯渇に応答してＲｅｌＡタンパク質によって産生されたシグナル）（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ｓｕｐｒａ）、一定の抗体（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ）、および有毒タンパク質Ｄｏｃ（Ｈａｚａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ）によって活性化される。これらの環境下で、不安定なＭａｚＥの分解によって、細胞に毒作用を発揮することができる遊離した安定なＭａｚＦが出現する。したがって、ＭａｚＥ細胞濃縮の調節は、細胞死の主な決定要因である。簡単に述べれば、ＭａｚＦとの複合体形成によって、ＭａｚＥはその毒作用を阻害する。さらに、ＭａｚＥはｍａｚＥＦプロモーターへの結合によるｍａｚＥＦ発現の自己調節にも関与する（Ｍａｒｉａｎｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｓｕｐｒａ）。本明細書中で示されるように、ＭａｚＥは、少なくとも２つの以下の機能ドメインを含む：ＤＮＡ結合ドメインおよびＭａｚＦ結合ドメイン。
融合タンパク質（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥは、ＭａｚＦと相互作用してｍａｚＥＦプロモーターに結合することができる。ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は、ＭａｚＦと同様に、二量体を形成してインビトロでタンパク質合成を阻害し、このようなタンパク質合成の阻害は（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの同時添加によってレスキューされる（データ示さず）。したがって、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質は、インビボで野生型ＭａｚＥおよびＭａｚＦと比較して類似の機能活性を示すようである。高度に精製された（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＦを使用して、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥはそれ自体によってｍａｚＥＦプロモーターに結合することができ、その相互作用はＭａｚＦの添加によって増強されることを証明した。実際、ＭａｚＦは、ｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡへの（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥの結合を１０倍を超えて増強した。より高濃度の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥまたは（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体で、電気泳動移動度シフトアッセイでｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡを含むスーパーシフトした複合体が認められ、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよび（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体は共にｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡ上に１つを超える結合部位を有することを示す。特に、以前の研究により、ｍａｚＥＦプロモーター領域中に３つのＭａｚＥ結合部位が存在し得ることが示唆されている（Ｌａｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１４１０１− １４１１１）。ＥＭＳＡによって認められたバンドが段階的様式でシフトしていないことに留意することが興味深い。
ＭａｚＥの保存されたＮ−ボックスの部位特異的変異（Ｋ７Ａ、Ｒ８Ａ、Ｓ１２Ａ、およびＲ１６Ａ）は（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の両方のＤＮＡ結合能力を破壊し（図１６）、ＭａｚＥがＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体のＤＮＡ結合能力を担い、ＭａｚＥ中の高度に保存されたＮ末端領域がＤＮＡ結合ドメインであることが示唆される。
ＭａｚＥ−ＭａｚＦ相互作用を担う領域を同定するために、酵母２−ハイブリッドアッセイを行った。ＭａｚＥのカルボキシ末端中の残基３８〜７５の領域はＭａｚＦへの結合に必要であることが見出された。注目すべきことは、疎水性残基が豊富なＨｐ−ボックスと呼ばれるＭａｚＥ中の保存Ｃ末端領域が存在することである。Ｌｅｕ５５およびＬｅｕ５８の保存アミノ酸でのＭａｚＥ Ｈｐ−ボックスの変異（Ｌ５５Ａ／Ｌ５８Ａ）により、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の相互作用が破壊された。酵母２−ハイブリッド実験はまた、ＭａｚＦのＮ末端またはＣ末端のいずれかからの欠失によってＭａｚＥとＭａｚＦとの相互作用が破壊されるので、ＭａｚＦタンパク質の構造全体がＭａｚＥとの相互作用に必要であり得ることを示した。
ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の分子量は、ゲル濾過によって７６．９ｋＤａであることが決定された。精製されたＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した場合、ＭａｚＥ：ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６比は約１：２であることが見出された（図１１、レーン２）。過剰量の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥまたはＭａｚＦの存在下でさえ、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体における（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ：ＭａｚＦ比は、約１：１．８に安定して維持された（図１２）。ＭａｚＥ（Ｌａｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）およびＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６は二量体として存在するので、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体（７６．９ｋＤａ）は、１つのＭａｚＥ二量体（ＭａｚＥの分子量が９．３ｋＤａであるので、約１８．６ｋＤａと予想される）および２つのＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６二量体（ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６二量体の分子量が２８．３ｋＤａであるので、約５６．６ｋＤａと予想される）からなり得る。
上記のように、Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ（（２００３）ｓｕｐｒａ）によってＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体の結晶構造を決定した。ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体の結晶構造以下のいくつかの態様で本明細書中に記載の結果を裏付けた。１）ＭａｚＥおよびＭａｚＦが、ＭａｚＦおよびＭａｚＥホモに量体が変化した２：４ヘテロ六量体（ＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２）を形成するという所見。（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体中の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の比が、タンパク質が非常に過剰に付加されていることに無関係であることが見出されたので、ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の２：４化学量論的複合体形成が非常に安定なようであることに留意することが重要である（図１２）。２）ＭａｚＥのＣ末端領域は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体構造中のＭａｚＦホモ二量体と相互作用する。この研究で同定されたＨｐ−ボックス領域は、ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の一見したところ最も安定な界面に関与する（図１９）。３）ＭａｚＥと他のアディクションモジュール解毒剤との間の類似性およびＭａｚＥおよびＭａｚＦの静電気的表面上の塩基性領域の分布に基づいて、Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ（（２００３）ｓｕｐｒａ）は、ＭａｚＥ中のＬｙｓ７およびＡｒｇ８がＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体中の主なＤＮＡ固定部位として作用すると提案していた。本明細書中で証明されるように、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体のＤＮＡ結合能力は、Ｌｙｓ７およびＡｒｇ８の部位特異的変異だけでなく、Ｎ−ボックス中の他の保存アミノ酸残基（Ｓｅｒ１２およびＡｒｇ１６）の変異によっても破壊されなかった（図１９）。ＭａｚＥが二量体として存在するので、ＭａｚＥ二量体中の２つのＮ−ボックスは共にＤＮＡ結合に関与し得る可能性がある。
（実施例ＩＶ）
本明細書中で示されるように、精製ＰｅｍＫ（「ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫアディクションモジュール」によってコードされる毒素）は大腸菌無細胞系でタンパク質合成を阻害する一方で、ＰｅｍＩ（ＰｅｍＫの抗毒素）の添加によってタンパク質合成が修復される。さらなる研究により、ＰｅｍＫがタンパク質合成を阻害するためにｍＲＮＡを切断する配列特異的エンドリボヌクレアーゼである一方で、ｐｅｍＩはＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性を遮断することが明らかである。本明細書中に記載するように、ＰｅｍＫは「ＵＡＸ」配列（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）中のＡヌクレオチドの５’部位または３’部位で一本鎖ＲＮＡを優先的に切断する。誘導時、ＰｅｍＫは大腸菌におけるタンパク質合成を有効に遮断するために細胞ｍＲＮＡを切断する。したがって、本発明は、ＰｅｍＫが特定の部位の切断によってｍＲＮＡ機能を妨害することを証明する。したがって、本発明者らは、ＰｅｍＫが新規のエンドヌクレアーゼであることを発見し、本明細書中で「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と命名した。広範な細菌のゲノム上でｐｅｍＫホモログを同定した。ＰｅｍＫおよびそのホモログが配列特異的様式での細胞ｍＲＮＡの切断によってｍＲＮＡ機能を妨害する新規のエンドリボヌクレアーゼファミリーを形成することを提案する。図３３および３４を参照のこと。
（材料および方法）
株およびプラスミド：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞およびＢＷ２５１１３細胞を本明細書中に記載のように使用した。テンプレートとしてプラスミドＲ１００を使用したＰＣＲによってｐｅｍＩＫ遺伝子を増幅し、ｐＥＴ２１ｃｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化して、ＰｅｍＫのＣ末端に（Ｈｉｓ）６タグを有するインフレーム翻訳物を作製した。プラスミドを、ｐＥＴ２１ｃｃ−ＩＫ（Ｈｉｓ）６と命名した。ｐｅｍＩ遺伝子をｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｉを作製した。ＰｅｍＩを、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグおよびその後にトロンビン切断部位を有する融合物（（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩと命名）として発現させた。ｐｅｍＫ遺伝子をｐＢＡＤにクローン化して（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７，４１２１−４１３０）、プラスミドｐＢＡＤ−Ｋを作製した。大腸菌ｍａｚＧ遺伝子をｐＥＴ１１ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧを作製した。ｍａｚＧ遺伝子をｐＩＮＩＩＩベクターにクローン化して（Ｎａｋａｎｏｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６１，３０２−３０７）、プラスミドｐＩＮ−ＭａｚＧを作製した。大腸菌ｅｒａ遺伝子をｐＥＴ２８ａのＳｃａＩ−ＸｈｏＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａを作製した。ｅｒａ遺伝子をｐＩＮＩＩＩベクターにクローン化して、プラスミドｐＩＮ−Ｅｒａを作製した。
タンパク質精製：（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩの精製のために、ｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｉを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入し、１ｍＭ ＩＰＴＧで４時間（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩ発現を誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩタンパク質を精製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にｐＥＴ２１ｃｃ−ＩＫ（Ｈｉｓ）６も誘導した。１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で４時間ＰｅｍＩおよびＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６の同時発現誘導した。Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＰｅｍＩ−ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６複合体を精製した。精製したＰｅｍＩ−ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６複合体からＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を精製するために、ＰｅｍＩ−ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６複合体を５Ｍ塩酸グアニジンに溶解してＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６からＰｅｍＩを放出させた。ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）に再捕捉し、段階的透析によって溶離および再折りたたみを行った。
インビボでのタンパク質及びＤＮＡ合成のアッセイ：ｐＢＡＤ−Ｋを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞を、０．５％グリセロール（グルコースなし）およびアミノ酸混合物（各１ｍＭ）（メチオニンなし）を含む改変Ｍ９培地で成長させた。培地のＯＤ６００が０．６に到達した場合、最終濃度０．２％のアラビノースを添加してＰｅｍＫ発現を誘導した。細胞培養物（１ｍｌ）を表示の測定点で採取し、５μＣｉ［３５Ｓ］−メチオニン（タンパク質合成分析用）または２μＣｉメチル−３Ｈ−チミジン（ＤＮＡ合成分析用）と混合した。３７℃で１分間の組み込み後、以前に記載のようにＤＮＡ複製率およびタンパク質合成率を決定した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５，５０１５１０）。総細胞タンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためのサンプルを調製するために、［３５Ｓ］−メチオニン組み込み反応混合物（５００μｌ）を表示の測定点で取出し、２５μｌの１００％ＴＣＡ溶液および１００μｇ／ｍｌ非放射性メチオニンを含む冷却試験管に添加した。遠心分離によって細胞ペレットを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後オートラジオグラフィに供した。
プライマー伸長分析：Ｔ７プロモーターおよびｍａｚＧ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、Ｔ７プライマー（
（配列番号１４））およびプライマーＧ６（
（配列番号１５））を使用し、テンプレートとしてｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧを使用したＰＣＲ増幅によって得た。Ｔ７プロモーターおよびｅｒａ遺伝子を含む別のＤＮＡフラグメントを、上記と同一のＴ７プライマーおよびプライマーＥ５（
（配列番号１６））を使用し、テンプレートとしてｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａを使用したＰＣＲ増幅によって得た。Ｔ７大量転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｍａｚＧｍＲＮＡおよびｅｒａｍＲＮＡをこれら２つのＤＮＡフラグメントからそれぞれ調製した。ＲＮＡ基質を、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６にて３７℃で１５分間部分的に消化した。消化反応混合物（２０μｌ）は、４μｇＲＮＡ基質、０．２μｇＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６、１μｌ ＲＮアーゼインヒビター、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＤＴＴを含んでいた。部分的消化産物をＲＮＡｅａｓｙカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製して、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６タンパク質を取り出した。プライマーＧ１（
（配列番号１７））、Ｇ２（
（配列番号１８））、Ｇ３（
（配列番号１９））、Ｇ４（
（配列番号２０））、Ｇ５（
（配列番号２１））をｍａｚＧＲＮＡのプライマー伸長分析のために使用し、プライマーＥ１（
（配列番号２２））、Ｅ２（
（配列番号２３））、Ｅ３（
（配列番号２４））、およびＥ４（
（配列番号２５））をｅｒａＲＮＡのプライマー伸長分析のために使用した。プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５’標識した。４２℃で１時間プライマー伸長反応を行った。ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を消化反応混合物に添加しないこと以外は同一の条件下でコントロール実験を行った。プライマー伸長産物を、同一プライマーを使用して調製したＤＮＡ配列決定ラダーに沿って泳動する６％配列決定ゲルで分析した。
ＰｅｍＫによる合成ＲＮＡの切断：３０塩基のＲＮＡ
（配列番号１１）、アンチセンスＲＮＡ
（配列番号２６）、および相補ＤＮＡ
（配列番号２７）を外注で合成した。３０塩基のＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５’末端標識し、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６として使用した。以前に記載のように、３０塩基のＲＮＡの切断産物を、５’末端標識された３０塩基のＲＮＡの部分的アルカリ加水分解によって調製したＲＮＡラダーと共に２０％配列決定ゲル（７Ｍ尿素）に適用した（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｒｏｔｈ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７，１５０７１−１５０７９）。ＰｅｍＫ媒介性ＲＮＡ切断に対するＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖およびＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖形成の効果を、以前に記載のように決定した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。
インビボでのｍＲＮＡに対するＰｅｍＫの効果についてのノーザンブロットおよびプライマー伸長分析：ｐＩＮ−ＭａｚＧプラスミドおよびｐＩＮ−Ｅｒａプラスミドを、ｐＢＡＤ−Ｋを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞に形質転換して、ＢＷ２５１１３／ｐＢＡＤ−Ｋ／ｐＩＮ−ＭａｚＧおよびＢＷ２５１１３／ｐＢＡＤ−Ｋ／ｐＩＮ−Ｅｒａ株をそれぞれ作製した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中にて３７℃で細胞を成長させた。ＯＤ６００値が０．４に到達した場合、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、ｍａｚＧまたはｅｒａｍＲＮＡの合成を誘導した。３７℃でさらに３０分後、最終濃度０．２％のアラビノースを添加してＰｅｍＫの発現を誘導した。ＰｅｍＫ誘導後の異なる時間間隔でサンプルを取り出した。以前に記載のように、ホットフェノール法を使用して総細胞ＲＮＡを単離した（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３２，１３３７−１３４６）。ｍａｚＧまたはｅｒａ遺伝子の全長ＯＲＦを含むＤＮＡフラグメントを使用して、各放射性標識プローブを調製し、ノーザンブロット分析で使用した。プライマーＧ２（ｍａｚＧｍＲＮＡ用）またはＥ１（ｅｒａｍＲＮＡ用）を使用して、プライマー伸長分析を行った。ｌｐｐｍＲＮＡを検出するために、アラビノース添加後の種々の測定点で大腸菌ＢＷ２５１１３／ｐＢＡＤ−Ｋから総細胞ＲＮＡを抽出し、プローブとして放射性標識ｌｐｐＯＲＦ ＤＮＡフラグメントを使用したノーザンブロット分析に供した。プライマーｌｐｐ−Ｃ（
（配列番号２８））を使用して、ｌｐｐ ｍＲＮＡのプライマー伸長分析を行った。
（図面に関する特定の方法の詳細）
図２６。インビボでのＤＮＡ合成およびタンパク質合成に対するＰｅｍＫの効果。（Ａ）ＤＮＡ合成に対するＰｅｍＫの効果。ｐＢＡＤ−Ｋを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞を、炭素源としてグリセロールを含むＭ９培地中にて３７℃で培養した。培養物のＯＤ６００が０．６に到達した場合、最終濃度０．２％のアラビノースを添加してＰｅｍＫ発現を誘導した。材料および方法に記載のように、ＰｅｍＫ誘導後の種々の測定点でのメチル−３Ｈ−チミジン組み込みの検出によってＤＮＡ複製率を測定した。（Ｂ）タンパク質合成に対するＰｅｍＫの効果。材料および方法に記載のように、ＰｅｍＫ誘導後の種々の測定点での［３５Ｓ］−メチオニン組み込みの検出によってタンパク質合成率を測定した。（Ｃ）ＰｅｍＫ誘導後の総細胞タンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。表示のＰｅｍＫの誘導後に細胞培養物（１ｍｌ）を採取し、５μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニンと混合した。３７℃で１分間の組み込み後、［３５Ｓ］−メチオニン組み込み反応混合物（５００μｌ）を、２５μｌの１００％ＴＣＡ溶液および１００μｇ／ｍｌ非放射性メチオニンを含む冷却試験管に入れた。細胞ペレットを遠心分離によって回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィに供した。矢印で示したバンドはＰｅｍＫである。
図２７。無細胞タンパク質合成に対するＰｅｍＫおよびＰｅｍＩの効果。（Ａ）ＰｅｍＫによる無細胞タンパク質合成の阻害。大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて３７℃で１時間タンパク質合成を行った。ｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧからＭａｚＧを発現させ、ｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａから（Ｈｉｓ）６Ｅｒａを発現させた。レーン１、ＰｅｍＫを添加しないコントロール、レーン２、それぞれ５、０．１２５、０，２５、０．５、および１μｇＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を添加した。（Ｂ）ＰｅｍＩによる無細胞系におけるタンパク質合成のＰｅｍＫ媒介性阻害の放出。レーン１、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を添加しないコントロール；レーン２、１μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を含む；レーン３〜５、１μｇＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６と共に、０．５、１、２μｇの（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩを添加した。（Ｃ）タンパク質合成に対するＰｅｍＫを使用した無細胞系のプレインキュベーションの効果。無細胞系をＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を含めるか含めずに３７℃で１５分間プレインキュベートし、その後ｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａプラスミドを添加した。３７℃でさらに１時間タンパク質合成を永続化させた。反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィで分析した。レーン１、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を含まないコントロールプレインキュベーション；レーン２、１μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６とのプレインキュベーションおよびその後のｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａプラスミドの添加；レーン３、１μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６とのプレインキュベーションおよびその後のｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａプラスミドおよび１μｇ（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩの添加；レーン４、１μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６および１μｇの（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩとのプレインキュベーションおよびその後のｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａプラスミドの添加。
図２８。ＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性。（Ａ）ＰｅｍＫによるｍａｚＧｍＲＮＡの切断およびＰｅｍＫ媒介性ＲＮＡ切断に対するＰｅｍＩの阻害効果。レーン１、コントロール、ｍａｚＧｍＲＮＡのみ；レーン２、０．２μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６とインキュベートしたｍａｚＧｍＲＮＡ（１．５μｇ）；レーン３〜６、０．０５、０．１、０．２、および０．４μｇの（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩと共に０．２μｇＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６とインキュベートしたｍａｚＧｍＲＮＡ（１．５μｇ）；レーン７、０．４μｇの（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩとインキュベートしたｍａｚＧｍＲＮＡ（１．５μｇ）。３７℃で１５分間反応を行い、反応生成物を、ＴＡＥ緩衝液を使用した３．５％ネイティブＰＡＧＥによって分析した。（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、および（Ｅ）、ｍａｚＧｍＲＮＡおよびｅｒａｍＲＮＡにおけるＰｅｍＫ切断部位のプライマー伸長アッセイ。材料および方法に記載のように、プライマー伸長実験を行った。各プライマー伸長産物を、同一のプライマーで調製したＤＮＡ配列決定ラダーに沿って泳動する６％配列決定ゲルで分析した。ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６切断部位周囲のＤＮＡ配列ラダーに相補的なＲＮＡ配列を右側に示し、切断部位を矢印で示す。この図では、プライマーＧ１（Ｂ）およびＧ２（Ｃ）で検出したｍａｚＧｍＲＮＡ中のＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６切断部位ならびにプライマーＥ１（Ｄ）およびＥ４（Ｅ）で検出したｅｒａｍＲＮＡ中のＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６切断部位が認められる。
図２９。ＲＮＡ／ＲＮＡ形成によるＰｅｍＫエンドリボヌクレアーゼ活性の阻害。ｍａｚＧｍＲＮＡ中のＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６切断部位周囲に同一配列を使用して３０塩基ＲＮＡを合成した（表ＩＩ、第２列）。（Ａ）３０塩基ＲＮＡ上のＰｅｍＫ切断部位。３０塩基ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰで５’末端標識し、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６と３７℃で１５分間インキュベートした。切断産物を、２０％配列決定ゲルで分析した。レーン１、５’末端［３２Ｐ］標識された１１塩基のＲＮＡサイズマーカー；レーン２、以前に記載のように、部分的アルカリ加水分解によって５’末端［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡから調製したＲＮＡラダー（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ
Ｒｏｔｈ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７，１５０７１−１５０７９）；レーン３、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６によって処理されていない５’末端［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡ；およびレーン４、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６による５’末端［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡの切断構築物。レーン１および４の各バンドのサイズを、その総ヌクレオチド数で示す。（Ｂ）ＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性に対するＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖形成の効果。レーン１、［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡのみ（１ｐｍｏｌ）；レーン２、［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡ（１ｐｍｏｌ）を、０．２μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６と３７℃で１５分間インキュベートした；レーン３〜７、［３２Ｐ］標識３０塩基ＲＮＡ（１ｐｍｏｌ）をその３０塩基アンチセンスＲＮＡと表示の異なる比でアニーリングし、その後０．２μｇのＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６と３７℃で１５分間インキュベートした。反応生成物を、１５％ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィによって分析した。
図３０。インビボでの種々のｍＲＮＡに対するＰｅｍＫ効果のノーザンブロットおよびプライマー伸長分析。（Ａ）ｍａｚＧ、ｅｒａ、およびｌｐｐｍＲＮＡに対するＰｅｍＫ効果のノーザンブロット分析。ｍａｚＧｍＲＮＡおよびｅｒａｍＲＮＡを、ＰｅｍＫ発現を誘導するためのアラビノース（最終濃度０．２％）の添加の３０分前に１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下でそれぞれｐＩＮ−ＭａｚＧおよびｐＩＮ−Ｅｒａから産生させた。ｌｐｐｍＲＮＡを、大腸菌染色体から転写した。総細胞ＲＮＡを、ＰｅｍＫ誘導後の表示の種々の測定点で抽出し、ノーザンブロット分析のために使用した。ＰｅｍＫの誘導を使用しない同一の条件下でコントロール実験を行った。（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）、インビボでのｍａｚＧ、ｅｒａ、およびｌｐｐｍＲＮＡ中のＰｅｍＫ切断部位のプライマー伸長分析。総細胞ＲＮＡを表示の各測定点で抽出し、プライマー伸長実験のために使用した。プライマー伸長産物を、同一プライマーを使用して調製したＤＮＡ配列決定ラダーに沿って泳動した６％配列決定ゲルで分析した。ＰｅｍＫ切断部位周囲のＤＮＡ配列ラダーに相補的なＲＮＡ配列を右側に示し、切断部位を矢印で示す。プライマーＧ２で検出したｍａｚＧｍＲＮＡ（Ｂ）、プライマーＥ１で検出したｅｒａｍＲＮＡ（Ｃ）、およびプライマーｌｐｐ−Ｃで検出したｌｐｐｍＲＮＡ（Ｄ）中のインビボＰｅｍＫ切断部位を示す。
（結果）
インビボでのＤＮＡ合成およびタンパク質合成に対するＰｅｍＫの効果：ｐｅｍＫ遺伝子をｐＢＡＤベクター（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７，４１２１−４１３０）にクローン化してプラスミドｐＢＡＤ−Ｋを作製し、これを大腸菌ＢＷ２５１１３に形質転換した。ＢＷ２５１１３／ｐＢＡＤ−Ｋ中でのＰｅｍＫの発現を、最終濃度０．２％のアラビノースの添加によって誘導した。ＰｅｍＫの誘導後、図２６ＡおよびＢに示した種々の測定点でＤＮＡ複製率およびタンパク質合成率を測定した。ＤＮＡ複製およびタンパク質合成はＰｅｍＫ誘導に影響を受けるが、ＤＮＡ複製の阻害はタンパク質合成よりも有意に低かった。タンパク質合成はＰｅｍＫ誘導から１０分後にその約５０％が急速に阻害される一方で、ＤＮＡ複製では類似の阻害に約１００分かかった。図２６Ｃに示すように、ＰｅｍＫ誘導後の異なる測定点における総細胞タンパク質合成ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＰｅｍＫが細胞タンパク質合成の一般的なインヒビターであることを示す。ＰｅｍＫの誘導後、バンドの強度（矢印で示す）は０〜３０分で増加し、以後減少した。その分子量および誘導速度に基づいて、このバンドは誘導ＰｅｍＫタンパク質の増加を示す。
ＰｅｍＫは無細胞系でタンパク質合成を阻害する：材料および方法に記載のように、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６（Ｃ末端タグ化）を、ＰｅｍＩおよびＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６を同時発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｃｃ−ＩＫ（Ｈｉｓ）６株から精製した。（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩ（Ｎ末端タグ化）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−（Ｈｉｓ）６Ｉ株から精製した。以下のインビトロ実験で、ＰｅｍＫ（Ｈｉｓ）６および（Ｈｉｓ）６ＰｅｍＩを、それぞれＰｅｍＫおよびＰｅｍＩという。ＰｅｍＫがタンパク質合成を阻害するかどうかを決定するために、無大腸菌細胞ＲＮＡ／タンパク質合成系におけるＭａｚＧおよび（Ｈｉｓ）６Ｅｒａの合成に対する精製ＰｅｍＫの効果を試験した。プラスミドｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧからのＭａｚＧの合成およびプラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａからの（Ｈｉｓ）６Ｅｒａの合成を、ＰｅｍＫの非存在下（図２７Ａ、レーン１）または漸増量のＰｅｍＫの存在下（図２７Ａ、レーン２〜５）で大腸菌Ｔ７Ｓ３０抽出物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃で１時間行った。ＭａｚＧおよび（Ｈｉｓ）６Ｅｒａ合成は、用量依存性様式でＰｅｍＫによって遮断された（図２７Ａ）。これらの結果は、ＰｅｍＫがタンパク質合成を阻害し、これはインビボで認められたタンパク質合成のＰｅｍＫ媒介性阻害と一致することを証明する（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。したがって、インビボで認められたＤＮＡ複製の遅延ＰｅｍＫ媒介性阻害（図２６Ａ）は、細胞タンパク質合成阻害の二次的効果に起因すると予想される。興味深いことに、抗毒素ＰｅｍＩの添加によりタンパク質合成のＰｅｍＫ媒介性阻害が遮断され、ＰｅｍＩ用量依存性様式でＭａｚＧおよび（Ｈｉｓ）６Ｅｒａ合成が修復された（図２７Ｂ）。１５分間のプレインキュベーション後にＰｅｍＩをプラスミドＤＮＡと共に添加した場合、（図２７Ｃのレーン１および３と比較して）無大腸菌細胞系のＰｅｍＫとの３７℃での１５分間のプレインキュベーションは（Ｈｉｓ）６Ｅｒａ合成に対して有意な悪影響を及ぼさなかったことに留意すべきである。しかし、ＰｅｍＩの非存在下では、タンパク質は産生されなかった（図２７Ｃ、レーン２）。特に、ＰｅｍＫとの１５分間のプレインキュベーション後にＰｅｍＩを添加するか（図２７Ｃ、レーン３）、１５分間のプレインキュベーション中にＰｅｍＫと共に添加する（図２７Ｃ、レーン４）かどうかに関係なく、（Ｈｉｓ）６Ｅｒａ合成が修復された。これらの結果により、ＰｅｍＫの主な標的はｍＲＮＡであり、ｔＲＮＡ、リボゾーム、および無細胞系におけるタンパク質合成に必要な任意の他の因子ではないことが示唆される。
ＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性：方法と材料に記載のように、Ｔ７プロモーターおよびｍａｚＧ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧを使用したＰＣＲ増幅によって得た。同様に、Ｔ７プロモーターおよびｅｒａ遺伝子を含む別のＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａを使用して得た。次いで、Ｔ７大量転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、これら２つのＤＮＡフラグメントからｍａｚＧｍＲＮＡおよびｅｒａｍＲＮＡをそれぞれ調製した。インキュベーション後にｍａｚＧｍＲＮＡをＰｅｍＫにて３７℃で１５分間より小さなフラグメントに消化する一方で（図２８Ａ、レーン２）、ＰｅｍＩの添加によって用量依存性様式でｍａｚＧｍＲＮＡの切断が阻害された（図２８Ａ、レーン３〜６）。ＰｅｍＩのみではｍａｚＧｍＲＮＡに対して影響を及ぼさなかった（図２８Ａ、レーン７）。基質としてｅｒａｍＲＮＡを使用して、類似の結果が得られた。これらの結果は、ＰｅｍＫがｍＲＮＡを切断してタンパク質合成を阻害するエンドリボヌクレアーゼであり、ＰｅｍＩがＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性を遮断する抗毒素として機能することを証明する。
ＰｅｍＫによって切断されたｍａｚＧｍＲＮＡの消化産物が３．５％ポリアクリルアミドゲル（図２８Ａ）で異なるバンドを形成するという所見は（図２８Ａ）、ＰｅｍＫが特定の部位でＲＮＡを切断することを示す。ｍａｚＧｍＲＮＡはＰｅｍＫによって部分的に消化され、その後、材料および方法に記載のように、５つの異なるオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｇ１〜Ｇ５）を使用したプライマー伸長に供した。６％配列ゲルにて並行して処理したコントロールと比較してｍａｚＧｍＲＮＡに沿って多数の特定の切断部位が検出されたが、ＰｅｍＫ処理しない場合は検出されなかった。ｅｒａｍＲＮＡに沿ってＰｅｍＫ切断部位を検出するために、材料および方法に記載のように、ＰｅｍＫによって部分消化されたｅｒａｍＲＮＡも４つの異なるプライマー（Ｅ１〜Ｅ４）を使用したプライマー伸長に供した。ＰｅｍＫ切断部位周囲の正確な配列を決定するために、各プライマー伸長産物を、同一のプライマーを使用して調製したＤＮＡ配列決定ラダーを含む６％配列決定ゲルで分析した（図２８Ｂ〜Ｅ）。
表ＩＩは、ＰｅｍＫ切断部位周囲のｍＲＮＡ配列を示す。ｍａｚＧｍＲＮＡ（ｐＥＴ１１ａ−ＭａｚＧ由来）、ｅｒａｍＲＮＡ（ｐＥＴ２８ａ−Ｅｒａ由来）、およびｌｐｐｍＲＮＡ（大腸菌染色体ＤＮＡ、図３０Ｄを参照のこと）中のＰｅｍＫ切断部位周囲のｍＲＮＡ配列（矢印で示す）を示す。保存されたＵＡジヌクレオチドを太字で示す。数字は、開始コドンＡＵＧ中のＡ残基の位置を＋１とした、ｍＲＮＡ中のヌクレオチドの位置を示す。
表ＩＩは、プライマー伸長実験によって決定した、ｍａｚＧｍＲＮＡ、ｅｒａｍＲＮＡ、およびｌｐｐｍＲＮＡ中の主な切断部位周囲の配列を示す（ｌｐｐｍＲＮＡについては図３０Ｄを参照のこと）。これらの所見により、ＵＡジヌクレオチドが１つを除いて全ての切断部位に共通であり、主な切断がＵＡＸ（Ｘは、Ｃ、Ａ、またはＵである）配列中のＡ残基の５’部位または３’部位で起こり、唯一の例外は、ＵＧＣ配列中のＵ残基とＧ残基との間で切断が起こることであることが明らかである（表ＩＩ、第７列）。ＵＡＣ配列は、決定された１８個の切断部位のうちの１１個で認められる。
ＵＡＣ配列を含むｍａｚＧｍＲＮＡ中の１つのＰｅｍＫ切断部位周囲の配列に基づいて、３０塩基ＲＮＡ基質をデザインした（表２、第２列）。ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５’末端標識した。全長ｍａｚＧｍＲＮＡを使用したプライマー伸長実験では、ＵＡＣ配列はＡ残基の５’末端のみで切断された（図２８Ｂ）。しかし、３０塩基ＲＮＡは、ＵＡＣ配列中のＡ残基（３０塩基ＲＮＡ中のヌクレオチド１５）の５’部位または３’部位のいずれかで等しく十分に切断された（図２９Ａ）。１５％ネイティブＰＡＧＥでは、３０塩基ＲＮＡ由来の切断産物は１つのバンドとして移動した（図２９Ｂ、レーン２）。アンチセンスＲＮＡをＰｅｍＫの添加前に異なる比で３０塩基ＲＮＡ基質とアニーリングした場合、用量依存性様式でＲＮＡ切断を遮断した（図２９Ｂ、レーン３〜７）。３０塩基ＲＮＡ基質がその相補ＤＮＡと二重鎖を形成する場合、類似の結果が得られた。これらの結果は、３０塩基ＲＮＡ基質中のＰｅｍＫ切断部位がＲＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中で保護されることを示す。したがって、ＰｅｍＫは一本鎖ＲＮＡの配列特異的エンドリボヌクレアーゼであると結論づけることができる。
ＰｅｍＫの誘導時のインビボｍＲＮＡ切断。インビボでのｍＲＮＡに対するＰｅｍＫの効果を試験するために、方法と材料に記載のように、ＰｅｍＫ誘導後の異なる測定点で抽出した総細胞ＲＮＡを使用してノーザンブロット分析およびプライマー伸長分析を行った。ＰｅｍＫ誘導から６０分後の総細胞ＲＮＡサンプルの１％アガロースゲルの視覚化によって明らかとなったように、そのバンド強度に有意な変化が認められなかったので、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡはインビボでＰｅｍＫに対して安定であった。これは、インビボで１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの両方がＰｅｍＫ切断から保護されることを示す。図３０Ａは、ＰｅｍＫの誘導を行うか行わない種々の測定点でのｍａｚＧ、ｅｒａ、およびｌｐｐのｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。ｍａｚＧｍＲＮＡおよびｅｒａｍＲＮＡは、ＰｅｍＫ発現を誘導するためのアラビノース（最終濃度０．２％）の添加前の３０分の１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下でｐＩＮ−ＭａｚＧおよびｐＩＮ−Ｅｒａからそれぞれ産生された。ｌｐｐｍＲＮＡを、大腸菌染色体から転写した。ＰｅｍＫ発現誘導の１０分後にこれら３つ全てのｍＲＮＡを消化する一方で、ＰｅｍＫ誘導を行わない６０分のインキュベーション中では変化は認められなかった（図３０Ａ）。ｍａｚＧおよびｌｐｐのｍＲＮＡと比較して、ｅｒａｍＲＮＡのほとんどがより小さな異なるバンドに変換され、６０分間のＰｅｍＫ誘導中で比較的安定していた。この安定なｍＲＮＡ切断産物の性質は未知である。
インビボでｍＲＮＡ中のＰｅｍＫ切断部位を決定するために、プライマー伸長実験も行った。ｍａｚＧ、ｅｒａ、およびｌｐｐの各ｍＲＮＡについての１つの切断部位を図３０Ｂ、Ｃ、およびＤにそれぞれ示す。全ての場合、ＰｅｍＫ誘導の１０分後にバンドが認められ（図３０Ｂ、Ｃ、および、Ｄのレーン２）、その強度は６０分間のＰｅｍＫ誘導でさらに増加した（レーン２〜６）。注目すべきは、バンドは０分でほとんど検出不可能であり（レーン１）、認められた切断がＰｅｍＫの誘導に起因することを明白に証明する。ｍａｚＧおよびｌｐｐのｍＲＮＡは共にＵＡＣ配列中のＡ残基とＣ残基との間で切断される一方で、ｅｒａｍＲＮＡはＵ残基とＡ残基との間で切断された。ｍａｚＧｍＲＮＡは、インビボおよびインビトロで同一の部位で切断された（図２８Ｃと図３０Ｂとを比較のこと）。ｅｒａｍＲＮＡのインビボ切断は同一プライマーを使用してインビトロで検出された部位と同一の部位でも起こった（図２８Ｄと図３０Ｃとを比較のこと）。ｍａｚＧおよびｅｒａのｍＲＮＡ中の切断ＵＡＣ配列はＭａｚＧ中のＴｙｒ４１およびＥｒａ中のＴｙｒ７をコードする両ＯＲＦの読み取り枠中に存在する一方で、ｌｐｐｍＲＮＡ中の切断ＵＡＣ配列は２つの隣接コドン（Ａｌａ７３のＧＣＵおよびＴｈｒ７４のＡＣＵ）の間に存在する。図３０Ｂ、Ｃ、およびＤに示すように、他の切断事象が検出されないので、ＰｅｍＫによるインビボｍＲＮＡ切断は非常に特異的であった。したがって、リボゾーム上のＡ部位でのコドン特異的ｍＲＮＡ切断を狙撃するＲｅｌＥと異なり（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１２，１３１−１４０；Ｈａｙｅｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，９０３−９１１）、ＰｅｍＫはリボゾームおよびコドン読み取りと無関係の様式でのｍＲＮＡ切断によってタンパク質合成を阻害することができる配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。
（結論）
本発明は、ＰｅｍＫ（ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫアディクションモジュールによってコードされる毒素）が配列特異的エンドリボヌクレアーゼであるという新規の発見に一部関する。インビトロおよびインビボ研究は、ＰｅｍＫが特定の部位でのｍＲＮＡの切断によってタンパク質合成を阻害することを証明する。精製ＰｅｍＫが無大腸菌細胞系でのタンパク質合成を阻害する一方で、ＰｅｍＩの添加によってＰｅｍＫの阻害効果を遮断してタンパク質合成を修復することができる。さらに、ｍＲＮＡはＰｅｍＫによって分解され、ＰｅｍＫ媒介性ｍＲＮＡ切断はＰｅｍＩによって阻害されることを本明細書中で証明する。したがって、ＰｅｍＩは、ＰｅｍＫとの複合体形成によってＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する抗毒素として作用する。エンドリボヌクレアーゼ活性に関して、ＰｅｍＩ−ＰｅｍＫ複合体は不活性である。
ＲＮＡ基質がそのアンチセンスＲＮＡまたは相補ＤＮＡとアニーリングしてＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成する場合にＰｅｍＫ媒介性ＲＮＡ切断が遮断されるので、ＰｅｍＫは本明細書中で一本鎖ＲＮＡに特異性が高いことを示す。この結果はまた、ＰｅｍＫがＵＡＸ（ＸはＣ、Ａ、およびＵである）配列中のＡ残基の５’部位または３’部位を優先的に切断することを証明する。本明細書中に示した結果はまた、ＰｅｍＫによるＲＮＡ切断はリボゾームと無関係であり、ＲｅｌＥ（ｒｅｌＢＥアディクションモジュールによってコードされる毒素）と明らかに異なることを示す。ＲｅｌＥは遊離ＲＮＡを切断することはできないが、リボゾームＡ部位を高いコドン特異性でｍＲＮＡ切断を刺激することができる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ．（２００３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４８，１３８９−１４００；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１２，１３１−１４０；Ｈａｙｅｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，９０３−９１１）。
ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫ系と同一のアディクションモジュールであるｋｉｓ−ｋｉｄ系における以前の研究では、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）はｉｎ ｖｉｔｒｏにてＣｏｌＥ１複製を開始段階で阻害するが、Ｐ４ ＤＮＡ複製に対して有意な効果はないことが報告されている。ＤｎａＢは、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）の阻害作用の標的として提案されている（Ｒｕｉｚ−Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２４７，５６８−５７７）。しかし、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）とＤｎａＢとの相互作用を支持するデータは存在しない。ＣｏｌＥ１複製がＲＮＡＩＩによって開始され、ＲＮＡＩによって阻害される一方で（Ｃｅｓａｒｅｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７，２３０−２３５；Ｄａｖｉｓｏｎ．（１９８４）Ｇｅｎｅ ２８，１−１５）、Ｐ４ ＤＮＡ複製は主にαタンパク質によって調製される（Ｂｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｓｍｉｄ ４５，１−１７）ことに留意することが興味深い。ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩの機構に関与するＲＮアーゼは、ＣｏｌＥ１プラスミド複製の調節で重要な役割を果たすと予想される（Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ ２２，１９５−２００）。ＲＮＡ ＩＩは、いくつかのＵＡＣ配列を含み、そのうちの２つが第１および第２のステム−ループ構造のループ領域中に存在する（Ｔｏｍｉｚａｗａ ａｎｄ Ｉｔｏｈ．（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１，５７５−５８３；Ｔｏｍｉｚａｗａ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３８，８６１−８７０）。したがって、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）によるＣｏｌＥ１ ＤＮＡ複製の阻害は、そのエンドリボヌクレアーゼ活性によるＲＮＡＩＩの分解に起因する可能性が高い。さらに、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）（細菌中の毒素）が種々の真核細胞の成長を阻害するという事実（ｄｅ ｌａ Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＥｍｂｏＪ２２，２４６−２５１）を、そのＤｎａＢとの相互作用よりもむしろ細胞ｍＲＮＡに対するそのエンドリボヌクレアーゼ活性によって容易に説明することができる。
ＰｅｍＫホモログは広範な細菌で同定されている。ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）およびＣｈｐＢＫは、大腸菌における２つのＰｅｍＫ様タンパク質である（Ｓａｎｔｏｓ Ｓｉｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １６８，５１−５８；Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５，６８５０−６８５６；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３２，８０９−８１９）。ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）（ｍａｚＥＦアディクションモジュールによってコードされる毒素）はＰｅｍＫと２５％同一であり、ＣｈｐＢＫ（ｃｈｐＢアディクションモジュールによってコードされる毒素）はＰｅｍＫと４１％同一である。特に、ＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）およびＣｈｐＢＫは、ＲｅｌＥと類似の様式でのｍＲＮＡの切断によって翻訳を阻害することが公知である（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。しかし、本発明者らは、最近、ＭａｚＦがリボゾームと無関係に作用し、特定の配列での一本鎖ｍＲＮＡの切断によってタンパク質合成を阻害するエンドリボヌクレアーゼであることを証明した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２，９１３−９２３）。ＭａｚＦは、ＡＣＡ配列の残基Ａと残基Ｃとの間でｍＲＮＡを優先的に切断する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。
Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）タンパク質の結晶構造はホモ二量体と決定されている（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ）１０，１４２５−１４３３；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５８，３５５−３５８）。ＭａｚＦの構造は決定されていないが、Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ（２００３）は、２つのＭａｚＦホモ二量体および１つのＭａｚＥホモ二量体から形成されたＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体（ＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２）の結晶構造を報告している。興味深いことに、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）ホモ二量体の構造およびＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体中のＭａｚＦホモ二量体の構造は類似している。しかし、ＭａｚＥ結合ＭａｚＦホモ二量体中のβ鎖であるＳ１とＳ２との間の保存ループ（Ｓ１−Ｓ２ループと呼ぶ）は溶媒に突出してほとんどが無秩序である一方で、２つの対応するループはＫｉｄ（ＰｅｍＫ）ホモ二量体中の「閉じた」高次構造中に存在する（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，８７５−８８４）。Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）ホモ二量体構造中のＳ１−Ｓ２ループは、基本的表面および保存された疎水性ポケットを覆う空洞様構造を形成する。保存された疎水性ポケットは、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体形成におけるＭａｚＥ認識で不可欠な役割を果たす（Ｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。本発明者らは、ＭａｚＥの高度に負電荷のＣ末端の伸長は一本鎖ＲＮＡを模倣して、ＭａｚＦホモ二量体中のＳ１−Ｓ２ループ間に結合することができることを提案している（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。ＰｅｍＩは、ＰｅｍＫのエンドリボヌクレアーゼ活性を遮断するために非常に類似の様式でＰｅｍＫに結合すると予測される。
ＰｅｍＫおよびＭａｚＦは共に、本発明者らによって一本鎖ＲＮＡの配列特異的なエンドリボヌクレアーゼとして特徴づけられたが、その生理学的機能は、ＲＮアーゼＥ、Ａ、およびＴ１などの他の公知のエンドリボヌクレアーゼと異なるようである。ＰｅｍＫおよびＭａｚＦは、細胞ｍＲＮＡの機能の妨害による一般的なプローブ合成インヒビターとして機能する。ｍｉｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ妨害相補ＲＮＡ）（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１，１９６６−１９７０）、 ｍｉＲＮＡ（Ａｍｂｒｏｓ．（２００１）Ｃｅｌｌ １０７，８２３−８２６）、およびｓｉＲＮＡ（Ｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，１４４２８−１４４３３）などの小ＲＮＡが特定の標的ＲＮＡの機能を妨害することが周知である。リボザイムはまた、標的ＲＮＡに対して特異的に作用してその機能を妨害する（Ｐｕｅｒｔａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２７，７５−９７）。本発明者らは、ＰｅｍＫおよびＰｅｍＫホモログ（ＭａｚＦが含まれる）が、特定の配列でｍＲＮＡを切断させる新規のｍＲＮＡ妨害機構を有する新規のエンドリボヌクレアーゼファミリーを形成することを提案する。このようなものとして、これらを本明細書中で「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と命名した。以前に報告されているように、Ｋｉｄ（ＰｅｍＫ）はヒト癌細胞でアポトーシスを誘発する一方で、Ｋｉｄ（ＰｅｍＩ）はＫｉｄ（ＰｅｍＫ）の毒作用を阻害する（ｄｅ ｌａ Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）ｓｕｐｒａ）。したがって、この新規の調節可能なｍＲＮＡ妨害系は、ヒト疾患の治療介入（例えば、遺伝子治療）に有用であり得る。
（実施例Ｖ）
本明細書中に示すように、ＰｅｍＫは、ＵＡＸ配列（ＸはＣ、Ａ、またはＵである）で細胞ｍＲＮＡを切断する高配列特異性エンドリボヌクレアーゼとして機能する。このような活性は、細胞中でのタンパク質合成を部分的または完全に阻害することができる。ＲＮＡ転写物中のＵＡＸ配列（ＸはＣ、Ａ、またはＵである）の予想される頻度は、４つのヌクレオチドのうちの任意の１つが第１の２つのヌクレオチド位置にそれぞれ組み込まれ、３つの示したヌクレオチドのうちの任意の１つが第３のヌクレオチド位置に組み込まれる確率が等しいと予想する標準的な計算に基づいて３／６４である。いくつかのＲＮＡ転写物は予想される頻度と比較してＵＡＸ配列の頻度が低いか高いと理解すべきである。したがって、特異的ＲＮＡ転写物または関連するＲＮＡ転写物ファミリーのＰｅｍＫエンドリボヌクレアーゼによる切断に対する感受性は、転写物中のＵＡＸ配列またはＰｅｍＫ標的配列の頻度に依存する。さらに、当業者は、ＲＮＡ転写物の配列に基づいて、ＰｅｍＫ媒介切断に対する転写物の感度を予想することができる。
（実施例ＶＩ）
本発明のＲＮＡインターフェラーゼ（一般に、特異的ＲＮＡインターフェラーゼ）を使用して、バックグラウンド（非特異的）タンパク質産生が劇的に減少するか消滅して「単一タンパク質」合成系が得られるインビボおよびインビトロタンパク質産生系の構成要素として役立つこともできる。「単一タンパク質」合成系を使用して発現したタンパク質は、本質的に夾雑タンパク質を含まないので、「純粋な」タンパク質調製物が遊離であるか必要な適用に有用である。このような適用には、精製しないタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析および他のタンパク質（膜タンパク質が含まれる）の構造決定法が含まれるが、これらに限定されない。膜タンパク質の分析に関して、本発明の方法を使用して作製した膜タンパク質調製物は、固相ＮＭＲを含むプロトコールに十分に適合している。好ましい態様では、本発明の方法を使用して、細胞状況で放射性同位体で特定の膜タンパク質を排他的に標識するのに役立ち得る。その後、標識された膜タンパク質を内因性細胞機構を介して適切な細胞膜に組み込み、その標識によって容易に検出する。
インビボまたはインビトロ適用のいずれかのための単一タンパク質合成系を構築するために、系を、これらのｍＲＮＡからのタンパク質合成を遮断するために内因性ｍＲＮＡを切断するｍＲＮＡインターフェラーゼ（例えば、ＰｅｍＫおよび／またはＭａｚＦ）で前処理する。インビボでこのような前処理を行うために、ｍＲＮＡインターフェラーゼの調節可能な遺伝子を細胞または組織に移入し、その発現を誘導した。発現した外因性遺伝子を細胞および／または組織に移入する方法を本明細書中に記載し、これは当該分野で公知である。ｍＲＮＡインターフェラーゼをインビトロで前処理するために、精製したｍＲＮＡインターフェラーゼをインビトロで翻訳系に添加する。種々のインビトロ翻訳系は当該分野で公知であり、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、および大腸菌由来の抽出物からなるが、これらに限定されない。これらのインビボ系またはインビトロ系のいずれかでの「単一タンパク質」の産生のために、所望のタンパク質をコードする遺伝子構築物を、全ｍＲＮＡインターフェラーゼ−標的配列が除去されたｍＲＮＡを転写するように操作する。この手順により、「単一タンパク質」発現系に添加したｍＲＮＡインターフェラーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性に感受性を示さないｍＲＮＡが得られる。本発明のこのような操作ｍＲＮＡ転写物を、本明細書中で「インターフェラーゼ耐性ｍＲＮＡ」という。例えば、操作構築物からのその発現の誘導によってインターフェラーゼ耐性ｍＲＮＡを発現させる。インターフェラーゼ耐性ｍＲＮＡは、本質的には、ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性に感受性を示す本質的に任意の他のタンパク質の翻訳の非存在下でタンパク質に翻訳され、それによって本質的に単一タンパク質サンプルを産生する。このアプローチを、原核生物系または真核生物系のいずれかに適用することができる。
ｍＲＮＡインターフェラーゼでの処理をインターフェラーゼ耐性ｍＲＮＡの発現／誘導または付加と同時に行うこともできると理解すべきである。このようなアプローチを、単一タンパク質系を指示する本発明のインビトロまたはインビボ（細胞ベースの）系のいずれかと組み合わせて使用することができる。
細胞ベースの発現系：ＭａｚＦが一本鎖ＲＮＡのみに対して機能的な配列特異的（ＡＣＡ）エンドリボヌクレアーゼであるとういう点で（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３，ｓｕｐｒａ）、細胞ベースの「単一タンパク質」合成系を、このような適用におけるＭａｚＦの有用性を例示するために開発した。
したがって、単一タンパク質合成系を、細菌細胞中の成熟ヒトエオタキシンを合成するために開発した。この目的を達成するために、野生型エオタキシンアミノ酸配列をコードする新規の核酸配列を合成した。この新規核酸配列から転写したＲＮＡ分子はＡＣＡ配列を欠く。図３５の配列番号３０〜３１（それぞれ成熟エオタキシンの核酸およびアミノ酸）を参照のこと。成熟ヒトエオタキシンをコードするこの新規の核酸配列を、低温でのインキュベートによって誘導されたＩＰＴＧの存在下でタンパク質を発現する冷ショックベクター（ｐＣＯＬＤＩ）にクローン化した。図３６を参照のこと。この発現系の有意な利点は、非特異的タンパク質発現のバックグラウンドが低いことである。
目的のポリペプチドをコードする核酸配列を種々のアプローチを使用して作製することができると理解すべきである。このようなアプローチには、核酸配列がＡＣＡ配列を欠く目的のポリペプチドをコードすることができる合成核酸配列のデザインおよび作製、目的のポリペプチドをコードすることができる核酸配列の単離、および変異がコードされたアミノ酸配列に関してサイレントであるトリプレット配列を変化させるための各ＡＣＡ配列の変異が含まれる。
（方法および材料）
（ｐＣｏｌｄIベクターでの冷ショック誘導）
ｐＣｏｌｄIベクターはｌａｃオペレーターを含むので、この調節エレメントによって
調節される遺伝子の発現を誘導するために１ｍＭ ＩＰＴＧを添加する。いくつかのタンパク質のために、細胞が対数中期（ＯＤ６００＝０．４〜０．７）に到達した後に、タンパク質折りたたみを改良するために１５℃でインキュベートすることが好ましい。タンパク質収率を最適にするように適合した最良の条件を決定するために、誘導後の異なる時間間隔でサンプルを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で評価した。一般に、ＬＢ培地中に細胞を維持しながら発現を誘導するが、放射性同位体（例えば、１５Ｎまたは１３Ｃ標識）でタンパク質を標識すること望ましい場合、Ｍ９またはＭＪ９培地を使用する。
ｐＣｏｌｄIベクターのＳＤ部位からマルチクローニング部位までのヌクレオチド配列を以下に示す。発現タンパク質は、転写強化ｃｉｓエレメントである下流ボックス（ＤＢ）、Ｈｉｓ６タグ、および第Ｘａ因子部位からなるＮ末端の１５残基の除去可能な配列、ならびにその後のマルチクローニング部位を含む。
ｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシン（本明細書中でｐＳＰエオタキシンともいう）の構築のために、上記の太字の斜体で示した２つのＡＣＡ配列を、ＭａｚＦインターフェラーゼの認識部位を除去するためにＡＴＡを変化させる。
本発明の方法を、任意の発現ベクターまたは発現ベクター系（例えば、ｐＥＴベクター）と共に使用することができると認識すべきである。ｐＣｏｌｄベクターを例示的ベクターとして示し、上記例は本発明の範囲を制限することを意図しない。
（図面に関する特定の方法の詳細）
図３７。ｐＡＣＹＣｍａｚＦおよびｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンを含むｐＡＣＹＣｍａｚＦまたはＢＬ２１（ＤＥ３）を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、適切な抗生物質を含むＭ９−グルコース培地中で成長させた。培養物のＯＤ６００が０．５に到達した場合、培養物を１５℃に１５分間シフトし、１ｍＭ ＩＰＴＧを培養物に添加した。表示の時間間隔で、１ｍｌの培養物を取り出し、１０μＣｉの３５Ｓ−メチオニンを含む試験管に添加した。１５分間のインキュベーション後（パルス）、０．２ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌメチオニンを添加し、５分間インキュベートした（チェイス）。標識された細胞をＭ９−グルコース培地で洗浄し、１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に懸濁した。１０μｌの各サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィによって分析した。
（結果）
成熟ヒトエオタキシンをコードする新規の核酸配列を含むｐＣＯＬＤＩをテンプレートとして使用した。図３６を参照のこと。得られたプラスミドを、ｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンと命名した。Ｔ７プロモーターの調節下でｍａｚＦ遺伝子を含むプラスミドｐＡＣＹＣｍａｚＦを、ＭａｚＦ発現の誘導のために使用した。ｐＡＣＹＣｍａｚＦのみまたはｐＡＣＹＣｍａｚＦおよびｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンを含む大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）細胞を、適切な抗生物質を含むＭ９−グルコース培地中で成長させた。培養物のＯＤ６００が０．５に達した場合、培養を１５℃で１５分間にシフトし、１ｍＭのＩＰＴＧを培養物に添加した。表示の時間間隔後、１ｍｌの培養物を、１０μＣｉ３５Ｓ−メチオニンを含む試験管に添加した。標識（パルス）の存在下で１５分間のインキュベーション後、０．２ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌメチオニンを添加し、培養物を５分間インキュベートした（チェイス）。標識された細胞をＭ９−グルコース培地で洗浄し、１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に懸濁した。１０μｌの各サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のオートラジオグラフィによって分析した。以前に記載のように、ｍａｚＦ遺伝子の発現によってＢＬ２１（ＤＥ３）細胞におけるタンパク質合成が阻害された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３，ｓｕｐｒａ）。しかし、ＡＣＡ配列を含まないｍＲＮＡによってコードされる成熟ヒトエオタキシンの合成は、ｍａｚＦ発現によって阻害されなかった。図３７を参照のこと。この結果は、本発明の単一タンパク質産生方法を使用して、大量の単一タンパク質を得ることができることを証明する。
注目すべきことは、ｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンのみを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を適切な抗生物質を含むＭ９−グルコース培地中で成長させる並行実験も行った。このような実験により、この系でのＭａｚＦ発現の効果があきらかとなる。ＭａｚＦ誘導の非存在下でｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンを保有する細胞に冷ショックを与えた場合、大量のバックグラウンド大腸菌タンパク質もヒトエオタキシンと共に産生された。上記のように、ＭａＦをエオタキシンと共に誘導する場合、細胞タンパク質バックグラウンドが劇的に減少する。３時間のＭａｚＦ誘導後、バックグラウンドタンパク質合成はほとんど完全に消失し、単一タンパク質（すなわち、ヒトエオタキシン）のみを産生し続けることができる細胞が作製される。
エオタキシン産生が少なくとも７２時間持続し、エオタキシン産生率は最初の３６時間変化せず、ほぼ３日間ＭａｚＦ発現による細胞のタンパク質合成能力が影響をうけないことを示す。これは、リボゾーム、ｔＲＮＡ、タンパク質合成に必要な全ての他の細胞成分はＭａｚＦ誘導の影響を受けないことを証明する。これらの結果はまた、エネルギー代謝およびヌクレオチド合成ならびにアミノ酸生合成はＭａｚＦ発現に大きな影響をうけないことを意味する。
ＭａｚＦ発現が誘導された細胞培養物の７２時間のインキュベーション中にＯＤ６００（０．５）は増加せず、ＭａｚＦ誘導後の細胞成長が完全に阻害される一方で、細胞は完全なタンパク質合成能力を維持することを示すことも注目すべきである。しかし、ＭａｚＦ誘導の非存在下で、バックグラウンド細胞タンパク質の産生によって証明したところ、ＯＤ６００は、１５℃で７２時間のインキュベーション時に０．５〜１．２に増加する。
上記発現系におけるエオタキシンの産生レベルを決定するために、同量の培養物単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。３６時間の冷ショック後、明確に検出可能な染色エオタキシンバンドが明らかとなり、総細胞タンパク質の約５％を占める。上記のように、Ｍ９最少培地を使用して、これらの結果を得た。Ｍ９培地の使用は、１３Ｃ−グルコースおよび１５Ｎ−ＮＨ４Ｃｌを使用したタンパク質の同位体濃縮で重要である。しかし、非標識タンパク質を大量に産生することが望ましい場合、Ｌ−ブロス（ＬＢ）培地などの富化培地を代わりに使用することができる。実際、本発明者らは、エオタキシン産生は、ＬＢ培地中でインキュベートした培養物中の総細胞タンパク質の２０％または４０ｍｇ／ｌ培養物（２５リットルの培養物中１ｇ）にもなりうることを見出した。Ｍ９培地またはＬＢ倍地のいずれかでインキュベートした細胞で産生されたエオタキシンは完全に可溶性であり、封入形態（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍ）を形成しないことに留意することが重要である。
上で示すように、冷ショックインキュベーション中に細胞成長が完全に阻害されるので、細胞塊はインキュベーション期間中増加しない。したがって、細胞機構は、この単一タンパク質産生（ＳＰＰ）系における冷ショック時のｐＣｏｌｄベクター中のクローン化遺伝子の産生に排他的に提供される。したがって、ＭａｚＦ誘導時、細胞培養物を細胞が成長する条件下で維持された生存度と一致しない程度に濃縮することができる。実際、本発明者らは、指数関数的に成長している培養物を、クローン化遺伝子産物の収率に影響を与えることなく少なくとも４倍（ＯＤ６００は０．７〜２．８）に濃縮することができると判断した。これは、細胞が成長する通常の培養に使用した培地の２５％しか使用しなくて良いことを意味する。言い換えれば、１ｇのヒトエオタキシンをたった６．５リットルのＬＢ培地を使用して潜在的に産生することができる。この特徴がＮＭＲ構造研究のために大量のタンパク質または同位体富化タンパク質の発現に関与する費用を劇的に減少させるので、これは特に本発明のＳＰＰ系の関連する利点である。
無細胞発現系：ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、および大腸菌由来の抽出物は、最も頻繁に使用されている無細胞翻訳系を含む。これら全てを、外因性ＲＮＡの翻訳に必要な高分子成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボゾーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、開始因子、伸長因子、および終結因子など）を含む粗抽出物として調製する。一般に、各抽出物に、効率的な翻訳を確実にするためのアミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系のためのリン酸クレアチンおよびクレアチンホスホキナーゼ、大腸菌溶解物のためのホスホエノールピルビン酸塩およびピルビン酸キナーゼ）、および他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）を補足する。
使用した遺伝物質（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）によって、インビトロタンパク質合成への２つのいずれのアプローチが有用であるかが決定される。網状赤血球溶解物などの標準的な翻訳系はテンプレートとしてＲＮＡを使用するのに対して、「結合」および「結合」系はＲＮＡに転写されてその後翻訳されるＤＮＡテンプレートを使用する。
ウサギ網状赤血球溶解物：ウサギ網状赤血球溶解物は、外因性ＲＮＡの翻訳で使用される有効なインビトロ真核生物タンパク質合成系である（天然または操作）。網状赤血球は、主にそのインビボ機能が主に網状赤血球によって合成されたタンパク質の９０％を超えて含むヘモグロビンの合成に関する。これらの未熟な赤血球は、十分なグロビンｍＲＮＡおよび細胞翻訳系の要素を含む、大量のグロビンタンパク質（上記で詳述されており、当該分野で公知である）の産生に必要な全機構を保有する。内因性グロビンｍＲＮＡをＣａ２＋依存性小球菌ヌクレアーゼとのインキュベーションによって消失させることができ、その後ＥＧＴＡによるＣａ２＋のキレート化によって不活化される。このようなヌクレアーゼ処理溶解物は、バックグラウンドが低く、かつ低濃度でさえも外因性ＲＮＡを有効利用する。外因性タンパク質を、インタクトな網状赤血球で認められるものに近い速度で合成する。未処理または処理網状赤血球溶解物のいずれかを、キャッピングまたは非キャッピングＲＮＡ（真核生物またはウイルス）のいずれかからの巨大タンパク質の合成に使用することができる。
コムギ胚芽抽出物：コムギ胚芽抽出物が低レベルの内因性ｍＲＮＡによって最小のバックグラウンド組み込みを示すという点で、ウサギ網状赤血球抽出物の代替物として都合がよい。コムギ胚芽抽出物は、種々の異なる生物（ウイルス、酵母、高等植物、および哺乳動物由来のものが含まれる）から外因性ＲＮＡを効率的に翻訳する。これは、ウサギ網状赤血球溶解物を示す二本鎖ＲＮＡの小フラグメントまたは酸化チオールを含むＲＮＡを翻訳するための好ましい系である。
キャッピングまたは非キャッピングＲＮＡテンプレート：網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽抽出物は共にインビトロ転写ＲＮＡまたは細胞もしくは組織から単離されたＲＮＡの翻訳のための有効な系である。５’キャップ構造の存在は、使用ＲＮＡがインビトロで合成された場合に翻訳活性を増強することができる。コムギ胚芽抽出物による翻訳は、一般に、網状赤血球溶解物の抽出物による翻訳よりキャップ依存性が高い。望ましいと決定された場合、無大腸菌細胞系でＤＮＡテンプレートから直接発現することができる原核生物ベクターへのコード配列のサブクローニングによって、ＲＮＡキャッピングを行うことができる。
標準的な翻訳反応では、精製ＲＮＡを翻訳のテンプレートとして使用する。他方では、「連結」および「結合」系は、テンプレートとしてＤＮＡを使用する。ＤＮＡからＲＮＡが転写され、その後いかなる精製も行わずに翻訳される。このような系は、典型的には、原核生物ファージポリメラーゼプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）を含むテンプレートＤＮＡが必要である。ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、原核生物ファージのもの）は、ＤＮＡをＲＮＡに転写し、真核生物または原核生物抽出物はＲＮＡからタンパク質に翻訳する。転写：翻訳反応のためのＤＮＡテンプレートをプラスミドベクターにクローン化するか、ＰＣＲによって作製することができる。「連結」系は、バクテリオファージポリメラーゼを使用する転写およびウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽溶解物でのその後の翻訳を含む２工程反応である。転写および翻訳反応を個別または同時に行うことができる。
大腸菌抽出物：転写および翻訳が連続的に起こる真核生物系と異なり、大腸菌では転写および翻訳が同時に起こる。したがって、インビトロ大腸菌翻訳系は、１工程反応を含む。転写中、リボゾーム結合のためにＲＮＡの５’末端が利用可能になり、翻訳される一方で、３’末端は依然として転写される。リボゾームのＲＮＡへの初期の結合により、転写物の安定性が維持され、効率的な翻訳が促進される。したがって、細菌翻訳系は、原核生物または真核生物の遺伝子産物の迅速な発現に十分に適している。好ましい実施形態では、シャイン−ダルカルノリボゾーム結合部位は、高タンパク質収率および最適な開始忠実度を促進するために使用されるＤＮＡテンプレートの開始コドンの上流に含まれる。真核生物ＲＮＡのキャッピングは大腸菌翻訳系で必要ない。
大腸菌抽出物はまた、真核生物溶解物における交差反応性または内因性タンパク質に関連する他の問題が減少または消失するという点でさらなる利益を付与する。さらに、天然の大腸菌プロモーター配列（ｌａｃまたはｔａｃなど）を含むＤＮＡベクターから大腸菌Ｓ３０抽出物系を発現することができる。無大腸菌細胞系は、内因性ｍＲＮＡ中に豊富な粗抽出物からなる。転写／翻訳で使用するための抽出物を調製するために、内因性ｍＲＮＡを翻訳させるためにインキュベートし、その後分解する。このような調製溶解物中の得られた低レベルの内因性ｍＲＮＡにより外因性合成産物を同定することができる。
真核生物翻訳シグナル：原核生物と真核生物とのｍＲＮＡ転写物の間に考慮すべきいくつかの有意な相違が存在する。真核生物ｍＲＮＡは、通常、以下の２つの転写後修飾によって特徴づけられる：５’−７−メチル−ＧＴＰキャップおよび３’ポリ（Ａ）テール。これらの修飾は共に成熟前分化の防止によるｍＲＮＡの安定性に寄与する。５’キャップ構造はまた、真核生物リボゾームへの結合の促進および適切なＡＵＧ開始コドンの認識の確保によってｍＲＮＡの翻訳を増強する。コンセンサス配列（すなわち、「コザック」配列）は、一般に、真核生物ｍＲＮＡ中で最も強力なリボゾーム結合シグナルと考えられている。効率的な翻訳開始のために、重要なエレメントはコザック配列の＋１位のＧ残基および−３位のＡ残基である。安定な二次構造を欠く適度な長さの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む場合、コザックコンセンサス配列を欠くｍＲＮＡを、無真核細胞系で効率的に翻訳することができる。
原核生物翻訳シグナル：リボゾームは、細菌中のシャイン−ダルカルノ（ＳＤ）配列と呼ばれるプリンリッチ領域によってＡＵＧ開始部位に導かれる。この配列は、３０Ｓリボゾームサブユニット中の１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端に相補的である。開始ＡＵＧコドンの上流に存在するＳＤ領域は、当該分野で公知のコンセンサス配列を含む。特異的ｍＲＮＡは、２〜９またはそれ以上ほどの範囲の１６ＳｒＲＮＡの抗シャイン−ダルカルノ配列に相補的なヌクレオチド数で非常に変化する。ＡＵＧイニシエーターに対するリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）の位置は、翻訳効率に非常に重要である（通常、開始部位のＡに対して−６〜−１０）。
（実施例ＶＩＩ）
本発明はまた、簡単な生化学的手順を含む、大量の小一本鎖ＲＮＡの産生方法を含む。この方法の開発により、大量のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを産生することができ、例えば、高額な化学合成手順を必要としない。
簡単に述べれば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ中で縦列に反復されている複数の短い同一の配列を含むＲＮＡを合成する。ＲＮＡ中の縦列反復配列を、本発明のＭａｚＦ（ＡＣＡ配列を特異的に切断）またはＰｅｍＫ（例えば、ＵＡＣ配列を特異的に切断）などの本発明のＲＮＡインターフェラーゼによって特異的に切断することができるトリプレット配列によって分離する。組み込まれた部位を認識するｍＲＮＡインターフェラーゼを含むインターフェラーゼ認識配列（すなわち、特異的トリプレット配列）によって分離された縦列反復配列を含むＲＮＡのその後の処理により同一の小ＲＮＡが得られる。
（実験アプローチ）
２１量体
（配列番号３４）の産生。
工程１：以下の２つの２１量体のＤＮＡフラグメントの合成（５’末端をリン酸化している）
（配列番号３５）
（配列番号３６）
工程２：多量体を得るためのライゲーション
工程３：以下の２つのプライマーを使用したＰＣＲ：
工程４：（工程３）からのＤＮＡフラグメントを使用したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ産生。
工程５：反応（工程４）由来のＲＮＡ産物のＭａｚＦ処理および２１量体産物の生成。
いくつかの適用のために、ニッケルカラムを使用して反応混合物から除去することができるＨｉｓタグ化Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＭａｚＦを使用することが有利であり得る。
当業者は、所望のＲＮＡ配列の核酸配列中のＡＣＡトリプレットの存在によりＲＮＡ消化のためのインターフェラーゼとしてのＭａｚＦの使用を不可能にすることを認識する。このような環境下では、ＵＡＣ（ＵまたはＡ）トリプレット配列に特異的なＰｅｍＫを、例えば、ＭａｚＦの代わりに使用することができる。簡単に述べれば、問題のＲＮＡ配列の分析によって、存在する場合にどのような公知のＲＮＡインターフェラーゼの認識部位が存在するのかが決定されるはずである。このような分析は、どのＲＮＡインターフェラーゼが特定のＲＮＡに関する適用に有用であるのかの評価に有用である。
したがって、本発明は、簡単な生化学的手段を使用した大量の高品質の小ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）の産生方法を記載する。したがって、本方法は、小ＲＮＡの化学合成に関する高価で技術的に困難なプロトコールに対する費用効果のある代替法を提供する。
（実施例ＶＩＩＩ）
ｍＲＮＡインターフェラーゼによる細胞死の誘導。誘導された場合、ＭａｚＦおよびＰｅｍＫは、配列特異的様式で細胞ｍＲＮＡを切断してタンパク質合成を効率的に阻害し、細胞成長阻害および細胞死を引き起こす。ＰｅｍＫ（Ｋｉｄ）発現は、酵母、アフリカツメガエル、およびヒトの細胞における細胞増殖を阻害することが証明されている。これらの細胞中のＰｅｍＩ（Ｋｉｓ）の同時発現は細胞増殖を修復し、それによってＰｅｍＫの阻害効果から細胞が放出される（ｄｅ ｌａ Ｃｕｅｖａ−Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ）。下記のように、ヒト細胞に体するＭａｚＦ誘導の効果を試験した。本実施例ではＴ−Ｒｅｘ系を使用してＭａＦの誘導を調節しているが、当業者は任意の誘導性発現系を本発明の状況で使用することができると認識する。誘導系の選択は、いくつかの実験上の検討項目（誘導される細胞型、所望の発現レベル、および誘導速度が含まれるが、これらに限定されない）に基づく。
プラスミドおよび細胞型：大腸菌ＭａｚＦ遺伝子を、テトラサイクリンオペレーターＴｅｔＯ２の調節下でｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ− ＭａｚＦを作製する。ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＭａｚＦプラスミドをＴ−Ｒｅｘ−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質添加して、ＭａｚＦの発現がテトラサイクリンの添加によって誘導されるＴ−Ｒｅｘ ２９３／ＭａｚＦ細胞株を作製した。大腸菌ｍａｚＥ遺伝子をｐｃＤＮＡ３ベクターにクローン化して、ｐｃＤＮＡ３−ＭａｚＥを作製する。ｐｃＤＮＡ３−ＭａｚＥをＴ−Ｒｅｘ ２９３／ＭａｚＦ細胞に形質転換して、Ｔ−Ｒｅｘ ２９３／ＭａｚＦ／ＭａｚＥ細胞株を作製する。
ヒト細胞に対するＭａｚＦの毒作用：テトラサイクリンの存在下で、Ｔ−Ｒｅｘ ２９３／ＭａｚＦ細胞中にＭａｚＦ発現を誘導する。種々の測定点で、細胞集団中の死細胞を、トリパンブルー溶液（０．４％）（Ｓｉｇｍａ）からなる細胞生存色素での染色によって計数する。同一条件下であるがテトラサイクリンの非存在下でコントロール実験を並行して行う。図３８に示すように、ＭａｚＦを発現するように誘導されたＴ−Ｒｅｘ ２９
３／ＭａｚＦ細胞の細胞形態は、コントロール（非誘導）細胞と比較してＭａｚＦ誘導の第１日目で劇的に変化する。明らかに、ＭａｚＦを発現するように誘導された細胞の約５０％が５日目までに死滅し、誘導細胞の約８０％が７日目までに死滅する（図３８）。これらの結果は、ＭａｚＦがヒト細胞に有毒であることを証明する。
本発明は、その発現が誘導性調節エレメントに応答するかそれによって調節される任意の適切なｍＲＮＡインターフェラーゼの使用を含む。適切なｍＲＮＡインターフェラーゼには、ある細胞の状況で発現した場合に毒作用を媒介することができるものが含まれる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡインターフェラーゼが発現される細胞は哺乳動物細胞である。本発明の例示的ｍＲＮＡインターフェラーゼには、大腸菌ＭａｚＦのオルソログおよびホモログが含まれる。
したがって、本発明はまた、遺伝子治療への適用における本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼの使用を含む。被験体（例えば、ヒト被験体）が欠陥または欠損している分子を発現するように操作した細胞を、その発現が誘導性調節エレメントによって調節される本発明のｍＲＮＡインターフェラーゼの組み込みを介して自己破壊するようにデザインすることもできる。遺伝子治療に適用するために使用される細胞破壊のための誘導手段の組み込みによってフェイルセーフ機構が得られ、それによって被験体に有利な効果を付与した後および／または悪影響を及ぼし得る前にこのような細胞を消失することができる。
（実施例ＩＸ）
ＭａｚＦ変異体の作製：２４位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したＭａｚＦ変異体（Ｅ２４Ａ）を作製した。変異の結果として、合成基質を使用して測定したｍＲＮＡインターフェラーゼ活性は約１／１０に減少する。ＭａｚＦ活性のこの減少は、種々の理由で重要である。第１に、変異の結果として、ＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ）変異体が発現する宿主細胞に対する毒性が有意に減少する。毒性の減少によって、細胞中でのＭａｚＦ変異体の産生レベルが増加させることができる。例えば、ｐＥＴ２８ａ系で使用する場合、ＭａｚＦが合理的に大量に産生された（精製後に約１５ｍｇ／ｌ）。この高レベルの発現は、ＮＭＲ構造決定のための１５Ｎおよび１３Ｃで二重に標識することができる合理的な量のＭａｚＦを得るのに重要である。第２に、変異ＭａｚＦの低ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性は、１５Ｎ、１３Ｃ標識ＭａｚＦサンプルの添加によって評価することができるＭａｚＦ二量体上のＲＮＡ相互作用部位の決定に重要である。第３に、変異ＭａｚＦがｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を保持しているので、変異ＭａｚＦの構造は野生型ＭａｚＦ二量体の三次元構造と類似している可能性が高く、ＲＮＡと複合体化したその構造はＭａｚＦｍＲＮＡインターフェラーゼ機能についての分子機構に関する洞察が得られると予想される。
産物がＨｉｓ−タグおよびトロンビン切断部位を含むＮ末端２０残基伸長物を含むように、ｐＥＴ２８ａを使用して変異ＭａｚＦを発現させる（図３９Ａ）。図３９Ｂに示すように、Ｎ末端伸長物を融合タンパク質から切断することができる。図３９Ａ中の矢印は、トロンビン切断部位を示す。全長ＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ）融合タンパク質を切断するために、０．０４単位のトロンビンを１０μｇのＮｉ−ＮＴＡ精製（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ）に添加し、４℃で８時間インキュベートする。切断したＮ末端フラグメントを、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して除去した。図３９は、切断されたＭａｚＦ融合タンパク質の首尾の良い切断および単離を示す（レーン１、精製（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ）；レーン２、トロンビン切断後の（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ））。Ｎ末端伸長物除去後の ヘテロ核単量子干渉（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＱＣ）スペクトルにより、タンパク質が室温で１週間にわたって安定であることが明らかである。
さらに、Ａｒｇ２９がＡｌａに置換されたＭａｚＦ変異体を作製した。この（Ｒ２９Ａ）変異体は、野生型ＭａｚＦよりも毒性が低いので過剰発現が可能であることも見出された。精製１５Ｎ標識ＭａｚＦ（Ｒ２９Ａ）は、例えば、１０ｍｇ／Ｌのレベルで産生された。この変異体から優れたＨＳＱＣスペクトルも得られた。
（実施例Ｘ）
病原性細菌由来のＭａｚＦホモログの同定および特徴づけ。結核菌由来のＭａｚＦホモログの同定および特徴づけ：結核（ＴＢ）は、毎年２００万人が死亡している慢性感染症である。最も古いヒト疾患の１つと考えられており、結核菌に起因する。本発明者らは、大腸菌ＭａｚＦと相同性が高いタンパク質をコードする結核菌染色体上の遺伝子（ｒｖ２８０１ｃ）を同定した。詳細には、本発明者らは、ｒｖ２８０１ｃ遺伝子をクローン化し、これが大腸菌ＭａｚＦと４０％同一である１１８個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする。図４１Ａを参照のこと。この結核菌ＭａｚＦ遺伝子（本明細書中でＭａｚＦ−ｍｔ１と命名する）をｐＢＡＤにクローン化し、アラビノース誘導に応答したｐＢＡＤベクターからのＭａｚＦ−ｍｔ１の発現は、有毒大腸菌である。注目すべきことは、細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、６０分のＭａｚＦ−ｍｔ１誘導後に約１／１０，０００に減少する。ＭａｚＦ−ｍｔ１をｐＥＴ２８ａにクローン化し、（Ｈｉｓ）６タグ化ＭａｚＦ−ｍｔ１が首尾よく発現し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムによって精製した。
図４０に示すように、ＭａｚＦ−ｍｔ１は、ＵＡＣ配列でのＲＮＡ切断に対する特異性を示し、この特異性はＰｅｍＫと類似している。したがって、ＭａｚＦ−ｍｔ１は、タンパク質のｍＲＮＡインターフェラーゼファミリーの真のメンバーである。簡単に述べれば、上記のように、Ｔ７ＲＮＡによってｅｒａｍＲＮＡを合成し、切断反応を行った。同一のプライマーを使用して、プライマー伸長物およびＤＮＡラダーが得られる。ＭａｚＦ−ｍｔ１切断部位を矢印で示す。
ＭａｚＦ−ｍｔ１遺伝子に加えて、本発明者らは、ゲノム名がＲｖ０４５６Ａ、Ｒｖｌ９９１Ｃ、Ｒｖ０６５９Ｃ、およびＲｖ１９４２Ｃである結核菌によってコードされる４つのさらなるＭａｚＦホモログも同定した。図４１Ｂを参照のこと。これらの遺伝子のＭａｚＦとの配列アラインメントによって示すように、これらの各配列が大腸菌ＭａｚＦと相同であるので、結核菌ＭａｚＦホモログとして同定した。Ｒｖｌ９９１ｃ、Ｒｖ０４５６ａ、Ｒｖ０６５９ｃ、およびＲｖ１９４２ｃタンパク質によってコードされたＭａｚＦホモログを、それぞれＭａｚＦ−ｍｔ２、−ｍｔ３、− ｍｔ４、および−ｍｔ５と命名する。ＭａｚＦ−ｍｔｌ、−ｍｔ２、−ｍｔ３、−ｍｔ４、および−ｍｔ５の核酸配列およびアミノ酸配列を、図３４Ａ〜Ｅおよび４４Ａ〜Ｅに示す。
ＭａｚＦ−ｍｔ２、３、４、および５をコードする遺伝子をｐＢＡＤベクターにクローン化し、大腸菌細胞成長に対するその効果を、上記のＭａｚＦ−ｍｔ１について記載のようにアラビノースの存在下でその発現の誘導に関して試験した。結核菌ＭａｚＦホモログの誘導後のインビボｍＲＮＡ切断を、ノーザンブロットおよびプライマー伸長分析を使用して上記で詳述のように評価する。結核菌ＭａｚＦホモログの存在下でのインビトロおよびインビボタンパク質合成も試験した。
５つの各結核菌ＭａｚＦ遺伝子も、異なる成長条件下でのこの細菌における毒作用を試験するためにマイコバクテリウム・スメグマチス（マイコバクテリウム属の非病原性の急速に成長する種のモデル）で発現できるようにマイコバクテリア発現ベクターｐＭＩＰ１２（Ｐｉｃａｒｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ２２９，２７７−２８１）にクローン化する。どのようにしてＭａｚＦ−ｍｔ遺伝子結核菌に調節されているのかを解明することは特に興味深い。結核の発症は、生物の非成長状態の永続部位でもあり、酸素および窒素の不足を引き起こす肺肉芽腫の形成に依存する。この潜伏状態の細菌の生理学の理解は、この壊滅的疾患の診断および治療の改良で重要である。どのようにしてＭａｚＦ−ｍｔ遺伝子がこのような状態に応答して調節されるのかを判断するために、結核菌遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析を異なる成長条件下で行う。
過剰な細菌毒素−抗毒素対により、これらが細胞生理学で重要な役割を果たすことが示唆される。これらの分子をコードする遺伝子の発現を誘導するインビトロ条件を試験するために、種々の成長条件を探索した。多くの研究により、ｍａｚＦの１つの誘導条件がｐｐＧｐｐｐおよびストリンジェントな応答に依存することが示唆された。例えば、最も初期の所見の１つは、ｐｐＧｐｐｐレベルを人為的に増加させた後に変異ｍａｚＥＦｎｕｌｌ大腸菌が死滅しないことであった（Ａｉｚｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ｓｕｐｒａ）。ｐｐＧｐｐ合成酵素をコードする結核菌ｒｅｌＡ遺伝子をクローン化し、特徴づけ、インビトロでの長期生存で役割を果たすことが示された（Ｐｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１８２，４８８９−４８９８）。これらの研究者は、以下に列挙した全条件におけるｐｐＧｐｐ（ｐ）レベルを示していた。種々の成長条件に対するＭａｚＦホモログの転写応答を調査するためのこれらの所見を拡大するために、以下に列挙した条件組に供した毒性結核菌（Ｈ３７Ｒｖ株）からＲＮＡを調製し、定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、ＭａｚＦホモログの転写応答を評価する。
（成長条件）
静止期：Ｈ３７Ｒｖ細胞を、通常のマイコバクテリウム培地（０．２％デキストロース、０．２％グリセロール、０．５％ＢＳＡ画分Ｖ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を補足したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９）で成長させる。ＯＤ６００が到達した後（結核菌の倍加時間は約２４時間である）、静止期が３日間続き、その後に細胞から総ＲＮＡを調製する。この実験のコントロールは、対数増殖期中期の細胞由来のＲＮＡである。
アジド：対数増殖期中期のＨ３７Ｒｖ細胞を２つの培養に分け、そのうちの１つを５ｍＭアジ化ナトリウムで２時間処理する。
炭素枯渇：対数増殖期の初期から中期のＨ３７Ｒｖ細胞を洗浄し、炭素源を含まない７Ｈ９培地中に２４時間再懸濁する。
アミノ酸ダウンシフト：対数増殖期中期のＨ３７Ｒｖ細胞を、２０種のアミノ酸を補足した７Ｈ９培地中で成長させる。培養物を無アミノ酸培地で強く洗浄し、２つの培養物および新鮮な培地に分けた（一方はアミノ酸を含み、他方はアミノ酸なしで２４時間）。
アミノ酸枯渇：セリンヒドロキシメートで処理した大腸菌細胞を、アミノ酸Ｌ−セリン枯渇を行い、ｍａｚＥＦ遺伝子座の発現を誘導することが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ）。結核菌はセリンヒドロキシメートで処理した場合にｐｐＧｐｐ（ｐ）の増加は認められず、この種がこのアミノ酸アナログの毒作用に感受性を示し得ないことが示唆される（Ｐｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）。特徴づけられた毒作用を有するアミノ酸を、ＭａｚＦ−ｍｔホモログを誘導する能力について試験する。
抗生物質処理：結核菌におけるタンパク質合成（ストレプトマイシン）およびＲＮＡ転写（リファンピシン）に影響を与えることが公知の抗生物質を、Ｈ３７ＲｖにおけるＭａｚＦホモログを誘導する能力について試験する。
結核菌は、世界人口の約１／３で潜伏期にあり、おそらく栄養素や酸素と接触せずに肉芽腫性病変内に密封されている（Ｆｌｙｎｎ ａｎｄ Ｃｈａｎ，２００１，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９，９３−１２９）。宿主の免疫系が幾らか低下した場合に（例えば、ＨＩＶ状態、栄養失調など）疾患が活性化される。気掛かりなのは、世界のＨＩＶ支配地域での潜伏症例数の増加により多剤耐性も示し、それによって治療が困難または不可能になることである。したがって、直接細菌成長制御のこれらの内因性機構の抑制機構の理解は、この壊滅的な疾患のための新規の治療法の開発において非常に期待されている。したがって、潜伏期および活動期／再発期における内因性ＭａｚＦ−ｍｔ遺伝子の役割の決定は、別の治療薬のデザインおよび／または同定に有用な洞察が得られる。
本発明者らは、ＭａｚＦホモログが多数の原核生物（黄色ブドウ球菌および炭疽菌などの他の病原体が含まれる）に存在することを明らかにするために、ＢＬＡＳＴ検索も使用した。図４１を参照のこと。詳細には、本発明者らは、黄色ブドウ球菌のＭａｚＦホモログ（ＭａｚＦ−ｓａ１）としてＭＶ１９９３を同定した。図４１Ｂを参照のこと。黄色ブドウ球菌は、病院での院内感染を引き起こす最も一般的なグラム陽性病原体であるグラム陽性細菌である。大腸菌ＭａｚＦおよびＭａｚＦ−ｓａ１の同一性は２５％であり、類似性は４４％である。
さらに、ＭａｚＦホモログは、炭疽菌および枯草菌でも同定されている。図４１Ｂを参照のこと。大腸菌ＭａｚＦおよび枯草菌におけるそのホモログ（ＭａｚＦ−ｂｓｌ）の同一性は３２％であり、類似性は４８％である。大腸菌ＭａｚＦおよび炭疽菌におけるそのホモログ（ＭａｚＦ−ｂａｌ）の同一性は３２％であり、類似性は４８％である。炭疽菌および枯草菌は共にグラム陽性細菌である。ＭａｚＦ−ｂｓｌとＭａｚＦ−ｂａｌとの間で７つのアミノ酸が置換されている。アミノ酸の配列および位置の相違を図４１Ｂに示し、ＭａｚＦ−ｂｓ１遺伝子中に存在する残基の一文字表記を最初に示し、その次に位置を数字で示し、その次にＭａｚＦ−ｂａｌ中に存在する残基の一文字表記を示すことによって詳細に示す（Ａ４２Ｖ、Ｒ６６Ｋ、Ｄ９７Ｅ、Ｅ９８Ｖ、Ｄ１０１Ｉ、Ｋ１０２Ｒ 、Ａ１１２Ｇ）。黄色ブドウ球菌、枯草菌、炭疽菌、および大腸菌のＣｈｐＢＫにおけるＭａｚＦ（Ｐｅｍ様）ホモログの核酸配列およびアミノ酸配列を、図４５Ａ〜Ｄおよび４６Ａ〜Ｄに示す。
（実施例ＸＩ）
（大腸菌におけるＳＰＰ系の至適化）
実験パラメータ、種々の成長条件の変更によって、本発明の大腸菌ＳＰＰ系の異なるタンパク質発現を至適化することができる。当業者は、これに関する達成すべき目的が以下に関することを認識している：（ａ）ＭａｚＦ誘導後の細胞のタンパク質合成能力の長期維持；（ｂ）バックグラウンド細胞タンパク質合成の減少または消失；（ｃ）所望のタンパク質の発現レベルの増加。本発明のＳＰＰ系がＭａｚＦ以外のｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を含み得ることも認識している。産物の発現および／または安定性を補助することができる因子の同時発現も、最適なポリペプチドの改良または至適な発現レベルを達成するためにＳＰＰ系の状況で考慮することができる。
本発明者らは、目的のタンパク質の産生を至適化するためにＭａｚＦ誘導後の多数の培養条件を変えた。ヒトエオタキシン遺伝子の発現を至適にするようにこれらの実験をデザインしたが、この原理は他のタンパク質発現に十分に等しく適用される。最初に、大腸菌の好ましいコドン（但し、遺伝子中の全てのＡＣＡ配列を排除する）を使用してエオタキシン遺伝子を合成した。冷ショックまたは１５℃への温度のダウンシフトによる誘導後にエオタキシンが発現できるように、合成遺伝子をｐＣｏｌｄＩベクターにクローン化した。下記のように、このエオタキシン系を使用して、ＭａｚＦの誘導後にエオタキシンの合成が延長されるように条件を変更する。
本発明者らは、３７℃でのＭａｚＦ誘導およびその後の１５℃でのエオタキシン誘導によってエオタキシン産生は有意に影響をうけると判断した。詳細には、１５℃でのＭａｚＦ誘導と３７℃でのＭａｚＦ誘導との比較にすると、一般的な細胞タンパク質合成によってより高い温度でのＭａｚＦ誘導がバックグラウンドを実質的に減少させることが明らかとなった。この所見は、細胞タンパク質発現に対応する検出可能なタンパク質バンドのほとんどの消滅によって証明された。しかし、これらの実験条件下で、エオタキシン合成も有意に減少する。より高い温度では、例えば、より高い温度でのＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性に対するリボゾーム／ｔＲＮＡの感受性の増加；および／または３７℃でのタンパク質合成、ヌクレオチドおよびアミノ酸合成、ならびにエネルギー生産に必要な他の細胞成分の安定性の減少によってＭａｚＦが細胞を損傷し得る。これらの要因はＭａｚＦ誘導後に細胞内で得ることができないので、その喪失または減少によりエオタキシン産生能力が減少する。
タンパク質発現を最適にするために、多数の実験パラメーター（下記のものが含まれる）を変更することができる。以下の条件はＭａｚＦおよびエオタキシンに関して記載しているが、ｍＲＮＡインターフェラーゼおよび所望のポリペプチドの他の組み合わせに適用可能であると理解すべきである。ｐＡＣＹＣｍａｚＦおよびｐＣｏｌｄ（ＳＰ）エオタキシンの両方保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＭ９最小培地（それぞれ１５ｍｌ）にて３７℃で対数増殖期中期（ＯＤ６００＝０．５〜０．８）まで成長させる。次いで、以下の５つの異なる温度でＭａｚＦ誘導を行う：３７、３０、２５、２０、および１５℃。これらの異なる温度での１０分間のプレインキュベーション後、ＭａｚＦを誘導するために１ｍＭ ＩＰＴＧを５、１０、および１５分間添加した。次いで、培養物をエオタキシン誘導のために１５℃に維持する。冷ショックから０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、７２、および９６時間後、細胞を３５Ｓ−メチオニンで１５分間標識する。総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、バックグラウンド細胞タンパク質合成、エオタキシン産生率、およびエオタキシン産生期間に関する好ましいＳＰＰ系の条件が明らかとなる。他のポリペプチドについてのこの判断および類似の評価のために、各測定点で産生されたエオタキシンまたは他のポリペプチドの実際の量を、クーマシーブリリアントブルーによって評価する。
細胞内プロテアーゼ（ＬｏｎおよびＣｌｐＰ）の活性はまた、タンパク質の蓄積および安定性に寄与し得る。例えば、ｃｌｐＰおよびｌｏｎの変異（単一または二重変異）により大腸菌株における細胞タンパク質の分解が有意に減少することが示された（Ｋａｎｄｒｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４，４９７８−４９８１）。これらの所見と一致して、Ｐ１形質導入によるＢＬ２１（ＤＥ３）細胞へのこれらの変異の形質導入によるこれらの変異（ｌｏｎ、ｃｌｐＰ、およびｌｏｎ−ｃｌｐＰ）を有する株の構築によってＳＰＰ系を改良することができる。したがって、１つまたは複数のこれらのプロテアーゼ遺伝子が欠失されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のポリペプチド蓄積試験により、ＳＰＰ系におけるエオタキシン誘導から３〜４日後にタンパク質収率を改善することができる。この様式で、最も高いエオタキシン産生を達成しながら最も低い細胞タンパク質合成のバックグラウンドを達成するための大腸菌ＳＰＰ系についての特定の条件を確立することができる。さらに、上記のように、このような実験アプローチは、異なるｍＲＮＡインターフェラーゼおよびポリペプチドを使用する他のＳＰＰ系に等しく十分に適用される。
バックグラウンド細胞タンパク質合成レベル減少の別のストラテジーは、ＭａｚＦ産生を増加させることである。ＭａｚＦ転写物を分解させることができるｍａｚＦ遺伝子中のＡＣＡ配列の消失によってこれを達成することができる。驚いたことに、１１１残基のタンパク質をコードするｍａｚＦＯＲＦ中に全部で９つのＡＣＡ配列が存在する。このＡＣＡ配列の頻度は、通常、偶然に基づいた予想される頻度より高い。これらのＡＣＡ配列は
ＭａｚＦで役割を果たすことができ、それによってＭａｚＦはこれらのＡＣＡ部位のｍＲＮＡ自体を切断し、それによってＭａｚＦタンパク質産生が有意に減少する。これらの検討材料に基づいて、ＭａｚＦＯＲＦ中のいくつかまたは全てのＡＣＡ配列の除去が想定される。図４２を参照のこと。注目すべきことは、提案した塩基の変化ではＭａｚＦのアミノ酸配列は変化しない。最初に、ＭａｚＦのＮ末端側の最初の６残基をＰＣＲベースのアプローチを使用して変更し、得られた遺伝子をｍａｚＦａと命名する。独立して、Ｃ末端側の３つのＡＣＡ配列が変化し、それに伴ってＬｅｕ９９をコードするコドンがＵＵＡからＣＵＧに変化して、大腸菌におけるロイシンのより好ましいコドンになる。得られた遺伝子をｍａｚＦｂと命名する。ｍａｚＦａ変異とｍａｚＦｂ変異との組み合わせによは、全てのＡＣＡ配列が除去されたｍａｚＦａ，ｂを作製するのに役立つ。
野生型ｍａｚＦ、ｍａｚＦａ（−６ＡＣＡ）、ｍａｚＦｂ（−３ＡＣＡ）、およびｍａｚＦａｂ（−９ＡＣＡ）を使用して、ＭａｚＦからのＡＣＡ除去の効果をＳＰＰ系で決定することができる。実験的に、ｐＡＣＹＣｍａｚＦ中の野生型ｍａｚＦ遺伝子をｍａｚＦａ、ｍａｚＦｂ、またはｍａｚＦａｂと置換する。これら４つのプラスミドを使用して、どのようにしてｍａｚＦからのＡＣＡ配列の除去がどれぐらい有効にバックグラウンドタンパク質合成を減少させるのかを試験することが可能である。
ＳＰＰ系を使用してより高いタンパク質収率を達成するために、Ｍ９培地よりもむしろＬＢなどの富化培地の使用が好ましい。したがって、ＬＢ培地での成長のための条件を至適化するために実験パラメータを変化させる。上記のように、ＬＢ培地での培養のための種々の成長条件を至適化することができる。このような条件には、ＭａｚＦ誘導のための至適温度、ＭａｚＦ誘導のための至適時間、エオタキシン産生のための至適温度、およびエオタキシン産生を最大にするための至適インキュベーション時間が含まれるが、これらに限定されない。これらの実験をモデル系としてエオタキシン産生を達成する記載しているが、異なるタンパク質の最も高い収率のために至適条件を変更することができる。したがって、各標的タンパク質のために、至適発現レベルを達成するために実験を少し変更する必要があるかもしれない。Ｍ９およびＬＢ培地のために上記のように至適化したＳＰＰ系および発現と組み合わせて当業者に公知の他の成長培地を使用することもできる。
上記のように、本発明者らは、ＵＡＣ／Ａ／Ｕ配列でｍＲＮＡを切断するプラスミドＲ１００由来のＰｅｍＫと呼ばれる別のｍＲＮＡを同定した。実施例４を参照のこと。多数の他のｍＲＮＡインターフェラーゼが同定されており、大腸菌由来のＣｈｐＢＫ、結核菌由来の５つの異なるｍＲＮＡインターフェラーゼ、および炭疽菌由来の１つが含まれる。上記列挙の全てのｍＲＮＡインターフェラーゼは、ＳＰＰ系を改良するために有利に使用することができる潜在的な候補である。そのＲＮＡ切断特異性の特徴づけの際、ＳＰＰ系でのその有効性を決定し、ＭａｚＦの有効性と比較する。これらのｍＲＮＡインターフェラーゼが異なるＲＮＡ切断特異性を有すると予想されるので、これらは、バックグラウンド細胞タンパク質合成の減少により有効である可能性があり、ＭａｚＦよりも細胞損傷が低い可能性がある。これらのｍＲＮＡインターフェラーゼは、大腸菌におけるＳＰＰ系開発だけでなく、他の生物（酵母が含まれる）でのＳＰＰ系の開発にも有用なツールである。
本明細書中に記載の大腸菌ＳＰＰ系は、低温でタンパク質産生を誘導するｐＣｏｌｄＩベクターを使用する。より低い温度でタンパク質がより効率的に頻繁に折り畳まれて安定であるので、低温でのタンパク質誘導は多くのタンパク質に有利である。それにもかかわらず、分子シャペロンの同時発現は、ＳＰＰ系で適切に折り畳まれたタンパク質の収率をさらに改良することができる。この目的のために、誘発因子（ｔｒｉｇｇｅｒ ｆａｃｔｏｒ）（Ｋａｎｄｒｏｒ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，１９９７，ｓｕｐｒａ）として公知の冷ショック分子シャペロンの遺伝子を、本発明のＳＰＰ系で使用するためにクローン
化した。誘発因子は低温でタンパク質折りたたみを補助すると考えられるので、所望のタンパク質発現に対する誘発因子の同時発現効果を使用して、ＳＰＰ系を有利にすることができる。タンパク質の収率および発現したタンパク質の可溶性に対する効果を試験するために誘発因子の遺伝子ならびにＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ（熱ショック分子シャペロン）もｐＣｏｌｄＩベクターにクローン化する。
本発明の一定の好ましい実施形態を上に説明および具体的に例示しているが、本発明をこのような実施形態に制限することを意図しない。以下の特許請求の範囲に記載のように、本発明の範囲および精神を逸脱することなく本発明の種々の修正形態を得ることができる。
図１Ａおよび１Ｂは、異なる固体培地上での細胞の増殖およびＲＮＡインターフェラーゼのＭａｚＦファミリーの異なるメンバーの配列アラインメントを示す。図１Ａは、ｐＢＡＤ−ＭａｚＦ、ｐＢＡＤ−ＭａｚＦ Ｒ２９Ｓ、またはｐＢＡＤ−ＭａｚＦ Ｒ８６Ｇプラスミドでそれぞれ形質転換した大腸菌ＢＷ２５１１３（ΔａｒａＢＡＤ）細胞の成長特性を示す。 図１Ａおよび１Ｂは、異なる固体培地上での細胞の増殖およびＲＮＡインターフェラーゼのＭａｚＦファミリーの異なるメンバーの配列アラインメントを示す。図１Ｂは、大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ２８９３３６．１）のＭａｚＦとバチルス・ハロデュランス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２４４５８８．１）、表皮ブドウ球菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ２３８０９．１）、黄色ブドウ球菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿３７２５９２．１）、枯草菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１ＮＥ８＿Ａ）、髄膜炎菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２６６０４０．１）、モルガネラ・モルガニイ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ８２５１６．１）、および結核菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２１７３１７．１）のｍａｚＦとの配列アラインメントを示す。 図２Ａ〜Ｅは、トルエン処理大腸菌細胞における３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込み（図２Ａ）；［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰ組み込み（図２Ｂ）；［α−３２Ｐ］ＵＴＰ組み込み（図２Ｃ）に対するＭａｚＦの効果；およびインビボでの大腸菌細胞への３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込みに対するＭａｚＦの効果（図２Ｄ）；ＭａｚＦ誘導後のインビボタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す線グラフ（図２Ｅ）である。 図２Ａ〜Ｅは、トルエン処理大腸菌細胞における３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込み（図２Ａ）；［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰ組み込み（図２Ｂ）；［α−３２Ｐ］ＵＴＰ組み込み（図２Ｃ）に対するＭａｚＦの効果；およびインビボでの大腸菌細胞への３５Ｓ−Ｍｅｔ組み込みに対するＭａｚＦの効果（図２Ｄ）；ＭａｚＦ誘導後のインビボタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す線グラフ（図２Ｅ）である。 図３Ａ〜Ｃは、ポリソームプロフィールに対するＭａｚＦの効果を示すポリソームプロフィールのデンシトメトリー分析を示す軌跡（図３Ａ）、無原核生物（図３Ｂ）および無真核生物（図３Ｃ）細胞タンパク質合成に対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の効果を証明するタンパク質ゲルをを示す。 図３Ａ〜Ｃは、ポリソームプロフィールに対するＭａｚＦの効果を示すポリソームプロフィールのデンシトメトリー分析を示す軌跡（図３Ａ）、無原核生物（図３Ｂ）および無真核生物（図３Ｃ）細胞タンパク質合成に対するＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６の効果を証明するタンパク質ゲルをを示す。 図４Ａ〜Ｄは、ｍＲＮＡ合成に対するＭａｚＦの効果を示す。図４Ａは、ＭａｚＦの存在下でのｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティング（ｔｏｅｐｒｉｎｔｉｎｇ）を示す。図４Ｂは、フェノール抽出後のｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティングを示す。図４Ｃは、ｍａｚＧｍＲＮＡのＭａｚＦ切断におけるＭａｚＥの効果を示す。図４Ｄは、アラビノース添加後の種々の測定点（表示）でｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞から抽出し、放射性標識ｏｍｐＡおよびｌｐｐＯＲＦ ＤＮＡで探索した総細胞ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。 図４Ａ〜Ｄは、ｍＲＮＡ合成に対するＭａｚＦの効果を示す。図４Ａは、ＭａｚＦの存在下でのｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティング（ｔｏｅｐｒｉｎｔｉｎｇ）を示す。図４Ｂは、フェノール抽出後のｍａｚＧｍＲＮＡのトゥープリンティングを示す。図４Ｃは、ｍａｚＧｍＲＮＡのＭａｚＦ切断におけるＭａｚＥの効果を示す。図４Ｄは、アラビノース添加後の種々の測定点（表示）でｐＢＡＤ−ＭａｚＦを含む大腸菌ＢＷ２５１１３細胞から抽出し、放射性標識ｏｍｐＡおよびｌｐｐＯＲＦ ＤＮＡで探索した総細胞ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。 図５ＡおよびＢは、カスガマイシンの非存在下（図５Ａ）および存在下（図５Ｂ）でのポリソームプロフィールのデンシトメトリー分析を示す軌跡を示す。７０、５０、および３０Ｓリボゾームの位置を示す。 図６は、リボゾームによるｍａｚＧｍＲＮＡのＭａｚＦ切断阻害を示すトゥープリンティング分析を示す。 図７は、ＭａｚＦ機能に対するｍａｚＧｍＲＮＡのシャイン−ダルカルノ配列のＧＧＡＧからＵＵＵＧへの変異の効果を例示するトゥープリンティング分析を示す。 図８は、ＭａｚＦ機能に対するｍａｚＧｍＲＮＡの阻害コドンでの変異の効果を示すトゥープリンティング分析を示す。 図９は、ＭａｚＦ機能に対するＵＡＣＡＵ（Ｕ１Ａ２Ｃ３Ａ４Ｕ５）切断での変異の効果を示すトゥープリンティング分析を示す。 図１０は、１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの切断に対するＭａｚＦおよびＭａｚＥの効果を示すアクリルアミドゲルを示す。 図１１は、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびクーマシーブリリアントブルーでの染色による視覚化による精製ＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体、ＭａｚＦ、および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥタンパク質の分析を示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥとＭａｚＦとの間の化学量論的複合体を証明する未変性ポリアクリルアミドゲルを示す。 図１３は、ＭａｚＦおよびＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体の決定された分子量を示すタンパク質分子量の検量線の線グラフを示す。 図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥおよび／またはＭａｚＦのｍａｚＥＦプロモーターＤＮＡへの結合を示すＥＭＳＡゲルを示す。 ＭａｚＥホモログのアミノ酸配列のアラインメントを示す。８種のＭａｚＥファミリータンパク質の配列アラインメントを示す。 図１６Ａおよび１６Ｂは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用を示すＥＭＳＡを示す。図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、ＭａｚＥのＮ末端ドメインは、それぞれＭａｚＥ−ＭａｚＦ（Ｈｉｓ）６複合体および（Ｈｉｓ）６ＭａｚＥタンパク質のＤＮＡ結合を媒介する。 ＭａｚＥおよびその短縮物ならびにＭａｚＦとＭａｚＥまたはその短縮物／フラグメントとの間の相互作用を示す酵母２ハイブリッドアッセイの結果を示す。 図１８Ａおよび１８Ｂは、それぞれタンパク質間の相互作用を示す未変性ポリアクリルアミドゲルおよびタンパク質−ＤＮＡ相互作用を示すＥＭＳＡゲルを示す。 図１９は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ複合体のＸ線構造を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、大腸菌ＭａｚＦの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、大腸菌ＭａｚＥの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図２２Ａ〜２２Ｈは、大腸菌ＭａｚＦのオルソログの核酸配列を示す。 図２２Ａ〜２２Ｈは、大腸菌ＭａｚＦのオルソログの核酸配列を示す。 図２３Ａ〜２３Ｈは、大腸菌ＭａｚＦのオルソログのアミノ酸配列を示す。 図２３Ａ〜２３Ｈは、大腸菌ＭａｚＦのオルソログのアミノ酸配列を示す。 図２４Ａ〜２４Ｇは、大腸菌ＭａｚＥのオルソログの核酸配列を示す。 図２５Ａ〜２５Ｇは、大腸菌ＭａｚＥのオルソログのアミノ酸配列を示す。 図２６Ａ〜Ｃは、ＤＮＡおよびタンパク質合成に対するＰｅｍＫの効果を示す。図２６Ａおよび２６Ｂはインビボでの（Ａ）ＤＮＡ合成および（Ｂ）タンパク質合成に対するＰｅｍＫの効果を示す線グラフである。図２６Ｃは、ＰｅｍＫ誘導後の総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ合成を示す。 図２７Ａ〜Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質のオートラジオグラムを示す。結果は、無細胞タンパク質合成に対するＰｅｍＫおよびＰｅｍＩの効果を証明する。 図２８Ａ〜Ｅは、ＰｅｍＫ媒介エンドリボヌクレアーゼ活性を例示するポリアクリルアミドゲル（Ａ）の写真またはポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム（Ｂ〜Ｅ）を示す。 図２９Ａ〜Ｂは、一本鎖ＲＮＡのＰｅｍＫ媒介エンドリボヌクレアーゼ活性の比活性を示すポリアクリルアミドゲル（Ａ）の写真またはポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム（Ｂ）を示す。 図３０Ａ〜Ｄは、インビボでの種々のｍＲＮＡにおけるＰｅｍＫ媒介エンドリボヌクレアーゼ活性を示すノーザンブロット分析（Ａ）またはポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム（Ｂ〜Ｄ）を示す。 図３１Ａおよび３１Ｂは、大腸菌ＰｅｍＫの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図３２Ａおよび３２Ｂは、大腸菌ＰｅｍＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。 図３３は、ＰｅｍＫ、ＣｈｐＢＫ、およびＭａｚＦのポリペプチドの配列アラインメントを示す。 図３４は、ＰｅｍＫ、ＣｈｐＢＫ、ＭａｚＦ、ならびにマイコバクテリウム・セラタム、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０、およびシジェラ・フレキシネリ２ａの３０１株由来の３つのＰｅｍＫ様タンパク質の配列アラインメントを示す。 図３５は、成熟ヒトエオタキシンの核酸配列およびアミノ酸配列（それぞれ配列番号６７および６８）を示す。 図３６は、ｐＣｏｌｄＩベクターを示す略図である。 図３７は、バックグラウンドタンパク質合成の非存在下での成熟ヒトエオタキシン産生を示すポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。 図３８Ａ〜Ｆは、ｍａｚＦ毒素を発現するように誘導したヒト細胞（Ｄ〜Ｆ）および非誘導ヒト細胞（Ａ〜Ｃ）の形態学的性質を示す顕微鏡写真である。 図３９Ａ〜Ｂは、（Ａ）ｐＥＴ２８ａで発現されたＭａｚＦ（Ｅ２４Ａ）変異体のＮ末端伸長のアミノ酸配列および（Ｂ）非切断ＭａＦ変異体融合タンパク質（レーン１）およびトロンビン切断ＭａｚＦ変異体融合タンパク質（レーン２）に対応するバンドを示すポリアクリルアミドゲルの写真を示す。 図４０は、ＭａｚＦ−ｍｔ１ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性のプライマー伸長分析を示す。 図４１Ａ〜Ｂは、（Ａ）結核菌における大腸菌ＭａｚＦおよびそのホモログならびに（Ｂ）枯草菌、炭疽菌、および黄色ブドウ球菌における大腸菌ＭａｚＦおよびそのホモログの配列アラインメントを示す。 図４２は、ｍａｚＦ読み取り枠（ＯＲＦ）のＲＮＡ配列を示す。全ＡＣＡ配列をグレーで示し、それからコードされたＭａｚＦアミノ酸配列を変化させずにＡＣＡ配列を置換する塩基の変化を、ＲＮＡ配列の上に示す。 図４３Ａ〜Ｅは、結核菌における大腸菌ＭａｚＦホモログの核酸配列を示す。 図４４Ａ〜Ｅは、結核菌における大腸菌ＭａｚＦホモログのアミノ酸配列を示す。 図４５Ａ〜Ｄは、マイコバクテリウム・セラタム、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０、およびシジェラ・フレキシネリ２ａの３０１株由来の３つのＰｅｍＫ様タンパク質ならびにＣｈｐＢＫの核酸配列を示す。 図４６Ａ〜Ｄは、マイコバクテリウム・セラタム、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０、およびシジェラ・フレキシネリ２ａの３０１株由来の３つのＰｅｍＫ様タンパク質ならびにＣｈｐＢＫのアミノ酸配列を示す。

Claims (11)

  1. 細胞においてポリペプチドを作製するインビトロの方法であって、該方法は、
    （ａ）該細胞を該ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、ここで、該ポリペプチドをコードする該核酸の配列が、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異されており、ここで、該変異した核酸によってコードされる該ポリペプチドのアミノ酸配列が該変異によって変化されない、工程；
    （ｂ）該細胞をｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸でトランスフェクトする工程であって、ここで、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を認識する、工程；および
    （ｃ）該細胞において工程（ａ）および工程（ｂ）の核酸を発現する工程、
    を包含し、ここで、該細胞における工程（ａ）および工程（ｂ）の核酸の発現が、該細胞において該ポリペプチドを産生する手段を提供し、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がアデニン−シトシン−アデニン（ＡＣＡ）配列であり、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号２を含むＭａｚＦであるか、あるいは、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がウラシル−アデニン−Ｘ（ＵＡＸ）配列であり（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号４を含むＰｅｍＫである、方法。
  2. 工程（ｂ）の核酸の発現が、ＡＣＡ配列またはＵＡＸ配列を含む核酸によってコードされる細胞ポリペプチドの合成を減少または阻害する、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ａ）および工程（ｂ）が同時に実施される、請求項１に記載の方法。
  4. 工程（ｃ）の前または間に、少なくとも１つの放射性標識同位体を含む培地中で前記細胞をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  5. ポリペプチドを作製するインビトロの方法であって、該方法は、
    （ａ）該ポリペプチドをコードする核酸を提供する工程であって、ここで、該ポリペプチドをコードする該核酸が、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異されており、ここで、該変異した核酸によってコードされる該ポリペプチドのアミノ酸配列が該変異によって変化されない、工程；
    （ｂ）ｍＲＮＡインターフェラーゼ、または該ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸を提供する工程であって、ここで、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を認識する、工程；および
    （ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の核酸を発現する工程、
    を包含し、ここで、工程（ａ）および（ｂ）の該核酸の発現が、該ポリペプチドを産生する手段を提供するか、工程（ｂ）の該ｍＲＮＡインターフェラーゼの存在下での工程（ａ）の核酸の発現が、該ポリペプチドを産生する手段を提供し、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がアデニン−シトシン−アデニン（ＡＣＡ）配列であり、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号２を含むＭａｚＦであるか、あるいは、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がウラシル−アデニン−Ｘ（ＵＡＸ）配列であり（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号４を含むＰｅｍＫである、方法。
  6. 複数のポリリボヌクレオチドを作製するインビトロの方法であって、該方法は、
    （ａ）第１および第２の核酸を提供する工程であって、該第１の核酸の領域が該第２の核酸の領域と相補的であり、該第１の核酸の配列または該第２の核酸の配列の相補領域が、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位と相補的な配列を含まず、該第１の核酸および該第２の核酸が、それぞれその５’末端でリン酸化されている、工程；
    （ｂ）該第１の核酸および該第２の核酸の相補領域を介して、該第１の核酸および該第２の核酸をアニーリングして、一本鎖オーバーハングに隣接する相補領域を含む二本鎖核酸を形成する工程であって、ここで、該一本鎖オーバーハングがそれぞれｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位に相補的な少なくとも１つの配列を含み、かつ該一本鎖オーバーハングが互いに相補的である、工程；
    （ｃ）アニーリングした該第１の核酸および該第２の核酸を、相補的な一本鎖オーバーハングを介してライゲーションして、アニーリングした該第１の核酸および該第２の核酸の、複数の縦列反復を含むコンカテマーを形成する、工程；
    （ｄ）Ｔ７プロモーターおよび該第１の核酸に相補的な領域を含む第１のプライマーならびに該第２の核酸に相補的な第２のプライマーを使用して該コンカテマーを増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程が、Ｔ７プロモーターを含む複数のコンカテマーを産生する、工程；
    （ｅ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、複数の該コンカテマーからＲＮＡ分子を転写する工程であって、ここで、該ＲＮＡ分子はそれぞれｍＲＮＡインターフェラーゼ認識部位に隣接するポリリボヌクレオチド配列の複数の縦列反復を含む、工程；および
    （ｆ）該インターフェラーゼ認識部位で、ＲＮＡを切断することができるｍＲＮＡインターフェラーゼで該ＲＮＡ分子を消化する工程であって、該消化が、複数の該ポリリボヌクレオチドを産生する、工程
    を包含し、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がアデニン−シトシン−アデニン（ＡＣＡ）配列であり、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号２を含むＭａｚＦであるか、あるいは、該ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列がウラシル−アデニン−Ｘ（ＵＡＸ）配列であり（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）、該ｍＲＮＡインターフェラーゼが配列番号４を含むＰｅｍＫである、方法。
  7. 請求項１に記載の方法によって細胞中にポリペプチドを作製するためのキットであって、ｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする核酸を含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼは、配列番号２を含むＭａｚＦまたは配列番号４を含むＰｅｍＫである、キット。
  8. 前記キットは、作製されるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該ポリペプチドをコードする該核酸が、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異されており、ここで、該変異した核酸によってコードされる該ポリペプチドのアミノ酸配列は該変異によって変化されない、請求項７に記載のキット。
  9. 請求項５に記載の方法によってポリペプチドを作製するためのキットであって、ｍＲＮＡインターフェラーゼ、または該ｍＲＮＡをコードする核酸を含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼは、配列番号２を含むＭａｚＦまたは配列番号４を含むＰｅｍＫである、キット。
  10. 前記キットは、作製されるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該ポリペプチドをコードする該核酸が、ｍＲＮＡインターフェラーゼ認識配列を別のトリプレットコドンに置換するように変異されており、ここで、該変異した核酸によってコードされる該ポリペプチドのアミノ酸配列は該変異によって変化されない、請求項９に記載のキット。
  11. 請求項６に記載の方法によって複数のポリリボヌクレオチドを作製するためのキットであって、ｍＲＮＡインターフェラーゼを含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼは、配列番号２を含むＭａｚＦまたは配列番号４を含むＰｅｍＫである、キット。
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